Genomik komparatif lactobacillus reuteri dari penghuni pertama mengungkapkan adaptasi dari simbion usus terhadap fermentasi makanan | laporan ilmiah

Genomik komparatif lactobacillus reuteri dari penghuni pertama mengungkapkan adaptasi dari simbion usus terhadap fermentasi makanan | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Mikrobiologi terapan
  • Genetika bakteri
  • Bakteriologi

Abstrak

Lactobacillus reuteri adalah anggota dominan mikrobiota usus vertebrata, dan terjadi pada fermentasi makanan. Kehadiran stabil L. reuteri di penghuni pertama menyediakan kesempatan untuk mempelajari adaptasi simbion vertebrata ke habitat ekstra-usus. Studi ini mengevaluasi adaptasi ini dengan genomik komparatif dari 16 strain L. reuteri . Sebuah pohon filogenetik inti gen mengelompokkan L. reuteri menjadi 5 kelompok yang sesuai dengan garis keturunan yang diadaptasi oleh inang. Topologi pohon konten gen, yang mencakup gen aksesori, berbeda dari pohon filogenetik gen inti, menunjukkan bahwa diferensiasi L. reuteri dibentuk oleh kehilangan atau perolehan gen. Sekitar 10% dari genom inti (124 gen inti) berada di bawah seleksi positif. Dalam isolat penghuni pertama baris ketiga, 177 gen berada di bawah seleksi positif, terutama terkait dengan konversi energi dan metabolisme karbohidrat. Analisis daya saing L. reuteri di penghuni pertama mengungkapkan bahwa daya saing isolat penghuni pertama sama atau lebih tinggi jika dibandingkan dengan isolat hewan pengerat. Studi ini memberikan wawasan baru ke dalam adaptasi L. reuteri terhadap habitat makanan dan usus, menunjukkan bahwa kedua habitat ini memberikan tekanan selektif yang berbeda terkait dengan laju pertumbuhan dan metabolisme energi (karbohidrat).

pengantar

Lactobacillus reuteri bertahan dalam mikrobiota usus hewan vertebrata serta dalam fermentasi makanan 1, 2, 3, 4 . L. reuteri menjajah manusia dan hewan inang 2, 4 ; diferensiasi filogenetik dari strain L. reuteri yang berasal dari inang yang berbeda mencerminkan ko-evolusi L. reuteri dengan inang vertebrata 4 . Adaptasi evolusi ini membedakan spesies L. reuteri dalam garis keturunan filogenetik yang diadaptasi oleh inang terdiri dari isolat dari tikus (garis I dan III), manusia (garis II dan VI), babi (garis IV dan V), dan unggas (garis IV) 4, 5 .

L. reuteri juga terjadi pada industri penghuni pertama di industri 6 dan fermentasi sereal di iklim tropis 1, 7 . Penghuni pertama biasanya dipelihara dengan propagasi terus-menerus, suatu proses yang dengan cepat memilih mikrobiota yang paling kompetitif. Kriteria seleksi utama untuk fermentasi mikrobiota dalam ekosistem sereal adalah pertumbuhan cepat dalam substrat sereal, dan tahan asam 1, 8, 9, 10 . Isolat makanan dari L. reuteri cocok dengan garis keturunan yang diadaptasi oleh inang 11 dan mempertahankan sifat fisiologis spesifik inang 12, 13, 14, termasuk kemampuan untuk menjajah inang spesifik garis turunan 11, 15 .

Diferensiasi L. reuteri menjadi garis keturunan yang diadaptasi oleh inang menyiratkan bahwa habitat ekstra-usus tidak ada untuk sebagian besar evolusi spesies ini 14 . Namun, terjadinya L. reuteri di penghuni pertama habitat buatan memberikan kesempatan untuk mempelajari "adaptasi terbalik" dari simbion vertebrata ke habitat ekstra-usus. Penelitian ini menggunakan genomik komparatif L. reuteri untuk mengevaluasi faktor-faktor penentu genetik dari proses adaptasi atau seleksi ini. Sekuens genom dari strain usus L. reuteri diambil dari database publik dan dibandingkan dengan empat sekuens genom isolat penghuni pertama penghuni pertama. Sourdough mengisolasi L. reuteri LTH2584, TMW1.112 dan TMW1.656 berasal dari SER sourdough, penghuni pertama yang digunakan secara industri untuk produksi perbaiki kue 9 . Penghuni pertama ini telah dipertahankan oleh perbanyakan terus menerus sejak sekitar tahun 1970. L. reuteri LTH2584, TMW1.1112 dan TMW1.656 diisolasi dari penghuni pertama ini pada tahun 1988, 1994, dan 1998 6, 9 ; semua strain ini menghasilkan reutericyclin, turunan asam tetramik dengan aktivitas antimikroba terhadap bakteri Gram-positif 6, 16 . L. reuteri LTH5448 diisolasi dari penghuni pertama yang berbeda yang diproses di fasilitas yang sama pada tahun 2000 8, 17 ; strain ini tidak menghasilkan reutericyclin tetapi mempertahankan pulau genom reutericyclin dan resistensi reutericyclin 16, 17 . Analisis genomik komparatif mencakup analisis genom inti serta perolehan gen dan kejadian kehilangan gen yang dipelajari berdasarkan pan-genom. Kami juga melakukan analisis seleksi positif untuk gen inti dari seluruh spesies. Akhirnya, daya saing isolat sourdough L. reuteri dalam model sourdough dibandingkan dengan daya saing isolat usus terkait erat.

