Uji videomikroskopi fluoresensi otomatis untuk mendeteksi bencana mitosis | kematian sel & penyakit

Uji videomikroskopi fluoresensi otomatis untuk mendeteksi bencana mitosis | kematian sel & penyakit

Anonim

Subjek

  • Apoptosis
  • Mitosis
  • Protein penekan tumor
  • Mikroskopi fluoresensi bidang lebar

Abstrak

Bencana mitosis dapat didefinisikan sebagai mode kematian sel yang terjadi selama atau tidak lama setelah mitosis yang lama / menyimpang, dan dapat menunjukkan gambaran apoptosis atau nekrotik. Namun, prosedur konvensional untuk mendeteksi apoptosis atau nekrosis, termasuk uji massal biokimia dan teknik sitofluorometrik, tidak dapat membedakan antara kematian sebelum mitosis, mitosis, dan pasca mitosis, dan karenanya tidak tepat untuk memantau bencana mitosis. Untuk mengatasi masalah ini, kami menghasilkan garis sel karsinoma usus manusia isogenik manusia yang berbeda dalam status ploidi dan p53 , namun menyatakan jumlah biosensor fluoresen yang serupa yang memungkinkan visualisasi kromatin (histone H2B digabungkan dengan protein fluoresen hijau (GFP)) dan centrosom ( centrin digabungkan dengan protein fluoresen merah Discosoma striata (DsRed)). Dengan menggabungkan videomikroskopi fluoresensi resolusi tinggi dan analisis gambar otomatis, kami menetapkan protokol dan pengaturan untuk penilaian simultan ploidi, mitosis, jumlah centrosom dan kematian sel (yang dalam sistem model kami terjadi terutama dengan apoptosis). Videomikroskopi time-lapse menunjukkan bahwa pendekatan ini dapat digunakan untuk deteksi throughput tinggi dari bencana mitosis yang diinduksi oleh tiga agen anti-mitotik yang berbeda secara mekanis (dimethylenastron (DIMEN), nocodazole (NDZ) dan paclitaxel (PTX)), dan - dalam hal ini konteks - mengungkapkan peran penting p53 dalam mengendalikan bilangan centrosome.

Utama

Deregulasi kematian sel sangat penting untuk patogenesis berbagai penyakit manusia. Oleh karena itu, analisis mendalam dari kematian seluler dan mekanismenya merupakan tantangan besar bagi penelitian biomedis yang fundamental dan terapan pada saat yang bersamaan dengan syarat pengembangan intervensi terapeutik baru. 1, 2, 3, 4 Kematian sel terprogram dapat dimediasi oleh mekanisme yang berbeda, termasuk apoptosis dan nekrosis, dan juga dapat dikaitkan dengan aktivasi besar-besaran autophagy. 5, 6 Ratusan metode tersedia untuk mendeteksi fenomena ini dan berkorelasi secara biokimiawi dalam ekstrak sel, kultur sel, jaringan terisolasi serta pada organisme hidup, masing-masing ditandai dengan keunggulan dan perangkap khusus. 7, 8, 9

Bencana mitosis pada awalnya digambarkan sebagai 'peristiwa mitosis abnormal yang membuat sel tidak mungkin berkembang biak, terlepas dari mekanisme atau waktunya'. 10 Walaupun apa yang disebut 'kematian sel akibat radioaktif yang tertunda', yang juga mencerminkan kematian pasca-mitosis, dapat terjadi bertahun-tahun setelah radioterapi pada jaringan manusia, 11 mungkin berguna untuk mengidentifikasi bencana mitosis dengan cara yang lebih pragmatis, dengan merujuk pada kinetika spesifik (dan karenanya dapat disurvei). Sejalan dengan hal ini, bencana mitosis telah didefinisikan sebagai peristiwa kematian sel apoptosis atau nekrotik yang terjadi selama atau segera setelah penyimpangan yang berat, mitosis yang sering berlarut-larut. 12, 13 Lebih tepatnya, bencana mitosis harus dianggap sebagai suatu proses yang dapat mengarah pada sejumlah hasil yang berbeda, tergantung pada pemicu dan konteks seluler. 13, 14 Faktanya, tidak hanya bencana mitosis yang berinteraksi dengan kematian sel melalui apoptosis tetapi juga dengan nekrosis, penuaan dan poliploidisasi, baik dalam kondisi perkembangan dan sebagai respons terhadap perawatan antikanker. 13, 15, 16, 17 Selain itu, publikasi terbaru menunjukkan kapasitas sel aneuploid untuk menjalani de-poliploidisasi oleh divisi multipolar, 18, 19 sebuah fenomena yang mungkin mengarah pada generasi sel induk kanker aneuploid. 20

Bencana mitosis sering melibatkan aktivasi apikal dari satu caspase tertentu, caspase-2. 15 Namun, karena caspase-2 dapat diaktifkan oleh rangsangan yang tidak berhubungan dengan mitosis (misalnya, kerusakan DNA, stres aparat Golgi dan sengatan panas) 21, 22, 23, 24 dan, dalam beberapa kasus, bencana mitosis terjadi melalui caspase-2-independent mekanisme, 13, 17, 25 penilaian mandiri aktivitas caspase-2 tidak memungkinkan untuk identifikasi yang akurat dari subroutine kematian sel ini.

