Mengubah komposisi rantai asil sphingolipid mencegah kegagalan hati yang diperantarai lps / gln pada tikus dengan mengganggu internalisasi tnfr1 | kematian sel & penyakit

Mengubah komposisi rantai asil sphingolipid mencegah kegagalan hati yang diperantarai lps / gln pada tikus dengan mengganggu internalisasi tnfr1 | kematian sel & penyakit

Anonim

Subjek

  • Apoptosis
  • Pensinyalan sel
  • Penyakit hati

Abstrak

Keterlibatan ceramide dalam apoptosis yang dimediasi reseptor kematian telah banyak diteliti dengan sebagian besar penelitian berfokus pada peran ceramide yang dihasilkan dari hidrolisis sphingomyelin. Kami sekarang menganalisis efek dari panjang rantai asil ceramide dengan mempelajari tumor necrosis factor α reseptor-1 (TNFR1) -mediasi apoptosis dalam ceramide synthase 2 (CerS2) tikus nol, yang tidak dapat mensintesis ceramide rantai asil sangat lama. Tikus nol CerS2 yang resisten terhadap kegagalan hati fulminan yang dimediasi lipopolysaccharide / galactosamine meskipun sekresi TNF α dari makrofag tidak terpengaruh. Hepatosit yang dikultur juga tidak sensitif terhadap apoptosis yang dimediasi oleh TNF. Selain itu, baik di hati dan di hepatosit, kegiatan caspase tidak meningkat, konsisten dengan penghambatan pensinyalan pro-apoptosis TNFR1. Sebaliknya, aktivasi reseptor Fas mengakibatkan kematian tikus nol CerS2. Aktivasi caspase diblokir karena ketidakmampuan tikus CerS2 null untuk menginternalisasi TNFR1; sedangkan Fc-TNF α diinternalisasi ke daerah perinuklear dalam hepatosit dari tikus tipe liar, tidak ada internalisasi yang terdeteksi pada tikus null CerS2. Hasil kami menunjukkan bahwa mengubah komposisi rantai asil dari sphingolipid menghambat internalisasi TNFR1 dan menghambat pensinyalan hilir pro-apoptosis selektif untuk apoptosis.

Utama

Peran faktor nekrosis tumor α receptor-1 (TNFR1) dalam apoptosis telah banyak dipelajari. 1, 2 keterlibatan TNFR1 menghasilkan rekrutmen protein nekrosis tumor kompleks TNFR1 faktor I α yang terkait reseptor melalui domain kematian (TRADD), faktor nekrosis tumor α protein yang berinteraksi reseptor (RIP1), faktor nekrosis tumor α faktor terkait reseptor 2 ( TRAF2), IAP dan cFLIP, menghasilkan K63-ubiquitination dari RIP1 dan aktivasi jalur survival NF κ B. TNFR1 diinternalisasi, mengarah ke K48-ubiquitination dan degradasi RIP1 dan TRAF2, penghentian sinyal bertahan hidup, 3 dan aktivasi pensinyalan pro-apoptosis TNFR1 dengan perekrutan FADD dan caspase 8 untuk membentuk 'kompleks pemberi sinyal kematian' atau kompleks II pada reseptorosom TNF intraseluler. 4, 5, 6, 7 Terinternalisasi reseptor yang mengandung TNFR1 sekering dengan vesikel trans-Golgi, membentuk organel multivesikular, dengan aktivasi enzim lysosomal, termasuk asam sphingomyelinase (aSMase) dan protease pro-apoptotik, cathepsin D. 4, 7, 8

Ceramide, tulang punggung dari semua sphingolipid kompleks (SL), adalah mediator apoptosis kuat yang mengatur baik pemicu apoptosis intrinsik dan ekstrinsik dan telah terlibat dalam jalur pensinyalan nekrosis faktor tumor α (TNF- α ). 9, 10, 11 Bukti signifikan telah terakumulasi untuk peran sphingomyelinase aSMase dan netral (nSMase) dalam pensinyalan TNFR1. Dengan demikian, penghambatan aktivasi aSMase yang dimediasi TNFR1 melemahkan respon apoptosis, 12 defisiensi aSMase (ASM - / - ) sangat resisten terhadap apoptosis yang dimediasi TNFR1, 13 dan aktivasi TNFR1 menyebabkan akumulasi lama (C16-C20) dan sangat ceramide asil rantai panjang (C22-C24) (VLC) di hepatosit, 14 menunjukkan peran penting untuk domain membran kaya-SM dalam pensinyalan kompleks I TNFR1. 3

Lebih sedikit yang diketahui tentang peran ceramide yang disintesis de novo dalam apoptosis yang dimediasi TNFR1. Baru-baru ini, kami menghasilkan tikus yang tidak mengandung VLC-ceramide dan VLC-sphingolipid (SLs) karena ablasi ceramide synthase 2 (CerS2), 15, 16 enzim yang bertanggung jawab untuk penambahan rantai asil yang sangat panjang ke sphingoid panjang basis rantai. 17, 18 CerS2 null tikus menampilkan peningkatan angka kematian dan proliferasi hepatosit, menghasilkan pembentukan beberapa nodul hati dan karsinoma hepatoseluler. 16 Selain itu, tikus CerS2 null menampilkan stres oksidatif kronis, 19 serta resistensi insulin hati. Selain itu, tikus tersebut menunjukkan perubahan besar dalam sifat biofisik membran. 21

Dalam penelitian saat ini, kami menguji peran VLC-ceramide dalam apoptosis yang dimediasi TNFR1, dan menunjukkan bahwa tikus null CerS2 benar-benar resisten terhadap kegagalan hati fulminan (FHF) karena penghambatan pensinyalan kompleks TNFR1 II. Hasil kami menunjukkan peran penting untuk VLC-SLs hilir ke pensinyalan kompleks I TNFR1 dan upstream ke pensinyalan kompleks TNFR1 II.