Hasil

Analisis filogenetik dari 16 strain L. reuteri berurutan termasuk 4 strain penghuni pertama

Analisis filogenetik dilakukan dengan semua sekuens genom L. reuteri yang tersedia , termasuk 4 sekuens genom isolat penghuni pertama 16 . Pohon filogenetik dibangun berdasarkan genom inti L. reuteri (Gambar 1A). Strain L. reuteri dikelompokkan ke dalam 5 kluster yang sesuai dengan garis keturunan yang diadaptasi oleh inang I (tikus), II (manusia), III (tikus), IV (babi) dan VI (unggas dan manusia). Strain penghuni pertama ditugasi ke garis keturunan I dan III yang diadaptasi oleh tikus, sesuai dengan analisis sebelumnya 11 . L. reuteri LTH5448 berkerumun dengan isolat hewan pengerat garis keturunan I; L. reuteri LTH2584, TWM1.112 dan TWM1.656 dikelompokkan ke dalam garis keturunan III bersama-sama dengan isolat hewan pengerat L. reuteri 100-23 dan mlc3. L. reuteri LTH2584, isolat sourdough SER yang diperoleh pada tahun 1988, lebih terkait dengan L. reuteri TWM1.656, yang diisolasi dari SER sourdough pada tahun 1998, dibandingkan dengan L. reuteri TWM1.112, yang diisolasi dari sourdough yang sama pada tahun 1994 6 .

Image

( A ) Pohon filogenetik berdasarkan gen inti. Angka Romawi menunjukkan garis keturunan yang diadaptasi oleh tuan rumah dari L. reuteri 4, 15 . Strain yang diisolasi dari penghuni pertama ditandai dengan warna merah. Hanya nilai bootstrap di atas 90 yang ditampilkan. Panjang cabang sebanding dengan jumlah substitusi per situs (lihat bilah skala). ( B ) Pohon genom berdasarkan matriks isi gen. Skala bar mewakili jarak genetik yang ditentukan oleh jarak Jaccard.

Gambar ukuran penuh

Pohon konten gen dibangun untuk mempelajari keuntungan dan kehilangan gen di antara strain ini. Di sini, strain yang berbagi lebih banyak gen dikelompokkan bersama (Gbr. 1B). Topologi pohon konten gen berbeda dari pohon filogenetik inti gen, menunjukkan hilangnya gen atau perolehan gen dengan transfer genetik horizontal. Tiga kelompok yang sesuai dengan garis II, IV dan VI tetap dipertahankan tetapi pohon konten gen menyoroti perbedaan antara strain di setiap kelompok. Sebagai contoh, empat silsilah II L. reuteri MM4-1A, MM2-3, DSM 20016 dan JCM 1112 tidak dipisahkan dalam pohon filogenetik genom inti tetapi dibedakan dalam dua kelompok dengan menghitung pohon isi gen (Gbr. 1B). L. reuteri DSM20016 dan JCM1112 berasal dari isolat asli yang sama, F275, dan perbedaan antara kedua strain ini dapat mencerminkan hilangnya gen selama perbanyakan di laboratorium 18 . Dua turunan III strain L. reuteri 100-23 dan mlc3 menunjukkan kandungan gen yang sangat berbeda. Hebatnya, keempat isolat penghuni pertama dikelompokkan bersama meskipun asal filogenetik mereka berbeda. L. reuteri LTH5448 lebih dekat terkait dengan L. reuteri LTH2584 daripada L. reuteri TWM1.112 dan TWM1.656.