Bencana mitosis dapat diakibatkan oleh penyebab endogen. Sebagai contoh, sel-sel poliploid sering terlibat dalam mitosis abnormal karena adanya centrosom supernumerary, kromosom yang tertinggal dan / atau akumulasi lesi DNA yang tidak diperbaiki. 26, 27 Sebagian besar sel yang memasuki mitosis menyimpang akhirnya mati, mungkin karena mekanisme pos pemeriksaan yang bertujuan untuk meminimalkan risiko ketidakstabilan genom. Sejalan dengan hipotesis ini, kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa penghambatan bencana mitosis meningkatkan kecenderungan sel untuk memasuki multipolar, divisi asimetris yang akhirnya mengarah pada aneuploidi. 12 Selain itu, bencana mitosis dapat diinduksi oleh agen eksogen termasuk iradiasi pengion, 28 racun mikrotubulus, 29 inhibitor mitosis kinesin Eg5 30 serta oleh strategi farmakologis / genetik yang secara khusus menargetkan pos pemeriksaan kinase Chk1. 31 Namun, persentase sel yang menyerah pada bencana mitosis sebagai lawan dari apoptosis interfase klasik dalam menanggapi racun mikrotubulus tergantung pada konteks seluler. 32 Persaingan antara mesin molekuler untuk aktivasi caspase dan regulator kelimpahan cyclin B1 (yang memberikan efek sebagai penghambat selip mitosis) menentukan apakah sel akan mati selama interfase atau akan menyerah pada bencana mitosis. 32

Metode konvensional untuk mendeteksi kematian sel tidak dapat melacak 'sejarah' kematian seluler sehubungan dengan mitosis. Penanda apoptosis dan nekrotik, termasuk kondensasi kromatin, paparan fosfatidilserin, pelepasan sitokrom c dari mitokondria dan permeabilisasi membran plasma, semua dapat terjadi sebelum, selama atau setelah mitosis. 33, 34, 35 Selain itu, produk tahap akhir dari apoptosis atau nekrosis pada sel-sel post-mitosis dan proliferasi tidak dapat dibedakan. Oleh karena itu, tidak ada metode yang secara rutin digunakan untuk mendeteksi kematian sel yang berlaku untuk kuantifikasi bencana mitosis yang akurat. Saat ini, satu-satunya pendekatan untuk penilaian bencana mitosis bergantung pada pengamatan terus menerus sel dengan mikroskop konvensional, yang membosankan, memakan waktu dan tergantung operator. Untuk menghindari masalah intrinsik dari tes berbasis mikroskop konvensional, metode berbasis-konten otomatis harus dikembangkan. 36, 37 Didorong oleh pertimbangan-pertimbangan ini, kami memutuskan untuk mengimplementasikan uji videomikroskopi otomatis untuk deteksi simultan simultan waktu-waktu, ploidi, centrosom supernumerary dan kematian sel yang dapat digunakan untuk deteksi bencana katotik mitosis dengan throughput tinggi.

Hasil dan Diskusi

Deteksi otomatis penangkapan mitosis

Tipe liar (WT) dan kekurangan p53 ( p53 - / - ) 38 karsinoma kolon manusia HCT 116 sel sebelumnya telah direkayasa untuk ekspresi stabil dari kimera histone H2B-protein fluorescent hijau (H2B-GFP) hijau, memungkinkan untuk visualisasi kromatin dan karenanya untuk pelacakan gerakan kromosom terus menerus. 16, 39 Untuk secara simultan memonitor siklus centrosome, kami selanjutnya mentransfusikan sel-sel ini dengan centrin encoding plasmid, suatu konstituen esensial dari centrosoma, menyatu dengan terminal-C dari varian protein fluorescent Discosoma striata merah (DsRed-Centrin chimera) (Gambar Tambahan 2). Klon stabil yang mengekspresikan jumlah moderat protein fluoresen merah dalam struktur mirip-titik (sebagian besar satu titik tunggal per sel, sesuai dengan centrosom ) dipilih, dan videomikroskopi digunakan untuk mengkonfirmasi replikasi DNA normal dan siklus centrosom (Gambar 1a). Kehadiran DsRed-Centrin tidak mempengaruhi tingkat pertumbuhan sel WT dan p53 - / - HCT 116 (Gambar 1b) atau distribusi siklus sel mereka (Gambar 1c). Tetraploidisasi dengan perantara Nocodazole (NDZ) (Gambar 1 tambahan) dan pemilihan klon WT dan p53 - / tetraploid stabil, 31, 39 ekspresi DsRed-Centrin tetap konstan, sehingga memungkinkan untuk deteksi centrosumer supernumerary (Gambar 1d), yang diketahui muncul dalam sel tetraploid p53 - / - . 40