Hasil

CerS2 null tikus tahan terhadap FHF

Kami menggunakan model FHF yang melibatkan injeksi lipopolysaccharide (LPS) / D - (+) - galactosamine hydrochloride (GLN). 22 Setelah injeksi dosis tunggal LPS / GLN, 90% tikus tipe liar (WT) mati dalam waktu sekitar 6-8 jam setelah injeksi, tetapi tikus null CerS2 benar-benar resisten (Gambar 1a). Kerusakan parenkim masif yang berhubungan dengan nekrosis jaringan dan perdarahan terlihat pada tikus WT, tetapi sama sekali tidak ada pada tikus nol CerS2 (Gambar 1b), konsisten dengan kurangnya peningkatan enzim hati, AST dan ALT, dalam serum tikus nol CerS2 (Gambar 1c). Resistansi terhadap FHF bukan karena gangguan sekresi TNF α dari makrofag, karena TNF α mencapai tingkat yang sama pada tikus null WT dan CerS2 90 menit setelah injeksi LPS / GLN dan tetap lebih tinggi pada tikus null NS 4 jam setelah (Gambar 1d).

Image

CerS2 null tikus tahan terhadap gagal hati fulminan. ( a ) Kurva survival tikus WT dan CerS2 null setelah injeksi dengan 15 μg / kg LPS dan 800 mg / kg GLN. n = 14 untuk WT, n = 7 untuk tikus nol CerS2. ( B ) pewarnaan H&E 6 jam setelah injeksi LPS / GLN. Skala bar = 100 μ m. ( c ) Tingkat ALT dan AST dalam serum 6 jam setelah injeksi LPS / GLN. n = 3, * P <0, 005; ** P <0, 0005. ( d ) Kadar TNF serum α setelah injeksi LPS / GLN. n = 3, * P <0, 05

Gambar ukuran penuh

Penghambatan aktivasi caspase yang dimediasi TNFR1 pada tikus nol CerS2

Untuk menyelidiki efek TNF α dalam hepatosit dari tikus WT dan CerS2 null, hepatosit dikultur diinkubasi dengan TNF α dan actinomycin D (ActD). 23 Hepatosit WT mati 10-12 jam setelah pengobatan tetapi hepatosit yang diisolasi dari tikus nol CerS2 resisten (Gambar 2a). Setelah mengikat TNF α , TNFR1 melakukan trimerisasi dan mengaktifkan kompleks TNFR1 I, yang kemudian mengaktifkan jalur survival NF κ B. 3, 5 Selanjutnya, internalisasi TNFR1 menghasilkan rekrutmen FADD dan caspase-8 yang menyebabkan aktivasi sinyal apoptosis melalui kompleks II-terikat TNFR1.

Image

Aktivasi pensinyalan kompleks TNFR1 I tetapi tidak pensinyalan kompleks II pada hepatosit yang dikultur dari tikus nol CerS2. Hepatosit hasil kultur dari tikus WT dan CerS2 null diobati dengan TNF α (100 ng / ml) dan ActD (500 ng / ml) untuk waktu yang ditunjukkan. ( a ) Lt- panel tangan menunjukkan gambar fase kontras yang representatif dari hepatosit 12 jam setelah perawatan (skala bar = 100 μ m) dan panel kanan menunjukkan tingkat kematian sel (diukur dengan pelepasan LDH). n = 3, * P <0, 0005. ( B ) Panel tangan menunjukkan fosforilasi IKK α / β dan fosforilasi dan degradasi I κ B α . Berarti ± SEM ditampilkan di panel kanan , n = 3. GAPDH dan β -actin ditampilkan sebagai kontrol pemuatan. ( c ) Pembelahan Pro-caspase 8 menjadi bentuk p18 aktif dan degradasi I κ B α . Hasil dari eksperimen tipikal diulang tiga kali. Spidol Mr ditampilkan di sebelah kiri, dan produk belahan dada ditunjukkan di sebelah kanan. β -Actin ditampilkan sebagai kontrol pemuatan