Analisis komparatif dari strain sourdough

Untuk memahami bagaimana strain usus beradaptasi dengan penghuni pertama, dan untuk mengidentifikasi gen yang unik untuk isolat penghuni pertama, kesamaan kandungan gen dan ketidaksamaan dari strain ini dianalisis. L. reuteri LTH2584, TWM1.112, TWM1.656 dan 100-23 berbagi 1535 gen inti (Gbr. 2A); genom inti ini lebih tinggi daripada genom inti dari seluruh spesies 5, yang mencerminkan bahwa semua strain ini dikelompokkan dalam garis keturunan I. L. reuteri LTH2584 dan 100-23 memiliki gen yang lebih unik daripada L. reuteri TWM1.112 dan TWM1.656 ( Gambar 2A), yang berkontribusi pada posisi yang berbeda dari dua strain sebelumnya di pohon konten gen. Isolat pertama penghuni bersama 1523 gen inti (Gbr. 2B). Gen yang dibagi oleh semua isolat penghuni pertama tetapi tidak ada dalam strain lain termasuk pulau genomik reutericyclin yang dikodekan secara kromosom 16, sebuah rasemase aspartat diduga, protein LytTr-domain dengan fungsi pengaturan putatif, dan komponen dari transporter putatif ABC (Tabel 2). Gen yang hanya hadir dalam beberapa isolat penghuni pertama termasuk glikosiltransferase dengan fungsi diduga dalam glikosilasi protein (LTH2584 dan TMW1.656) dan putatif hidroksiglutarat dehidrogenase (LTH2584 dan TMW1.112) yang mengkatalisis penggunaan α-ketoglutarat sebagai akseptor elektron. 19 . Dari catatan, gen terdistribusi yang hadir dalam isolat penghuni pertama dari L. reuteri dan strain lainnya termasuk beberapa enzim diduga jalur asam shikimic untuk biosintesis asam amino aromatik (Tabel 2). Singkatnya, hanya gen yang mengkode biosintesis reutericyclin yang unik untuk semua isolat penghuni pertama reuteri .

Image

( A ) Diagram Venn nomor gen inti, terdistribusi dan unik antara turunan III strain L. reuteri LTH2584, TMW1.656, TMW1.112, dan 100-23. ( B ) Diagram Venn nomor gen inti, terdistribusi dan unik antara isolat penghuni pertama Lineage III L. reuteri LTH2584, TMW1.656, TMW1.112, dan isolat penghuni pertama Lineage I penghuni pertama L. reuteri LTH5448.

Gambar ukuran penuh

Tabel ukuran penuh

Seleksi positif dari gen inti berkontribusi terhadap adaptasi isolat penghuni pertama

Analisis seleksi positif bertujuan untuk mengidentifikasi tekanan selektif pada genom inti L. reuteri , dan untuk menentukan apakah sourdough dan strain usus mengalami tekanan selektif diferensial. Awalnya, pemilihan positif dianalisis di semua 16 strain L. reuteri . Sebanyak 124 gen inti berada di bawah seleksi positif (Gambar 3 dan Tabel S2), mewakili 10, 36% dari genom inti. Di antara gen yang berada di bawah seleksi positif, 22% berhubungan dengan metabolisme, termasuk transporter dan enzim untuk protein, asam amino, karbohidrat, dan konversi lipid. Beberapa gen di bawah seleksi positif didaftar sebagai "prediksi fungsional umum saja", tetapi sebagian besar fungsi prediksi ini juga terkait dengan fungsi metabolisme. Gen berlimpah lainnya di bawah seleksi positif berkaitan dengan replikasi, rekombinasi, dan perbaikan DNA. Ketika dibandingkan dengan komposisi gen inti, kategori COG "terjemahan, struktur ribosom dan biogenesis" dan "hanya prediksi fungsional umum" secara signifikan diperkaya di antara gen-gen di bawah seleksi positif di semua 16 genom inti L. reuteri (P = 0, 04, 0, 03, uji binomial satu sisi). Untuk 20 gen dalam kategori sebelumnya, 8 adalah gen yang terkait tRNA, 6 adalah gen protein ribosom, 3 adalah 23 pseudouridylate synthase spesifik RNA, 2 adalah gen faktor pemanjangan translasi, dan 1 adalah metilase gen faktor pelepasan rantai polipeptida (Tabel S2) ). Untuk kategori yang terakhir, sebagian besar fungsi yang diprediksi berhubungan dengan metabolisme. Sebagai contoh, 6 dari 21 adalah hidrolase, dan lainnya adalah beberapa reduktase, permease dan esterase.

Image

Model situs M2a dan model nolnya M1a dibandingkan dengan gen inang yang diseleksi positif pada seluruh spesies. Mode cabang-situs dan model nol dibandingkan dengan mempelajari gen di bawah seleksi positif di seluruh kategori COG. Kategori COG yang diperkaya secara signifikan di semua jenis spesies L. reuteri , atau dalam isolat penghuni pertama Lineage III ditandai oleh tanda bintang.