Image

Karakterisasi kanker usus besar manusia HCT 116 sel secara bersama-sama mengekspresikan H2B-GFP dan DsRed-Centrin. ( a ) Perkembangan siklus sel normal dari tipe liar (WT) diploid HCT 116 sel direkayasa untuk ekspresi co-stabil dari H2B-GFP dan DsRed-Centrin (yang memungkinkan masing-masing untuk mendeteksi status kromatin dan nomor centrosome) dipantau. dengan videomikroskopi selang waktu. Foto yang diambil pada waktu yang ditunjukkan ditunjukkan (skala bar = 10 μ m). Film berdurasi penuh tersedia sebagai Video Tambahan 1. ( b ) Penghitungan sel hemositometri menunjukkan bahwa laju pertumbuhan sel WT dan p53 - / - HCT 116 yang ditransfusikan bersama dengan H2B-GFP dan DsRed-Centrin tidak berbeda dengan yang ada. rekan-rekan mereka yang tidak ditransfeksi. ( c ) Analisis sitofluorometrik pada pewarnaan HoTst 33342 dari WT parental dan yang ditransfusikan secara stabil dan sel p53 - / - HCT 116 mengkonfirmasi bahwa ekspresi co-ekspresi H2B-GFP / DsRed-Centrin gagal mempengaruhi distribusi siklus sel. ( d ) Videomikroskopi selang-sel p53 - / - tetraploid HCT 116 sel yang bersama-sama mengekspresikan H2B-GFP dan DsRed-Centrin digunakan untuk memantau centrosom supernumerary, metafase multipolar, dan sitokinesis asimetris, yang dilaporkan menjadi ciri rekan-rekan mereka yang tidak diterjemahkan (skala bar = 10) μ m). Film berdurasi penuh tersedia sebagai Video Tambahan 2. DsRed, Discosoma striata protein fluoresen merah; GFP, protein fluorescent hijau; H2B, histone H2B

Gambar ukuran penuh

Kami secara sistematis mengekspos sel WT diploid, p53 - / - diploid, tetraploid WT dan p53 - / - tetraploid ke tiga induktor yang berbeda dari bencana mitosis, yaitu paclitaxel (PTX, sebuah taxane yang secara ireversibel menghambat depolimerisasi mikrotubular), 41 dimethylenastron (DIM menargetkan mitotic kinesin Eg5) 30 dan NDZ (inhibitor reversibel dari polimerisasi mikrotubular), 42 serta ke 7-hydroxystaurosporine (UCN-01), turunan staurosporine (STS) yang menginduksi apoptosis dengan mengerahkan efek sebagai tyrosine yang agak tidak spesifik inhibitor kinase. 43 Semua bahan kimia ini memberikan efek sitotoksik / antiproliferatif yang kuat, sehingga menyebabkan penurunan frekuensi sel yang bertahan hidup terlepas dari status ploidi dan p53 , sebagaimana ditentukan 72 jam setelah pemberian dengan penghitungan sel otomatis dalam mikrograf yang diproses (Gambar 2a dan b) dan dikonfirmasi oleh penilaian proliferasi residu dengan uji konversi kolorimetri tetrazolium (WST-1) (Gambar 2c). Patut dicatat bahwa sel-sel diploid yang selamat dari pemberian penginduksi bencana mitosis (yaitu, PTX, DIMEN dan NDZ) menunjukkan peningkatan bersih dalam ukuran nuklir, mungkin karena poliploidisasi (dibahas lebih lanjut di bawah), yang kurang jelas dalam fraksi dari sel-sel yang resisten terhadap UCN-01 (Gambar 2a).

Image

Analisis gambar otomatis untuk mendeteksi kematian sel. ( a ) Mikrophotograf berfluoresensi tipe liar (WT) diploid HCT 116 sel bersama-sama mengekspresikan biosensor untuk mendeteksi status kromatin dan bilangan centrosome (H2B-GFP dan DsRed-Centrin, masing-masing) - dibiarkan tidak diobati (Kontrol) atau diinkubasi untuk 72 jam dengan paclitaxel (PTX), dimethylenastron (DIMEN), nocodazole (NDZ) atau 7-hydroxystaurosporine (UCN-01) - diproses untuk pembuatan masker segmentasi berikut: nuclei (pink), sel = inti +10 piksel ( pink + biru); centrosom (putih atau hijau, tergantung apakah mereka ditumpangkan atau tidak ke wilayah minat lain (ROI)) (skala bar = 10 μ m). ( B ) Penghitungan sel otomatis dalam mikrophotograf diizinkan untuk penilaian tidak langsung kelangsungan hidup sel (kultur yang tidak diobati digunakan sebagai kontrol untuk estimasi relatif jumlah sel). ( C ) Kuantifikasi tidak langsung kelangsungan hidup sel dengan tes kolorimetri berdasarkan konversi garam tetrazolium WST-1 memberikan hasil yang serupa. Fraksi sel yang bertahan (konversi WST-1 dinormalisasi dengan rata-rata kondisi kontrol) digambarkan (rata-rata ± SEM, n = 3 percobaan independen). AU, unit sewenang-wenang; DsRed, Discosoma striata protein fluoresen merah; GFP, protein fluorescent hijau; H2B, histone H2B