Gambar ukuran penuh

Hepatosit yang diisolasi dari tikus WT dan CerS2 null diobati dengan TNF α / ActD yang menghasilkan inhibitor κ B kinase (IKK α / β ) fosforilasi 5 menit setelah pengobatan, yang disertai dengan fosforilasi dan degradasi inhibitor κ B α ( I κ) B α ) pada tingkat yang sama baik dalam hepatosit tikus WT dan CerS2 null (Gambar 2b). Meskipun, hepatosit tikus nol CerS2 menunjukkan fosforilasi IKK α / β yang berkepanjangan dan degradasi I κ B α yang lebih lambat, hasil ini menunjukkan bahwa pensinyalan kompleks I TNFR1 diaktifkan dalam tikus null CerS2 dengan tingkat yang sama seperti pada hepatosit WT. Sebaliknya, caspase 8 terpecah aktif terdeteksi pada WT tetapi tidak pada hepatosit tikus nol CerS2 null 8-10 jam setelah pengobatan TNF α / ActD (Gambar 2c), menunjukkan bahwa hepatosit nol CerS2 sangat resisten terhadap TNF α / apoptosis yang dimediasi oleh ActS karena kurangnya aktivasi kompleks TNFR1 II. Selain itu, degradasi I κ B α menunjukkan bahwa tidak ada disfungsi proteasom (Gambar 2c).

Pensinyalan TNFR1 selanjutnya diperiksa pada tikus yang diobati dengan LPS / GLN dengan menganalisis fosforilasi α / β IKK pada homogenat hati. IKK α / β difosforilasi dalam waktu 30-60 menit pada tikus null WT dan CerS2 dan disertai oleh tingkat fosforilasi dan degradasi I κ B α yang sama pada tikus null WT dan CerS2 null (Gambar 3a). Seperti yang diharapkan, kadar I κ B α menurun setelah injeksi LPS / GLN, tetapi secara mengejutkan, meningkat 6 jam setelah injeksi pada tikus null CerS2 (Gambar 3a). Untuk mengevaluasi kemanjuran penghambatan transkripsi, kami mengevaluasi kadar I κ B α mRNA sebelum dan sesudah pengobatan LPS / GLN, dibandingkan dengan pengobatan LPS saja. Tidak ada peningkatan level I κ B α mRNA yang terdeteksi setelah injeksi LPS / GLN dibandingkan dengan tikus WT dan CerS2 null yang diinjeksi hanya dengan LPS (0, 8 ± 0, 045 untuk LPS / GLN dibandingkan 4, 7 ± 0, 17 untuk LPS saja (WT) dan 1, 3 ± 0, 1 dibandingkan 3, 7 ± 0, 5 (CerS2 null), n = 4) menunjukkan bahwa peningkatan level I κ B α pada tikus nol CerS2 mungkin disebabkan oleh peningkatan sel non-parenkim. Hal ini didukung oleh pengamatan pada hepatosit yang dikultur dimana level I κ B α tidak pulih bahkan setelah masa inkubasi yang lama (10 jam) dengan TNF α / ActD (Gambar 2c).

Image

Pensinyalan kompleks TNFR1 I pada tikus nol yang diberi perlakuan LS / GLN. Tikus null WT atau CerS2 disuntikkan dengan 15 μ g / kg LPS dan 800 mg / kg GLN dan berbagai parameter diukur pada waktu yang ditunjukkan. ( a ) Panel tangan menunjukkan IKK fosforilasi α / β dan I B B α fosforilasi dan degradasi. Berarti ± SEM ditampilkan di panel kanan , n = 3, * P <0, 05. GAPDH ditampilkan sebagai kontrol pemuatan. ( B ) Analisis Western blot caspases 8, 9 dan 3 dan produk belahannya 6 jam setelah injeksi LPS / GLN. Spidol Mr ditampilkan di sebelah kiri, dan produk belahan dada ditunjukkan di sebelah kanan. Hasil berasal dari eksperimen khas yang diulang lima kali, yang memberikan hasil serupa. ( c ) Kegiatan caspases 8, 3/7 dan 9. Nilai adalah rata-rata ± SD, n = 5, * P <0, 005; ** P <0, 0005

Gambar ukuran penuh

P18-caspase 8 aktif terdeteksi 6 jam setelah injeksi LPS / GLN pada tikus WT bersama dengan pembelahan caspase 9 dan caspase 3, tetapi hampir tidak terdeteksi dalam CerS2 null mouse liver (Gambar 3b). Demikian juga, aktivitas caspase tidak meningkat pada CerS2 null mouse liver (Gambar 3c). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa pensinyalan TNFR1 kompleks II pro-apoptosis dihambat pada tikus nol CerS2 yang mengakibatkan pencabutan apoptosis pada model FHF ini.

Berbeda dengan ketidakmampuan LPS / GLN untuk menginduksi FHF, injeksi tikus dengan antibodi agonis Fas, Jo-2, menghasilkan tingkat kematian yang serupa pada tikus null WT dan CerS2 null (Gambar 4a), yang dikaitkan dengan parenkim masif kerusakan disertai dengan perdarahan dan nekrosis jaringan (Gambar 4b) dan pembelahan caspase 8 (Gambar 4c). Hasil ini menunjukkan peran spesifik untuk VLC-SL di TNFR1 tetapi tidak dalam pensinyalan reseptor Fas.