Gambar ukuran penuh

Untuk mengidentifikasi tekanan selektif yang bekerja pada isolat penghuni pertama, model situs cabang dan model nolnya digunakan untuk membandingkan kategori fungsi di bawah seleksi positif di cabang yang terdiri dari L. reuteri LTH2584, TWM1.112, dan TWM1.656 untuk semua lainnya. strain dalam spesies. Sebanyak 177 gen inti berada di bawah seleksi positif dalam isolat penghuni pertama III ini (Gambar 3 dan Tabel S3). Dari jumlah tersebut, 135 gen berada di bawah seleksi positif hanya di cabang ini dan 42 sisanya berada di bawah seleksi positif dalam isolat penghuni pertama serta sisa spesies. Dari gen inti di bawah seleksi positif di cabang penghuni pertama, 33% terkait dengan metabolisme (Gambar 3 dan Tabel S3). Tiga kategori COG secara signifikan diperkaya dalam isolat penghuni penghuni pertama garis keturunan III, "Produksi dan konversi energi" (P = 5, 9 * 10 −6 ), "Transportasi karbohidrat dan metabolisme" (P = 0, 03) dan "Mekanisme pertahanan" (P <2, 2 * 10 −16 ) (Gbr. 3). Contoh-contoh gen dalam kategori-kategori COG ini yang berada di bawah seleksi positif termasuk enzim-enzim metabolik kunci seperti maltosa fosforilase, dehidrogenase laktat, alkohol dehidrogenase, dan beberapa enzim transportasi gula (Tabel S3).

Daya saing strain L. reuteri di penghuni pertama: desain eksperimental

Untuk menentukan apakah adaptasi genom L. reuteri ke lingkungan penghuni pertama meningkatkan daya saing strain, percobaan kompetisi penghuni pertama dilakukan. Eksperimen kompetisi dalam back-slopped sourdoughs adalah alat sensitif untuk menentukan daya saing strain karena bahkan perbedaan kecil dalam daya saing menghasilkan dominasi strain yang lebih kompetitif setelah beberapa penyegaran 10, 20 . Eksperimen dilakukan dengan siklus fermentasi 1, 2, atau 3 hari. Pemilihan strain yang digunakan dalam percobaan kompetisi termasuk isolat penghuni pertama L. reuteri LTH5448, LTH2584, TMW1.112 dan TMW1.656; dan isolat hewan pengerat L. reuteri 100-23, mlc3 dan lpuph. Dua metode digunakan untuk mencapai kuantifikasi regangan spesifik L. reuteri di penghuni pertama. Ketika digunakan dalam kombinasi, qPCR dan jumlah lempeng diferensial memastikan bahwa mikrobiota penghuni pertama dalam semua sampel hanya terdiri dari strain yang digunakan sebagai inokulum, dan secara akurat mengukur kontribusi spesifik strain terhadap mikrobiota fermentasi.

Eksperimen kompetisi dievaluasi dengan perhitungan kebugaran relatif. Contoh untuk evaluasi percobaan kompetisi oleh qPCR dan jumlah sel yang dapat dibedakan ditunjukkan pada Gambar. 4; semua percobaan ditunjukkan pada Gambar S3 dari materi tambahan online. Jumlah sel dan pH penghuni pertama dipengaruhi oleh waktu fermentasi dan mikrobiota fermentasi. Siklus fermentasi tiga hari menghasilkan jumlah sel yang lebih rendah dan nilai pH yang lebih tinggi pada akhir fermentasi ketika glutamat-dekarboksilase positif L. reuteri LTH5448 adalah bagian dari mikrobiota fermentasi (Gambar S4, S5).

Image

Penghuni pertama diinokulasi dengan L. reuteri LTH2584 dan 100-23 (Panel A dan B) atau dengan L. reuteri LTH2584 dan LTH5448 (Panel C dan D) dan dipelihara dengan penumpukan secara terus menerus dengan 10% inokulum pada 10 siklus fermentasi dengan 1 d waktu inkubasi. Mikrobiota penghuni pertama dianalisis dengan jumlah lempeng diferensial (Panel A dan C) dan hasilnya dinyatakan sebagai proporsi log dari strain individu terhadap jumlah sel yang layak total. Penghuni pertama juga dianalisis dengan qPCR menargetkan urutan spesifik-regangan dan nomor salinan log DNA yang dikonversi ke jumlah sel menggunakan kurva kalibrasi spesifik-regangan (Panel B dan D). Hasil dinyatakan sebagai proporsi dari strain individu dengan jumlah sel total. Simbol mewakili strain L. reuteri LTH2584 (◼), LTH5448 (□) dan 100-23 (◯).