Gambar ukuran penuh

Kami selanjutnya menetapkan prosedur untuk identifikasi sel-sel yang ditangkap secara otomatis dan berbasis mikroskopi yang ditangkap dalam mitosis setelah paparan jangka pendek (8 jam) dengan berbagai inhibitor mitosis dan induktor apoptosis (Gambar 3a). Untuk menutup sebagian besar peristiwa apoptosis lanjut (yang mengarah pada penyusutan nuklir yang jelas dan pembentukan badan apoptosis, Gambar Tambahan 3) 5 dari analisis, wilayah yang diminati (ROI) yang ditandai dengan sinyal H2B-GFP (digunakan untuk menentukan area nuklir ) <100 piksel diabaikan. Dua parameter yang berbeda digunakan untuk mengidentifikasi dan mengukur sel mitosis dalam mikrograf. Yang pertama adalah granularity, parameter tekstur yang mewakili heterogenitas sinyal fluoresen dalam ROI. Ini dihitung sebagai rasio antara perbedaan rata-rata dalam fluoresensi piksel yang berdekatan dalam satu ROI dan keseluruhan fluoresensi rata-rata. Seperti dalam pengaturan eksperimental ini intensitas fluoresensi meningkat pada agregasi H2B-GFP, granularitas memberikan informasi tentang status kondensasi DNA dan peningkatan sel mitosis atau apoptosis (Gambar Tambahan 3). Parameter lain yang digunakan adalah densitometri rata-rata nuklir (yang mencerminkan rasio antara intensitas fluoresensi rata-rata ROI nuklir dan luasnya). Dengan memplot granularitas nuklir terhadap densitometri rata-rata nuklir , dot plot yang menggambarkan beberapa nukleus yang termasuk dalam populasi sel dapat dihasilkan. Ini memungkinkan kami untuk menentukan tingkat ambang (dan karenanya gerbang) untuk identifikasi yang tepat dari penangkapan mitosis, di mana peningkatan granularitas akibat kondensasi kromatin disertai dengan peningkatan densitometri rata-rata. Dengan demikian, sel-sel mitosis ditentukan oleh granularitas> 550 unit acak (AU) dan densitometri rata-rata> 250 AU (Gambar 3b).

Image

Deteksi otomatis penangkapan mitosis. ( a ) Wild-type (WT) diploid HCT 116 sel direkayasa untuk ekspresi bersama H2B-GFP dan DsRed-Centrin (masing-masing memungkinkan untuk visualisasi kromatin dan centrosom). Mikrophotograf fluoresensi sel-sel ini dalam kondisi yang tidak diobati (Kontrol) atau setelah inkubasi selama 8 jam dengan paclitaxel (PTX), dimethylenastron (DIMEN), nocodazole (NDZ), 7-hydroxystaurosporine (UCN-01) atau staurosporine (STS) menunjukkan bahwa blocker mitosis (tetapi bukan molekul pro-apoptosis) menginduksi peningkatan angka mitosis (skala bar = 10 μ m). ( B ) PTX, DIMEN dan NDZ (tetapi bukan pemicu pro-apoptosis) menghasilkan populasi sel yang berbeda (sesuai dengan peristiwa mitosis) yang terlokalisasi dalam kuadran yang ditentukan oleh nilai-nilai yang lebih tinggi dari 550 dan 250 unit acak (AU) pada granularitas nuklir versus nuklir berarti plot densitometri, masing-masing. ( c ) Setiap pemblokir mitosis mengarah pada morfologi nuklir spesifik (yaitu, inti 'setengah lingkaran', 'lingkaran' dan 'padat' yang diinduksi oleh masing-masing PTX, DIMEN dan NDZ), yang berkorelasi dengan distribusi nilai granularitas nuklir (skala bar = 10 μ m). ( d ) Mikrophotograf fluoresensi diambil dari sel WT diploid, p53 - / - diploid, tetraploid WT, p53 - / - tetraploid HCT 116 disimpan dalam kondisi yang tidak diobati (Kontrol) atau diperlakukan seperti pada ( a ). Penghitungan otomatis selanjutnya dari peristiwa dengan granularitas nuklir dan densitometri rata-rata nuklir lebih tinggi dari 550 dan 250 AU, masing-masing, memungkinkan untuk kuantifikasi sel dalam metafase. ( E ) Data mikroskop fluoresensi dikonfirmasi oleh penilaian paralel distribusi siklus sel oleh pewarnaan Hoechst 33342 dan kuantifikasi sel sitofluorometrik sel dengan kandungan DNA G 2 / M. Kolom menggambarkan nilai rata-rata ± SEM yang dicatat dari tiga percobaan independen. DsRed, Discosoma striata protein fluoresen merah; GFP, protein fluorescent hijau; H2B, histone H2B