Image

CerS2 null tikus tidak dilindungi terhadap hepatitis yang diperantarai Fas. Tikus nol WT dan CerS2 disuntikkan dengan 35 μg / kg antibodi Jo2 untuk waktu yang ditunjukkan. ( a ) Kurva survival tikus WT dan CerS2 null. n = 10 untuk WT dan n = 12 untuk tikus null Cers2. ( B ) pewarnaan H&E 6-8 jam setelah injeksi dengan antibodi Jo2. Skala bar = 100 μ m. ( c ) Pembelahan Pro-caspase 8 ke bentuk aktif p18 6 jam setelah injeksi. Hasil dari eksperimen tipikal diulang empat kali. Spidol Mr ditampilkan di sebelah kiri, dan produk belahan dada ditunjukkan di sebelah kanan. GAPDH ditampilkan sebagai kontrol pemuatan

Gambar ukuran penuh

Kekurangan VLC-SLs menghambat internalisasi TNFR1 pada hepatosit

Hepatosit selanjutnya diinkubasi dengan TNF α terkonjugasi IgG1 Fc manusia. Hepatosit diinkubasi pada suhu 4 ° C dengan Fc-TNF α untuk memungkinkan pengikatan Fc-TNF α ke TNFR1. Pemanasan berikutnya hingga 37 ° C memungkinkan internalisasi TNFR1 yang disinkronkan. Sedangkan tingkat signifikan Fc-TNF α diinternalisasi dalam hepatosit WT, pada dasarnya tidak ada Fc-TNF α diinternalisasi dalam hepatosit dari tikus null CerS2 (Gambar 5a), di mana pelabelan permukaan sel yang berbeda dapat dideteksi selama 30 menit setelah pemanasan hingga 37 ° C. Kurangnya internalisasi Fc-TNF α dikonfirmasi dengan memeriksa kadar RIP1 dan TRAF2, dengan keduanya secara signifikan menurun dalam hepatosit WT pada berbagai waktu setelah inkubasi dengan TNF α , mungkin karena degradasi, tetapi tidak diubah dalam hepatosit dari tikus nol CerS2 null (Gambar 1). 5b dan c). Ini konsisten dengan penelitian yang menunjukkan bahwa penghambatan internalisasi TNFR1 menghambat degradasi RIP1 dan TRAF2. 24 Hasil serupa diperoleh pada tikus yang diobati dengan LPS / GLN di mana pelabelan TNFR1 intraseluler dapat dengan jelas dideteksi dalam WT tetapi tidak dalam hati tikus nol CerS2 yang mana pelabelan diamati pada permukaan sel (Gambar 6a). Hasil yang sama diperoleh setelah tikus disuntik dengan concanavilin A, yang secara langsung mengaktifkan sel T yang menyusup ke hati, dan sebagai hasilnya menyebabkan sekresi sitokin termasuk TNF α dan aktivasi TNFR1 pada hepatosit. TNFR1 diinternalisasi dalam WT tetapi tidak dalam hati tikus CerS2 null (Gambar 6b). Tidak ada perubahan yang diamati pada TNFR1 mRNA (tikus WT, 0, 78 ± 0, 53 unit sewenang-wenang; CerS2 null, 1, 2 ± 0, 4, n = 5) atau kadar protein dalam membran dari WT dan hati tikus nol CerS2 null (Gambar 6c). Mirip dengan hasil dalam hepatosit terisolasi, kadar RIP1 dan TRAF2 berkurang secara signifikan karena aktivasi TNFR1 pada WT tetapi tidak pada CerS2 null mouse liver (Gambar 6d). Level RIP1 dan TRAF2 secara signifikan meningkat pada CerS2 null tikus (dua kali lipat untuk RIP1 dan empat kali lipat untuk TRAF2, Gambar 6d). Hal ini dapat menyebabkan aktivasi berkelanjutan NF κ B pada tikus null CerS2 yang tidak diobati. Oleh karena itu, kami menganalisis level mRNA dari sejumlah gen di hilir ke NF κ B, dan tidak ada satupun yang meningkat (level mRNA dalam unit acak: Bcl XL : 1, 0 ± 0, 53 (WT), 0, 2 ± 0, 02 (CerS2 null); XIAP: 1, 0 ± 0, 2 (WT), 0, 6 ± 0, 1 (CerS2 null); cIAP2: 1 ± 0, 02 (WT), 0, 8 ± 0, 15 (CerS2 null); A20: 1, 0 ± 0, 6 (WT), 1, 2 ± 0, 3 (CerS2 null)). Tingkat cFLIP L menurun setelah pengobatan LPS / GLN di WT tetapi tidak pada tikus null CerS2 (Gambar 6e).