Gambar ukuran penuh

Daya saing strain L. reuteri di penghuni pertama

Daya saing isolat penghuni pertama L. reuteri LTH2584 dan LTH5448 secara substansial lebih tinggi bila dibandingkan dengan isolat hewan pengerat L. reuteri 100-23 (Gbr. 5). Perbedaan daya saing dengan L. reuteri peka-reuteriklin-sensitif L. reuteri setara dengan L. reuteri LTH2584 penghasil reutericyclin dan L. reuteri -negatif reutericyclin LTH5448. Untuk menentukan apakah peningkatan daya saing ini dipengaruhi oleh reutericyclin-produksi, percobaan kompetisi dilakukan antara L. reuteri TMW1.656 penghasil reutericyclin dan reutericyclin-negatif dan-sensitif L. reuteri TMW1.656Δ rtcN Δ rtcT 16 . L. reuteri TMW1.656 dan TMW1.656Δ rtcN Δ rtcT menunjukkan daya saing yang sebanding dan dipertahankan dalam jumlah sel yang kurang lebih sama selama 6 siklus fermentasi (Gbr. 6). Hasil ini menunjukkan bahwa produksi reutericyclin tidak secara substansial mempengaruhi daya saing strain L. reuteri di penghuni pertama.

Image

Kebugaran relatif strain dihitung dari jumlah sel diferensial (Panel A) dan dari qPCR dengan primer spesifik regangan (Panel B) dengan menggunakan persamaan

Image

, di mana x, y menunjukkan strain yang digunakan dalam kombinasi regangan biner, x F dan y F menunjukkan jumlah sel atau nomor salinan gen pada akhir setiap siklus fermentasi dan x 0 dan y 0 menunjukkan jumlah sel atau nomor salinan gen di mulai dari setiap siklus fermentasi. Kebugaran relatif dihitung untuk kombinasi regangan berikut: L. reuteri LTH2584 versus 100-23 (batang putih); L. reuteri LTH5448 versus 100-23 (batang abu-abu); L. reuteri LTH2584 versus LTH5448 (putih menetas); dan galur turunan I yang terdiri dari L. reuteri LTH2584, TMW1.112 dan TMW1.656 dibandingkan galur turunan III L. reuteri LTH5448 (abu-abu menetas). Enumerasi diferensial tidak mungkin untuk kombinasi regangan L. reuteri LTH5448 dan 100-23, oleh karena itu, hanya data qPCR yang ditampilkan untuk kombinasi regangan ini. Setiap kompetisi dilakukan dalam adonan dengan 10 siklus fermentasi yang masing-masing tumpuk setiap 1, 2 dan 3 siklus fermentasi. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dari percobaan yang dilakukan dalam rangkap dua dengan dua ulangan teknis.

Gambar ukuran penuh

Image

Rasio strain tipe liar dengan strain mutan ditentukan oleh analisis qPCR dengan primer spesifik strain. Hasil ditampilkan sebagai sarana ± standar deviasi dari percobaan independen rangkap tiga.

Gambar ukuran penuh

Eksperimen kompetisi antara isolat penghuni pertama dari L. reuteri mengungkapkan bahwa semua strain yang digunakan sebagai inokulum dipertahankan lebih dari 10 siklus fermentasi (Gambar S3 dari bahan tambahan online). Daya saing dari strain penghuni pertama mencerminkan efek dari sifat-sifat metabolisme spesifik garis keturunan pada daya saing di penghuni pertama, 10, 20 . Glutamat decarboxylase memediasi resistensi asam; Kehadiran enzim ini juga meningkatkan daya saing dalam penghuni pertama dengan waktu fermentasi yang lama 10 . Oleh karena itu, turunan strain I glutamat-dekarboksilase-negatif lebih kompetitif dalam penghuni pertama yang dipertahankan oleh siklus fermentasi pendek sedangkan glutamat-dekarboksilase galur positif III galur L. reuteri LTH5448 lebih kompetitif di sourdough yang dipertahankan dengan siklus 2 dan 3 siklus (Gbr. 5).

Diskusi

Penelitian ini menggunakan genomik komparatif untuk menunjukkan bahwa evolusi L. reuteri dibentuk oleh seleksi positif dari genom inti di samping keuntungan dan kerugian gen aksesori. Selain itu, identifikasi gen inti di bawah seleksi positif dan analisis daya saing di penghuni pertama menunjukkan bahwa isolat penghuni pertama dari L. reuteri telah beradaptasi dengan habitat baru, atau telah dipilih dari subset berbeda dari turunan garis keturunan hewan pengerat. Studi ini memberikan wawasan baru ke dalam adaptasi L. reuteri terhadap habitat makanan dan usus, menunjukkan bahwa kedua habitat ini memberikan tekanan selektif yang berbeda terkait dengan laju pertumbuhan dan metabolisme.

Analisis filogenetik gen inti mengkonfirmasi garis keturunan khusus inang

Analisis filogenetik gen inti dari 16 galur L. reuteri mengkonfirmasi diferensiasi menjadi garis keturunan spesifik inang 11 . Silsilah turunan III strain L. reuteri LTH2584, TWM1.112, dan TWM1.656 diisolasi dari penghuni pertama yang sama pada tahun 1988, 1994, dan 1998, masing-masing. Keterkaitan filogenetik dari strain ini menunjukkan bahwa isolat selanjutnya mungkin merupakan isolat dari organisme yang sama setelah 10 tahun adaptasi dengan fermentasi penghuni pertama [ 6] . Namun, kontaminasi berturut-turut dari sourdough yang sama dengan strain yang berbeda asal tikus adalah penjelasan alternatif untuk isolasi strain yang sangat terkait dari sourdough yang sama.