Gambar ukuran penuh

Meskipun pemotongan area nuklir , perbandingan sederhana antara granularitas nuklir dan densitometri rata-rata nuklir tidak memungkinkan untuk pengecualian semua sel yang menunjukkan morfologi apoptosis (seperti yang diinduksi oleh STS). Namun, karena sel-sel ini ditandai oleh peningkatan granularitas nuklir serta oleh variabel densitometri (karena adanya benda apoptosis), mereka menunjukkan heterogenitas yang lebih besar daripada sel yang ditangkap dalam mitosis, sehingga mendistribusikan seluruh empat kuadran diagram (yang membatasi pengaruhnya terhadap total catatan; Gambar 3b). Pendekatan ini memungkinkan tidak hanya identifikasi sel yang diblokir dalam metafase terlepas dari morfologinya yang tepat, tetapi juga dapat memberikan beberapa informasi yang mencerminkan penampilan penangkapan mitosis. Jadi, biasanya pelat metafase 'setengah lingkaran', 'lingkaran' dan 'padat' yang diinduksi oleh PTX, DIMEN dan NDZ, masing-masing, terkait dengan penurunan nilai granularitas nuklir (Gambar 3b dan c). Pada saat yang sama (8 jam) di mana STS menghasilkan akumulasi sel-sel apoptosis, sejumlah metafase normal secara morfologis dapat diidentifikasi pada pemberian UCN-01 (Gambar 3c). Ini sejalan dengan anggapan bahwa STS menginduksi apoptosis lebih cepat dari UCN-01, mungkin karena menghambat tirosin kinase bahkan lebih spesifik daripada UCN-01. 43 Meskipun semua klon yang digunakan dalam penelitian ini (terlepas dari status ploidi dan p53 ) merespons (dan karenanya diblokir dalam metafase oleh) PTX, DIMEN dan NDZ, tingkat penangkapan mitosis seperti itu lebih rendah pada sel tetraploid daripada di rekan diploid mereka. . Hasil ini diperoleh dengan analisis otomatis mikrophotograf fluoresensi (Gambar 3d) dan dikonfirmasi oleh penilaian sitofluorometrik konten DNA pada pewarnaan Hoechst 33342 (Gambar 3e). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa mikroskop fluoresensi dapat berhasil digabungkan ke analisis gambar otomatis untuk deteksi throughput tinggi penangkapan mitosis.

Deteksi otomatis centrosom supernumerary dan poliploidi

Penyimpangan dari siklus sentrosom sering menginduksi metafase multipolar, yang dapat terjadi secara sementara (diikuti oleh kongres sentrosom supernumerary, pembentukan hanya dua pusat pengorganisasian mikrotubulus fungsional dan divisi bipolar) atau bertahan, sehingga mengarah ke sitokinesis multipolar. Dengan demikian, kami memutuskan untuk membuat satu protokol untuk deteksi otomatis jumlah centrosom per sel. Dalam hal ini, ROI sel didefinisikan oleh sinyal H2B-GFP nuklir ditambah zona ekstensi perinuklear 10 piksel, dan jumlah centrosom dalam ROI ini ditentukan menggunakan sinyal DsRed-Centrin. Sel-sel WT diploid HCT 116 yang tidak diobati biasanya mengandung satu atau dua (dan jarang tiga) titik-titik neon merah (sesuai dengan centrosom ) (Gambar 4a). Fraksi sel yang bertahan hidup yang menyimpan lebih dari dua centrosom secara konsisten meningkat pada pengobatan dengan PTX, DIMEN dan NDZ (tetapi tidak UCN-01) (Gambar 4b-e). Kuantifikasi area nuklir dengan mikroskop fluoresensi digabungkan dengan analisis gambar otomatis menunjukkan bahwa PTX, DIMEN dan NDZ (tetapi tidak UCN-01) menambah ukuran rata-rata nuklir sel diploid dan tetraploid, terlepas dari status p53 mereka (Gambar 4a-e dan 5a ). Peningkatan area nuklir yang diinduksi oleh blocker mitosis sedikit (namun secara signifikan) lebih kecil dalam sel tetraploid daripada di rekan-rekan diploid mereka (Gambar 5a). Poliploidisasi dikuatkan dengan analisis sitofluorometrik, menunjukkan bahwa sub-populasi sel dengan kandungan DNA yang meningkat (> G2 / M) dihasilkan dari sel diploid dan tetraploid sebagai respons terhadap penghambat mitosis (Gambar 5b). Temuan ini sesuai dengan laporan tentang batasan ukuran nuklir yang menghalangi korelasi langsung antara konten DNA dan volume nuklir. 45 Yang penting, setelah pemberian PTX atau DIMEN, sel diploid p53 - / - lebih rentan untuk mengakumulasi centrosom supernumerary daripada rekan WT mereka (Gambar 5c), yang sejalan dengan laporan sebelumnya dan menegaskan peran p53 dalam kontrol angka centrosome. 46 Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa mikroskop fluoresensi sel-sel adheren yang mengekspresikan biosensor spesifik dapat digunakan untuk mendeteksi centrosom dan poliploidi supernumerary secara otomatis.