Image

Internalisasi TNF α dilemahkan dalam hepatosit yang dikultur dari tikus nol CerS2. ( a ) Hepatosit yang diisolasi dari tikus WT dan CerS2 null diinkubasi dengan Fc-TNF α selama 10 menit di atas es dan kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 15 dan 30 menit sebelum pemeriksaan dengan mikroskop confocal. Biru menunjukkan DAPI dan merah menunjukkan Fc-TNF α . Hasil berasal dari eksperimen khas yang diulang lima kali, yang memberikan hasil serupa. Skala bar = 20 μ m. ( b ) Analisis Western blot menunjukkan kadar RIP1 dan TRAF2 dalam hepatosit yang dikultur pada berbagai waktu setelah TNF α (100 ng / ml) dan pengobatan aktinomisin D (500 ng / ml). GAPDH ditampilkan sebagai kontrol pemuatan. Hasil dari eksperimen tipikal diulang tiga kali, yang memberikan hasil yang serupa. ( c, d ) Kuantifikasi tingkat RIP1 ( c ) dan TRAF2 ( d ) sebelum ( kolom hitam ) dan 40 menit setelah ( kolom terbuka ) pengobatan TNF α / actinomycin D; data ditampilkan sebagai perubahan lipat tingkat RIP1 dan TRAF dinormalisasi ke GAPDH. n = 3, * P <0, 005

Gambar ukuran penuh

Image

Internalisasi TNFR1 dihambat dalam hati tikus CerS2 null. ( a ) Tikus nol WT dan CerS2 diinjeksi dengan 15 μg / kg LPS dan 800 mg / kg GLN untuk waktu yang ditunjukkan. Setelah isolasi hati, lokalisasi TNFR1 ditentukan dengan mikroskop confocal. Biru menunjukkan DAPI dan merah menunjukkan TNFR1, disorot dalam beberapa kasus oleh panah. Hasil dari eksperimen tipikal diulang tiga kali. Skala bar = 10 μ m. ( B ) Tikus nol WT dan CerS2 disuntikkan dengan 25 mg / kg ConA selama 8 jam dan lokalisasi TNFR1 ditentukan dengan mikroskop confocal. Panah menunjukkan TNFR1 terinternalisasi. Hasil dari eksperimen tipikal diulang tiga kali. Skala bar = 20 μ m. ( c ) Analisis Western blot TNFR1 dalam membran ( mem ) dan fraksi sitosol ( cyt ) dari CerS2 null dan WT liver. Hasil dari eksperimen tipikal diulang lima kali. Na + / K + ATPase digunakan sebagai kontrol pembebanan untuk fraksi membran, * pita tidak spesifik. GAPDH digunakan sebagai kontrol pembebanan untuk fraksi sitoplasma. ( d ) Tingkat RIP1 ( kiri ) dan TRAF2 ( kanan ) 6 jam setelah injeksi LPS / GLN. Panel atas menunjukkan bercak barat tipikal dan kuantifikasi panel bawah untuk RIP1 ( n = 8) dan untuk TRAF2 ( n = 6) dinormalisasi ke GAPDH. * P <0, 05. ( e ) level cFLIP L 6 jam setelah injeksi LPS / GLN. Panel atas menunjukkan bercak western khas dan kuantifikasi panel bawah dinormalisasi ke GAPDH. n = 6, * P <0, 05. Untuk panel d dan e, bilah hitam menunjukkan tikus yang tidak dirawat dan bilah yang dirawat

Gambar ukuran penuh

Akhirnya, kami menganalisis tingkat aktivitas aSMase setelah injeksi LPS / GLN, karena TNFR1 yang terinternalisasi membentuk reseptosom yang menyatu dengan vesikel trans-Golgi, menghasilkan aktivasi aSMase. 7, 25 aktivitas aASase diaktifkan sementara di WT tetapi tidak pada tikus nol CerS2 (Gambar 7), konsisten dengan kurangnya internalisasi TNFR1.

Image

Kurangnya aktivasi ASMase di hati tikus CerS2 null. Tikus WT dan CerS2 null diinjeksi dengan 15 μ g / kg LPS dan 800 mg / kg GLN dan aktivitas aSMase diukur. Nilai adalah rata-rata ± SD n = 3, * P <0, 05

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Temuan utama dari penelitian ini adalah bahwa komposisi rantai asil SLs memiliki peran penting dalam mengatur internalisasi TNFR1 dan selanjutnya memberi sinyal apoptosis pada hepatosit. CerS2 null mouse liver tidak mengandung VLC-SLs, melainkan mengandung level rantai panjang (C16) SL yang tinggi. 15 Sebagai hasil dari perubahan ini, perubahan signifikan dalam sifat biofisik membran hati diamati, 21 seperti perubahan fluiditas membran dan perubahan morfologi. Yang penting, lokalisasi reseptor membran plasma untuk membran tahan deterjen juga diubah. Sebagai contoh, translokasi reseptor insulin ke dalam membran resisten-deterjen dan fosforilasi selanjutnya dibatalkan dalam CerS2 null mouse liver, yang mengakibatkan resistensi insulin hati. 20 Studi saat ini tentang penghambatan pensinyalan pro-apoptosis TNFR1 adalah contoh lebih lanjut tentang bagaimana mengubah komposisi rantai asil SL mempengaruhi fungsi reseptor membran, tetapi dalam kasus ini, penghambatan internalisasi reseptor tampaknya disebabkan oleh modulasi klathrin yang dimediasi jalur 6, 25, 26 daripada jalur dimediasi lipid rakit. Sebaliknya, pensinyalan kompleks I TNFR1 bergantung pada rakit 3 tetapi tidak diubah pada mouse null CerS2, menunjukkan bahwa mengubah rasio antara VLC- dan LC-ceramida secara khusus memengaruhi internalisasi TNFR1 tetapi bukan trimerisasi. Namun, aktivasi TNFR1 dikaitkan dengan fosforilasi IKK α / β yang berkepanjangan dan degradasi I κ B α yang sedikit tertunda, yang bisa disebabkan oleh pelemahan internalisasi reseptor trimer, yang mungkin sangat penting untuk penghentian jalur bertahan hidup NF κ B. 6