Peran produksi reutericyclin untuk daya saing di penghuni pertama

Produksi Reutericyclin dapat berkontribusi terhadap daya saing L. reuteri di penghuni pertama 3, 6 . Penelitian ini menunjukkan bahwa turunan sensitif reutericyclin dari L. reuteri TMW1.656 dan reutericyclin yang memproduksi strain tipe liar menunjukkan daya saing yang sebanding di penghuni pertama, menunjukkan bahwa keuntungan ekologis reutericyclin sekitar setara dengan biaya produksi reutericyclin 16, 21 . Cluster gen reutericyclin diperoleh dengan transfer gen horizontal oleh beberapa Lineage I dan Lineage III isolat penghuni pertama dari L. reuteri 6, 16 dan dengan demikian tidak mungkin untuk mewakili sifat metabolisme spesifik penghuni pertama.

Evolusi simbion usus L. reuteri dengan transfer gen horizontal dan seleksi positif

Evolusi patogen didorong oleh hilangnya gen, akuisisi gen dengan transfer gen horizontal, dan oleh seleksi positif genom inti 22, 23, 24 . Kontribusi relatif rekombinasi dan seleksi positif sangat tergantung pada spesies dan ekosistem. Hanya sedikit gen yang dilaporkan berada di bawah tekanan selektif positif dalam patogen Listeria monocytogenes 24 sementara masing-masing hingga 34% dan 92%, genom inti dipilih secara positif dalam garis keturunan spesifik dari genus Streptococcus dan Campylobacter 22, 23 yang diadaptasi secara inang. . Evolusi inang yang diadaptasi oleh usus simbion L. reuteri sebelumnya dikaitkan dengan hilangnya gen dan akuisisi gen-gen aksesori khusus garis keturunan 15 . Pengelompokan strain L. reuteri yang kongruen pada pohon filogenetik dan pohon konten gen menegaskan peran utama dari perolehan atau hilangnya sifat-sifat metabolik dan genetik spesifik inang dalam evolusi spesies 14, 15 . Penelitian ini juga menunjukkan bahwa seleksi positif dari genom inti membentuk evolusi L. reuteri . Ekspresi protein ribosom, rRNA dan faktor transkripsi lainnya diatur oleh tingkat pertumbuhan bakteri 25 dan kepadatan tinggi gen ribosom berkaitan dengan pertumbuhan cepat L. sanfranciscensis di penghuni pertama 26 . Seleksi positif dalam terjemahan kategori fungsional menunjukkan bahwa relung ekologi usus yang menampung L. reuteri mengerahkan tekanan selektif untuk pertumbuhan yang cepat. Proporsi genom inti yang berada di bawah seleksi positif dalam L. reuteri sesuai dengan proporsi yang sesuai dalam S. mutans 23 . S. mutans dan L. reuteri adalah organisme yang beradaptasi secara inang yang terkait secara filogenetik yang menjajah saluran usus bagian atas tetapi berbeda sehubungan dengan dampaknya pada inang. S. mutan adalah patogen dan L. reuteri dianggap sebagai probiotik tetapi kedua spesies tampaknya menggunakan strategi ekologi yang sebanding untuk kolonisasi dan kegigihan 16, 27 .

Membalikkan evolusi atau memilih L. reuteri di habitat ekstra-usus?

Bertahannya L. reuteri lebih dari 10 tahun dalam fermentasi penghuni pertama memberikan kesempatan unik untuk mempelajari adaptasi atau pemilihan simbion usus spesifik host untuk lingkungan ekstra-usus. Beberapa baris bukti menunjukkan bahwa isolat sourdough SER berbeda dari strain usus. Pertama, penghuni pertama mengisolasi gugus secara terpisah di pohon konten gen, menunjukkan bahwa transfer gen horizontal dan hilangnya gen berkaitan dengan transisi ke penghuni pertama 16 . Kedua, kategori fungsional "produksi dan konversi energi" dan "metabolisme karbohidrat", yang merupakan elemen kunci untuk daya saing di penghuni pertama 28, 29, secara signifikan diperkaya di antara gen yang dipilih secara positif dalam isolat SER. Ketiga, isolat penghuni pertama L. reuteri menunjukkan kebugaran relatif lebih tinggi di penghuni pertama dibandingkan dengan isolat tikus. L. reuteri LTH5448 juga mencapai proporsi jumlah sel yang tinggi dalam persaingan dengan isolat tikus L. reuteri mlc3 dan lpuph dalam percobaan dengan waktu fermentasi 2 hari (data tidak ditunjukkan). Namun demikian, perbedaan daya saing isolat hewan pengerat dan penghuni pertama lebih kecil daripada perbedaan antara masing-masing strain, yang mencerminkan keterkaitan antara hutan lambung tikus dan lingkungan penghuni pertama. Karena waktu antara kontaminasi penghuni pertama dengan L. reuteri dan isolasi dari strain tertentu tidak diketahui, tidak mungkin untuk membedakan apakah perbedaan spesifik dari isolat penghuni pertama mencerminkan seleksi untuk subset tertentu dari isolat hewan pengerat, atau "evolusi balik" dari simbionion pada fermentasi makanan.