Image

Blocker mitosis menyebabkan peningkatan area nuklir dan generasi centrosom supernumerary. Wild-type (WT) diploid HCT 116 sel co-expressing H2B-GFP dan DsRed-Centrin (yang memungkinkan untuk pemantauan status kromatin dan nomor centrosome, masing-masing) dibiarkan tidak diobati (Kontrol, a ) atau diinkubasi dengan paclitaxel (PTX, b ), dimethylenastron (DIMEN, c ), nocodazole (NDZ, d ), 7-hydroxystaurosporine (UCN-01, e ) selama 72 jam. Mikrophotograf fluoresensi yang diambil pada titik waktu ini kemudian secara otomatis dianalisis untuk kuantifikasi area nuklir dan jumlah centrosom per sel (dalam populasi sel yang bertahan). Microphotographs dan data kuantitatif mewakili satu dari tiga percobaan independen ditunjukkan (skala bar = 10 μ m). DsRed, Discosoma striata protein fluoresen merah; GFP, protein fluorescent hijau; H2B, histone H2B

Gambar ukuran penuh

Image

Analisis otomatis mikrophotograf fluoresensi memungkinkan penilaian poliploidisasi. Karsinoma kolon manusia HCT 116 sel dengan status ploidy dan p53 yang ditunjukkan secara stabil mengekspresikan protein fusi untuk deteksi status kromatin (H2B-GFP) dan jumlah centrosome (DsRed-Centrin) dibiarkan tidak diobati (Kontrol) atau diinkubasi dengan paclitaxel (PTX), dimethylenastron (DIMEN), nocodazole (NDZ) atau 7-hydroxystaurosporine (UCN-01) selama 72 jam. ( a ) Analisis otomatis mikrophotograf fluoresensi diizinkan untuk kuantifikasi area nuklir . Kolom menggambarkan rata-rata nilai median ± SEM, sebagaimana dicatat dalam tiga percobaan independen. Blocker mitosis (tetapi bukan UCN-01) memicu peningkatan yang relevan di area nuklir baik sel diploid dan tetraploid, terlepas dari status p53 mereka. ( B ) Analisis sitofluorometrik pada pewarnaan Hoechst 33342 menegaskan bahwa, berbeda dengan UCN-01, inhibitor mitosis (khususnya PTX dan NDZ) menyebabkan akumulasi sel dengan konten DNA G 2 / M, baik dalam diploid dan tetraploid sel. Karena pada saat ini sel mitosis tidak terdeteksi oleh pencitraan (data tidak ditampilkan), peristiwa ini mewakili sel aneuploid yang bonafid . ( c ) Kuantifikasi otomatis jumlah centrosom per sel (No. Centr.) menunjukkan bahwa sel p53 - / - HCT 116 cenderung mengakumulasi centrosom supernumerary lebih mudah daripada rekan tipe liar (WT). Dalam ( b ) dan ( c ), data adalah nilai rata-rata ± SEM ( n = 3 percobaan independen)

Gambar ukuran penuh

Deteksi videomikroskopis dari bencana mitosis

Penilaian kuantitatif yang disajikan di atas dilakukan sebagai tes titik akhir pada sel-sel tetap, namun mereka sangat cocok untuk pengukuran berulang dan penentuan kinetik pada sel hidup. Jadi, kami memutuskan untuk melacak sel-sel individual dengan videomikroskopi fluoresensi untuk menentukan waktu yang akan berlalu antara metafase dan fenotipe titik akhir. Beberapa peneliti telah merangkum hasil yang berbeda dari mitosis abnormal, 13, 14, 16, 20 sehingga mendefinisikan kematian selama mitosis (bencana mitosis, Gambar 6a), pengembalian ke interfase (selip mitosis, Gambar 6b) atau penyelesaian karyokinesis (pembagian, Gambar 1a), yang dapat diikuti oleh perkembangan siklus sel normal, penuaan atau kematian dengan fitur apoptosis atau nekrotik.