Mekanisme bagaimana internalisasi yang dimediasi clathrin 5, 27 dipengaruhi oleh perubahan rasio panjang rantai asil SL tidak diketahui, meskipun telah disarankan bahwa stabilitas lubang yang dilapisi clathrin tergantung pada platform ceramide. 9, 28, 29 Dengan demikian, dimasukkannya LC-ceramides dalam vesikel unilamelar raksasa menghasilkan kelengkungan membran spontan dan pembentukan tubulus, 30 sphingomyelinase menyebabkan tunas vektor spontan yang menumbuhkan membran 31 dan ceramide memicu tunas eksosom dan memfasilitasi sekresi eksosom. Selanjutnya, reseptor membran sel-B, HM1.24, berinteraksi dengan α -adaptin dalam rakit lipid untuk internalisasi melalui clathrin. 33, 34 Bersama-sama, penghambatan internalisasi TNFR1 pada mouse nol CerS2 konsisten dengan gagasan bahwa jalur yang dimediasi clathrin, selain jalur yang dimediasi rakit, dapat diatur oleh SL, mungkin dengan mengubah rekrutmen protein adaptor yang diperlukan untuk clathrin - pembentukan lubang dilapisi. Sebaliknya, internalisasi reseptor Fas tidak diperlukan dalam hepatosit (sel tipe II) untuk menginduksi kematian sel yang diperantarai Fas, menunjukkan efek diferensial dari mengubah panjang rantai asil SL pada jalur reseptor-mediated berbeda. 5

Telah dibuktikan bahwa pembentukan ceramide dengan aktivasi aSMase atau nSMase 35, 36, 37 memediasi apoptosis yang diinduksi oleh stres termasuk jalur caspase-dependent dan -independent. 38, 39, 40, 41 Setelah trimerisasi, TNFR1 merekrut nSMase ke membran sel yang menghasilkan hidrolisis SM dan pengayaan ceramide; 4, 5, 42 selanjutnya, TNFR1 yang terinternalisasi mengaktifkan sintesis aASase dan de novo , dengan akumulasi C16-ceramide secara bersamaan. 13, 43 Meskipun mencit null CerS2 mengakumulasi C16-ceramide tingkat tinggi, tidak ada kerusakan hati yang diamati setelah perawatan LPS / GLN. Hal ini menunjukkan bahwa efek apoptosis C16-ceramide 14 adalah hilir ke generasi VLC-ceramide, konsisten dengan gagasan bahwa kurangnya toksisitas TNF- a pada tikus null CerS2 disebabkan oleh sifat membran yang berubah, yang berdampak pada endositosis TNFR1.

Yang penting, penghambatan internalisasi TNFR1 pada tikus CerS2 null mencegah aktivasi caspases 8, 9 dan 3, dari aASase, kematian sel hepatosit dan hepatitis. Hasil-hasil ini mencerminkan pengamatan sebelumnya tentang peran penting internalisasi TNFR1 untuk rekrutmen protein pensinyalan kompleks atau kompleks II yang menginduksi kematian, TRADD, FADD dan caspase 8 serta aSMase, dan penyebaran apoptosis dalam berbagai sistem sel. 5, 25 Penghambatan internalisasi TNFR1 oleh adenoviral E3-protein 14, 7K penting untuk mekanisme pelarian kekebalan infeksi adenovirus. 25

Internalisasi TNFR1 mengakibatkan pencabutan degradasi RIP1 dan TRAF2 pada tikus null CerS2. Kurangnya degradasi RIP1 dan TRAF2 bukan karena aktivitas proteasome yang berubah. Tanpa diduga, tingkat basal TRAF2 dan RIP1 yang lebih tinggi ditemukan pada tikus nol CerS2, yang mungkin terkait dengan penurunan tingkat basalisasi internalisasi TNFR1. Ligase protein ubiquitin, CARP-2, yang merupakan ligase ubiquitin RIP1 pada internalisasi TNFR1, terbukti bertindak sebagai regulator negatif konstitutif dari aktivasi NF κ B yang diinduksi oleh TNF. 24 CARP-2 terlokalisasi dalam vesikel endositik di mana ia berinteraksi dengan reseptor TNF yang diinternalisasi dan, bersama-sama dengan A20, suatu ligase ubiquitin yang mana-mana menyiagakan TRAF2 dan RIP1, 44, 45 memediasi ubiquitinasi dan degradasi RIP1. Meskipun kadar basal RIP1 dan TRAF2 lebih tinggi pada hati tikus CerS2 null, gen hilir ke NF κ B, seperti A20, cIAP2, xIAP, BCL XL dan I κ B α, tidak meningkat pada tikus nol CerS2, yang menunjukkan bahwa peningkatan level RIP1 dan TRAF2 tidak berkontribusi pada kurangnya sensitivitas terhadap FHF.