Sebagai kesimpulan, penelitian ini menunjukkan bahwa hilangnya gen dan perolehan gen serta tekanan selektif pada genom inti mendorong evolusi L. reuteri . Hebatnya, kandungan gen isolat sourdough dari L. reuteri berbeda dari isolat usus, dan gen di bawah seleksi positif dalam strain sourdough termasuk maltosa fosforilase, alkohol dehidrogenase, dan laktat dehidrogenase, gen yang diketahui berkontribusi terhadap daya saing dalam fermentasi sereal. Studi ini meningkatkan pemahaman kita tentang adaptasi bakteri terhadap fermentasi makanan sebagai habitat buatan manusia evolusioner baru-baru ini. Ini juga akan meningkatkan kemampuan kita untuk menggunakan fermentasi makanan sebagai sistem model untuk ekosistem usus yang lebih kompleks 31 .

Metode

Strain, media dan kondisi pertumbuhan

Isolat penghuni pertama L. reuteri LTH2584, TMW1.112, TMW1.656 dan LTH5448 6, 9, 17 dan isolat hewan pengerat L. reuteri 100-23, mlc3, dan lpuph 32 ditumbuhkan secara anaerob pada suhu 37 ° C dalam mMRS 8 . Gula diautoklaf secara terpisah. Media padat mengandung tambahan 20 g agar per liter.

Penyelarasan dan filogenetik seluruh genom

Urutan genom dari 12 L. reuteri diambil dari Genbank (Tabel S1). Sekuens genom dari isolat penghuni pertama 16 dianotasi ulang pada server RAST 33 setelah ditutup dengan amplifikasi PCR dan sekuensing Sanger. Primer yang mengikat ke lokus ke atas dan ke bawah dari celah target dipilih setelah penyelarasan genom dengan Mauve 34, dan ditunjukkan pada Tabel S1. Sequencing dilakukan oleh layanan Macrogen Co. (Rockville, Maryland, USA).

Semua 16 genom selaras dengan Mugsy 35 . Blok homolog yang ada di masing-masing genom disatukan dengan skrip perl in-house. Wilayah yang paling tidak teratur dihilangkan dengan menggunakan Gblock 36 . Wilayah yang berantakan mencakup situs yang mengandung setidaknya satu celah, dan situs yang terlalu berbeda karena mereka mungkin tidak homolog atau mungkin jenuh oleh banyak pergantian. Ukuran genom inti L. reuteri adalah sekitar 1, 2 Mbp. Pohon genom inti kemungkinan maksimum dibangun menggunakan RaxML 37 . Pohon itu disimpulkan di bawah model substitusi nukleotida (GTR) umum waktu-reversibel, dengan heterogenitas laju terdistribusi-gamma dari empat kategori laju (+ Γ4) (Γ4). Nilai dukungan Bootstrap dihitung dari 1000 ulangan.

Pengelompokan gen dan konstruksi pohon konten gen

Urutan protein lebih lama dari 50 asam amino dari semua genom digabungkan dan dicari menggunakan BLAST dengan gaya all-menentang-semua dengan parameter default. Urutan protein dengan identitas dan cakupan di atas 70% dikelompokkan ke dalam keluarga menggunakan program atau 38 . Nilai inflasi 2 digunakan untuk pengelompokan MCL. Gen inti didefinisikan sebagai gen yang dimiliki oleh semua dari 16 strain; gen terdistribusi sebagai gen yang dimiliki oleh 2 hingga 15 strain, dan gen unik karena hanya terdapat dalam satu strain.

Sebuah matriks dari ada atau tidak adanya masing-masing gen untuk setiap genom telah dibuat. Jarak perbedaan antara genom berdasarkan konten gen (data biner untuk ada atau tidaknya masing-masing keluarga protein) diukur dengan satu minus koefisien Jaccard (jarak Jaccard) dihitung dari matriks ini 39 . Pohon konten gen dibangun menggunakan metode hierarkis pengelompokan (UPGMA) berdasarkan jarak ini dengan MEGA 40 .