Image

Videomikroskopi selang waktu dari kematian sel mitosis dalam sel HCT 116 secara stabil mengekspresikan DsRed-Centrin dan H2B-GFP. Tipe liar (WT) dan p53 - / - karsinoma kolon manusia diploid HCT 116 sel secara bersama-sama mengekspresikan H2B-GFP dan DsRed-Centrin (yang masing-masing memungkinkan untuk visualisasi kromatin dan centrosom) dibiarkan tidak diobati (Kontrol) atau disimpan selama 8 jam di hadapan paclitaxel (PTX), dimethylenastron (DIMEN), nocodazole (NDZ) atau 7-hydroxystaurosporine (UCN-01), dan kemudian dipantau dengan videomicroscopy (setelah penambahan pewarna vital TO-PRO-3) untuk 36 jam berikutnya (masih di hadapan obat yang ditunjukkan). Harap dicatat bahwa waktu 0 bertepatan dengan awal penilaian videomikroskopis (8 jam setelah pemberian obat). ( a ) Sel diploid WT yang diperlakukan dengan PTX menunjukkan ciri khas dari bencana mitosis: inti dalam metafase langsung mengalami penyusutan sebelum penggabungan TO-PRO-3 (yang mencerminkan permeabilisasi membran plasma). ( B ) Setelah pemberian NDZ, sel diploid p53 - cenderung menunjukkan selip mitosis untuk interfase sebelum kematian sel. Dalam seri snapshot representatif ini, karyorrhexis terjadi sekitar 10 jam setelah pemulihan interfase dan mendahului pengambilan TO-PRO-3. Skala bar = 10 μ m. Film berdurasi penuh untuk ( a ) dan ( b ) masing-masing tersedia sebagai Video Tambahan 3 dan 4. ( c ) Nasib lebih dari 50 sel tunggal dari setidaknya tiga film yang berbeda dipantau oleh videomikroskopi fluoresensi hingga 36 jam, didaftar dan dikuantifikasi menurut peristiwa yang ditunjukkan, yang memungkinkan pembentukan profil nasib sel tertentu. Ilustrasi tambahan yang menggambarkan peristiwa yang dikatalogkan dan menjelaskan diagram sel-takdir disediakan pada Gambar 4. Tambahan. Jadi, bila dibandingkan dengan rekan WT mereka ( d ), sel diploid p53 - / - ( e ) menunjukkan peningkatan resistensi terhadap bencana mitosis (seperti diinduksi oleh PTX, DIMEN dan NDZ) dalam kaitannya dengan kecenderungan yang lebih tinggi terhadap selip mitosis. DsRed, Discosoma striata protein fluoresen merah; GFP, protein fluorescent hijau; H2B, histone H2B

Gambar ukuran penuh

Kami memulai akuisisi videomikroskopis sepanjang 36 jam pada 8 jam setelah penambahan mitosis blocker (Gambar 6) dan mengklasifikasikan nasib seluler yang diamati dalam sembilan kategori yang berbeda: (1) bencana mitosis, (2) selip mitosis diikuti oleh interfase, (3) ) selip mitosis diikuti oleh kematian dalam interfase, (4) pembagian menghasilkan sel anak yang layak, (5) pembagian ganda (sel anak juga dibagi selama percobaan), (6) pembagian diikuti oleh kematian dalam interfase, (7) pembagian ganda diikuti oleh kematian dalam interfase, (8) kematian sel dalam interfase (tanpa adanya peristiwa mitosis) dan (9) interphase yang berkepanjangan (dengan tidak adanya peristiwa kematian mitosis atau kematian sel) (Gambar Tambahan 4 dan Gambar 6c). Sistem kami tidak memungkinkan deteksi penuaan, karena waktu perekaman video yang lebih lama (secara teoritis tidak terbatas) diperlukan untuk ini, juga tidak untuk diskriminasi antara karyokinesis dan sitokinesis.

Terlepas dari keterbatasan ini, pengaturan videomikroscopic ini memungkinkan kami untuk menghasilkan profil nasib sel untuk sel WT dan p53 - / - diploid (Gambar 6d dan e). Dengan demikian, sel diploid WT yang diobati dengan PTX, DIMEN dan NDZ secara besar-besaran mengalami bencana mitosis (Gambar 6d, bar merah), namun juga menunjukkan beberapa tingkat kematian sel selama interphase (Gambar 6d, bar oranye). Hal yang sama tidak terjadi pada pemberian UCN-01, yang dikaitkan dengan sangat sedikit contoh kematian sel mitosis (Gambar 6d). Setelah pemberian blocker mitosis, fraksi sel p53 - / - diploid yang mengalami bencana mitosis lebih rendah daripada yang diamati di antara rekan WT mereka, seperti yang dapat diapresiasi dengan membandingkan jumlah batang merah pada Gambar 6d dan e. Dalam kondisi ini, sel p53 - / - agak dikembalikan ke interfase dan akhirnya bertahan hidup (Gambar 6d dan e, violet bar), sejalan dengan gagasan bahwa tidak adanya p53 memfasilitasi selip mitosis. 16, 47 Dalam sel diploid p53-mahir dan defisiensi-p53, ada korelasi linier antara frekuensi sel yang membawa centrosom supernumerary dan selastasthes mitosis (Gambar 7). Namun, kemiringan regresi linier antara dua set data ini lebih tinggi pada sel p53 - / - daripada di rekan WT mereka, sejalan dengan kesimpulan bahwa yang pertama menghasilkan dan mentoleransi jumlah centrosom ekstra yang lebih tinggi daripada yang terakhir. Secara keseluruhan, eksperimen ini mendukung kemungkinan untuk mengukur bencana mitosis dengan videomikroskopi yang digabungkan dengan pencitraan otomatis.