Singkatnya, penelitian ini menunjukkan pentingnya VLC-SLs dalam pensinyalan TNFR1 pada hepatosit. Ablasi VLC-SLs menghasilkan penghambatan total pensinyalan kompleks TNFR1 II karena internalisasi TNFR1 yang rusak. Karena jaringan yang berbeda mengandung tingkat SL yang berbeda dengan panjang rantai yang berbeda, 46 data kami menyarankan cara baru untuk mengatur internalisasi TNFR1, yang mungkin relevan untuk memahami mengapa kanker tertentu menunjukkan resistensi yang tinggi terhadap apoptosis yang dimediasi oleh TNF- a . 47, 48, 49

Material dan metode

Antibodi dan reagen

Antibodi dibeli dari sumber-sumber berikut: anti-phospho-IKK α / β , anti-phospho I κ B α , anti-total I κ B α , caspase 3 anti-cleaved, anti caspase 9, anti-caspase 9, anti-RIP, anti- TRAF2 dan anti-FLIP (Cell Signaling, Boston, MA, USA); anti-caspase 8 (Alexis, Shoham, Israel); anti-TNFR1 (Abcam, Cambridge, UK); antibodi anti-Jo-2 agonistik anti-Fas (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); antibodi anti Na + / K + ATPase (Hybridoma 6H) adalah hadiah dari Profesor Haim Garty (Institut Weizmann, Rehovot, Israel). 50 LPS, concanavalin A dan D - (+) - galactosamine hidroklorida berasal dari Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA).

Binatang

CerS2 null mencit dihasilkan dan dipelihara seperti yang dijelaskan. 15 Tikus diperlakukan sesuai dengan Pedoman Perawatan Hewan dari Institut Perawatan Hewan Institut Weizmann, dan Pedoman Institut Kesehatan Nasional untuk Perawatan Hewan.

Induksi FHF

Tikus (10 hingga 12 minggu) disuntikkan secara intraperitoneal dengan 15 μg / kg LPS dan 800 mg / kg GLN, atau intravena dengan 25 mg / kg concanavalin A, atau dengan agonistik anti-Jo-2 35 μg / kg. antibodi anti-Fas. Bagian jaringan hati dikumpulkan untuk pemeriksaan histologis atau dibekukan. Darah dikumpulkan melalui sinus orbital dan serum ALT dan kadar AST dianalisis menggunakan sistem Spotchem Strips (Arkary, Edina, MN, USA). Kadar sitokin serum diukur menggunakan ELISA kit anti-mouse (BioLegend, San Diego, CA, USA). Aktivitas caspase diukur menggunakan caspase-Glo 3/7, caspase-Glo 8 dan kit aktivitas caspase-Glo 9 (Promega, Madison, WI, USA), dan aktivitas aASase diukur seperti yang dijelaskan, 15, 51 dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, homogenat hati yang mengandung 40 g protein diinkubasi dalam volume akhir 500 μl buffer asetat natrium (50 mM natrium asetat pH 4, 5). Reaksi dimulai dengan penambahan 4 μMC6 –NBD-sphingomyelin dan diinkubasi dalam gelap pada suhu 37 ° C selama 15 menit. Reaksi diakhiri dengan penambahan tiga volume kloroform / metanol (1: 2; v / v). Lipid diekstraksi dan dipisahkan dengan kromatografi lapis tipis menggunakan larutan kloroform / metanol / 9, 8 mM CaCl 2 (60: 35: 8; v / v / v) sebagai pelarut yang berkembang. SL berlabel NBD diidentifikasi menggunakan standar otentik oleh perangkat Fluor-S Max (BioRad, Hercules, CA, USA) dan dikuantifikasi menggunakan program Image Quant (BioRad).

Western blotting

Lisat sel atau jaringan disiapkan dalam buffer pengujian radioimunopresipitasi (50 mM Tris HCl pH 7, 5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, natrium deoksikolat 0, 5%, 0, 1% SDS) yang mengandung 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, protease dan inhibitor fosfatase (Sigma). Konsentrasi protein diukur menggunakan BCA Protein Assay Kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). Lima puluh μ g protein dimuat dan dipisahkan pada 8-15% SDS-PAGE dan dipindahkan ke membran nitroselulosa atau PVDF. Membran diblokir menggunakan 5% bovine serum albumin (BSA) dalam salin yang mengandung fosfat yang mengandung 0, 1% Tween-20 (PBST) selama 1 jam pada suhu kamar. Antibodi primer diencerkan dalam PBST yang mengandung 1% BSA dan diinkubasi dengan membran pada suhu 4 ° C semalam. Setelah tiga kali mencuci dengan PBST, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder di PBST yang mengandung 1% BSA pada suhu kamar selama 1 jam.

Isolasi hepatosit

Hepatosit diisolasi dari tikus setelah perfusi vena portal hepatik menggunakan Ca ++ - dan Mg ++ - bebas larutan garam seimbang Hank (Sigma-Aldrich) yang mengandung 5, 5 mM KCl, 5, 5 mM glukosa, 25 mM NaHCO 3, 0, 7 mM EDTA selama 3 min, dan media digest liver (GIBCO / BRL Life Technologies, Grand Island, NY, USA) selama 8 menit. Setelah perfusi, hati dengan cepat dieksisi dan kantong empedu diangkat. Hepatosit dipisahkan dari jaringan ikat menggunakan pinset steril dan kemudian melewati saringan sel (BD Falcon Labware) dan disentrifugasi pada 50 × g av (4 ° C, 5 menit). Hepatosit ditangguhkan dalam DMEM yang mengandung 10% serum janin sapi, 2 mM natrium piruvat, 2% penisilin / streptomisin dan 1 μM deksametason.

Internalisasi Fc-TNF α

Plasmid coding Fc-TNF disediakan oleh H Wajant (Julius-Maximilians University, Würzburg, Jerman). Protein itu secara sementara diekspresikan dalam sel HEK dan dimurnikan dari supernatan menggunakan kolom HiTrap Protein G (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Hepatosit dikultur pada kaca penutup 13 mm yang dilapisi kolagen dan ditanam semalaman. Sel diperlakukan dengan 5 μg / ml Fc-TNF α pada es selama 15 menit dan kemudian dicuci dua kali dengan DMEM yang mengandung 1% BSA, 2 mM natrium piruvat, 2% penicillin / streptomycin dan 0, 01 μM deksametason untuk menghilangkan Fc-TNF yang tidak terikat, dan kemudian dipindahkan ke 37 ° C. Untuk menghentikan pengambilan Fc-TNF, sel dicuci tiga kali dengan PBS dingin dan segera diperbaiki dengan formaldehida 2%. Fc-TNF α terdeteksi menggunakan antibodi IgG anti-manusia terkonjugasi Cy3 sebelum pengamatan dengan mikroskop confocal.

Analisis histologis

Segmen hati diperbaiki dalam formaldehida 4% dan tertanam dalam parafin untuk analisis histologis. Bagian (5 m) diwarnai dengan hematoxylin / eosin. Untuk imunohistokimia TNFR1, bagian diinkubasi pada suhu 4 ° C semalam dengan antibodi primer, dan setelah pengambilan antigen, diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu kamar sebelum pewarnaan counter dengan pewarna biru memancarkan Hoechst 33342.

qPCR

Total RNA diisolasi menggunakan mini kit Rneasy (Qiagen, Venlo, Belanda) sesuai dengan instruksi pabrik, termasuk langkah DNAse dan penambahan β -mercaptoethanol. Sintesis cDNA dilakukan dengan menggunakan kit sintesis untai pertama Reverse-iT (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) menggunakan hexamers acak. Produk cDNA disimpan pada suhu -20 ° C. qPCR dilakukan menggunakan Master Mix SYBR Green PCR (Finnzyme, Vantaa, Finland) dan ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Terapan Biosystems, Grand Island, NY, USA) dengan cDNA (setara dengan 5 ng dari total RNA). Primer berikut digunakan:

I κ B α : Maju: 5′-TTGGTCAGGTGAAGGGAGAC-3 ′; terbalik: 5′-ACAGCCAAGTGGAGTGGAGT-3 ′.

TNFR1: Maju: 5′-GCCCCACCTCCGGCTTCAAC-3 ′; terbalik: 5′-GTCAGGACGTTGCGGGTGGG-3 ′

A20: Maju: 5′-GGTGATGGAAACTGCCTCAT-3 ′; mundur: 5′-CTTCCTCAGGACCAGGTCAG

BCL XL : Maju: GCTGGGACACTTTTGTGGAT-3 ′; terbalik: 5′-AACCACACCAGCCACAGTC-3 ′

cIAP2: Maju: 5′-CGAGGAGGAGGAGTCAGATG-3 ′; mundur: 5′-GGAGGCAATACAGCATTGGT-3 ′.

XIAP: Maju: 5′-TTGGAACATGGACATCCTCA-3 ′; terbalik: 5′-TACCACTTCGCATGCTGTTC-3 ′.

Mikroskopi konfokal

Mikroskopi confocal dilakukan menggunakan mikroskop Olympus IX 81 Fluo-View 1000 dan objektif UPLSAPO × 60 dan gambar diproses dan dianalisis menggunakan perangkat lunak FV-1000 (Olympus, Tokyo, Jepang).

Analisis statistik

Nilai dinyatakan sebagai berarti ± SEM Statistik signifikansi dihitung menggunakan uji t Student.

Glosarium

SL

sphingolipid

SM

sphingomyelin

VLC

rantai asil yang sangat panjang

GLN

D - (+) - galactosamine hydrochloride

aSMase

sphingomyelinase asam

nSMase

sphingomyelinase netral

TNFR1

faktor nekrosis tumor reseptor α 1

RIP1

tumor necrosis factor α protein yang berinteraksi reseptor

TRAF2

faktor nekrosis tumor α terkait faktor reseptor 2

TRADD

tumor necrosis factor α yang berhubungan dengan reseptor melalui domain kematian

I κ B α

inhibitor κ B α

IKK α / β

inhibitor κ B kinase

FHF

kegagalan hati fulminan

CerS2

ceramide synthase 2

LPS

lipopolysaccharide

WT

tipe liar

ActD

actinomycin D

BSA

albumin serum sapi

PBST

saline yang mengandung fosfat mengandung 0, 1% Tween-20