Image

Korelasi linear antara persentase sel dengan centrosom supernumerary dan kejadian bencana mitosis. Wild-type (WT) dan p53 - / - sel karsinoma kolon manusia diploid HCT 116 yang secara konstitutif mengekspresikan biosensor untuk mendeteksi status kromatin dan centrosom dikultur selama 8 jam dalam ketidakhadiran (Kontrol) atau di hadapan paclitaxel ( PTX), dimethylenastron (DIMEN), nocodazole (NDZ) atau 7-hydroxystaurosporine (UCN-01), dan kemudian dipantau dengan videomikroskopi untuk kuantifikasi otomatis jumlah centrosom per sel dan bencana mitosis. Dalam kedua sel diploid WT ( a ) dan p53 - / - ( b ), persentase sel yang dikarakteristikan oleh suprosumerary centrosom yang berkorelasi linier dengan kejadian bencana mitosis. Data adalah nilai rata-rata dari tiga percobaan independen. m = kemiringan; R 2 = koefisien determinasi

Gambar ukuran penuh

Keterangan Penutup

Bencana mitosis adalah modalitas kematian sel yang terkait dengan fitur morfologis, dan yang lebih penting, 'historis' dari sel, sehingga membutuhkan metode deteksi khusus. Memang, tes massal biokimia konvensional (seperti tes aktivasi caspase) tidak dapat membedakan antara interfase dan apoptosis pasca mitosis. Demikian pula, metode sitofluorometrik tidak dapat menentukan apakah sifat-sifat apoptosis (seperti paparan fosfatidilserin atau kolapsnya potensi transmembran mitokondria) telah diperoleh sebelum, selama atau setelah mitosis. Dengan demikian, untuk secara tepat mengidentifikasi bencana mitosis, perubahan morfologis tambahan harus dipantau, idealnya dengan cara yang memungkinkan untuk penilaian nasib sel individu dalam konteks penyimpangan mitosis.

Dalam penelitian ini kami telah meningkatkan serangkaian prosedur eksperimental dan pengaturan perangkat lunak yang memungkinkan kuantifikasi mitosis, ploidy, centrosom supernumerary dan kematian sel apoptosis oleh mikroskop fluoresensi (video) yang digabungkan dengan analisis gambar otomatis. Sebagian besar hasil yang disajikan dalam artikel ini dihasilkan dalam sel HCT 116, model karsinoma usus manusia yang memungkinkan kita untuk mempelajari pengaruh p53 dalam hasil bencana mitosis. Meskipun demikian, prosedur eksperimental kami sepenuhnya cocok untuk garis sel lain (seperti sel osteosarkoma manusia U2OS, Gambar 5 tambahan) yang mentolerir ekspresi protein chimeric yang kami gunakan. Segmentasi gambar serta analisis penghitungan tekstur dan objek dapat dicapai dengan videomikroskop dan perangkat lunak (misalnya, ImageJ, tersedia secara bebas di //rsb.info.nih.gov/ij/; Metamorph, dari Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA ) yang berbeda dari yang digunakan dalam makalah ini. Dengan demikian, prosedur eksperimental dan analitik kami dapat disesuaikan dengan platform dari berbagai penyedia komersial.

Singkatnya, ketika dikombinasikan dengan penilaian kinetik, metode ini menjanjikan untuk memfasilitasi deteksi otomatis kematian sel terkait mitosis dan karenanya merupakan metode objektif untuk kuantifikasi bencana mitosis.

Konflik kepentingan

Penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Aksesi

GenBank / EMBL / DDBJ

  • BC029515.1

Informasi tambahan

File gambar

  1. 1.

    Gambar Tambahan 1

  2. 2.

    Gambar Tambahan 2

  3. 3.

    Gambar Tambahan 3

  4. 4.

    Gambar Tambahan 4

  5. 5.

    Gambar Tambahan 5

Video

  1. 1.

    Video Tambahan 1

  2. 2.

    Video Tambahan 2

  3. 3.

    Video Tambahan 3

  4. 4.

    Video Tambahan 4

Dokumen Word

  1. 1.

    Legenda Angka dan Video Tambahan

Glosarium

AU

unit sewenang-wenang

DIMEN

dimethylenastron

DsRed

Discosoma striata red fluorescent protein

FACS

fluorescence-activated cell sorter

FSC

forward scatter

GFP

protein fluoresen hijau

H2B

histone H2B

NDZ

nocodazole

PTX

paclitaxel

PI

propidium iodide

ROI

wilayah yang diminati

SEM

standar kesalahan rata-rata

SSC

side scatter

STS

staurosporine

UCN-01

7-hydroxystaurosporine

WT

tipe liar

Informasi Tambahan menyertai makalah ini di situs web Cell Death and Disease (//www.nature.com/cddis)