Analisis seleksi positif

Untuk setiap kelompok gen inti salinan tunggal, urutan protein diselaraskan dengan MUSCLE 41 . Penjajaran ini diterjemahkan secara terbalik ke penjajaran berbasis kodon oleh PAL2NAL 42 . Analisis seleksi positif berdasarkan setiap keberpihakan ini dilakukan oleh CODEML diimplementasikan dalam PAML 43 . Rasio substitusi nonsynonim (asam amino) sinonim (diam) (ω), dengan ω = 1, 1 masing-masing menunjukkan pemilihan netral, pemurnian, atau positif. Seleksi positif dianalisis pada setiap keluarga gen inti yang dibagi oleh semua 16 L. reuteri isolat menggunakan model situs M1a dan M2a 44, 45 . Model M1a (hampir netral) memungkinkan semua situs untuk memurnikan seleksi (ω 0 <1) atau seleksi netral (ω 0 = 1); model M2a memungkinkan semua situs menjadi pilihan positif (ω 0 > 1). Uji kemungkinan rasio (LRT) dilakukan untuk menyimpulkan terjadinya situs tunduk pada tekanan selektif positif melalui membandingkan M1a terhadap M2a. Model cabang-situs dan model nol satu-rasio digunakan untuk menganalisis seleksi positif di cabang L. reuteri LTH2584 / TWM1.112 / TWM1.656. Model cabang-situs memungkinkan ω bervariasi di antara lokasi dalam protein dan lintas cabang pada pohon dan bertujuan untuk mendeteksi seleksi positif yang memengaruhi beberapa situs di sepanjang garis keturunan tertentu (disebut cabang latar depan) 46 . Dua model digunakan, model nol tidak memungkinkan seleksi positif untuk cabang latar depan, dan model alternatif mengasumsikan bahwa cabang latar depan mungkin memiliki beberapa situs di bawah seleksi positif. Untuk model alternatif, tiga kelas ω (dN / dS) didefinisikan: ω 0 <1, ω 1 = 1 dan ω 2 ≥ 1, sedangkan dalam model nol, ω 2 ditetapkan ke 1. Tes rasio kemungkinan (1) LRT) dilakukan untuk menyimpulkan tekanan selektif positif di cabang L. reuteri LTH2584 / TWM1.112 / TWM1.656 melalui membandingkan hasil dari dua model ini. Statistik LRT (dua kali perbedaan log-likelihood antara null dan model alternatif) dibandingkan dengan distribusi chi-square dengan 2 derajat kebebasan untuk M2a vs M1a, dan satu derajat kebebasan untuk model situs cabang vs model model nol.

Untuk Clusters of Orthologous Groups of protein (COG) analisis, kami membangun database COG lokal 47, dan kemudian menjalankan rpsblast menggunakan set urutan yang disebutkan di atas sebagai permintaan. Kami fokus pada tiga hit teratas dari setiap perataan dan menghitung setiap kategori untuk perbandingan menggunakan skrip Perl in-house.

Daya saing L. reuteri di penghuni pertama: desain eksperimental

Ketekunan strain dianalisis dalam fermentasi sourdough rye-slopped kembali; Percobaan dilakukan dengan waktu fermentasi 1, 2, dan 3 hari. Eksperimen kompetisi dilakukan dengan enam kombinasi regangan; penghuni pertama diinokulasi dengan L. reuteri LTH2584 dan 100-23; L. reuteri LTH5448 dan 100-23; L. reuteri LTH5448 dan mlc3; L. reuteri LTH5448 dan lpuph; L. reuteri LTH2584 dan LTH5448; atau L. reuteri LTH2584, TMW1.112, TMW1.656, dan LTH5448.

Persiapan penghuni pertama dan penghitungan diferensial jumlah sel

Eksperimen kompetisi di penghuni pertama dilakukan pada dasarnya seperti yang dijelaskan 10 . Singkatnya, penghuni pertama dipersiapkan dengan mencampur 10 g tepung gandum dengan 10 ml air keran yang diautoklaf dan 1 ml inokulum bakteri. Untuk kombinasi regangan biner dan kuaterner, masing-masing 0, 5 dan 0, 25 mL suspensi sel dari strain individu dicampur untuk memperoleh 1 mL koktail bakteri sebagai inokulum. Adonan difermentasi pada suhu 37 ° C selama 1, 2, atau 3 hari dan diaduk kembali selama 10 siklus fermentasi. Pada setiap langkah back-slopping, 1 g penghuni pertama dari siklus sebelumnya dicampur dengan 9, 5 g tepung rye segar dan 9, 5 ml air keran otomatis. Eksperimen kompetisi dilakukan dalam rangkap dua dan analisis dilakukan dengan dua ulangan teknis.

Pada setiap siklus fermentasi, penghuni pertama dianalisis sehubungan dengan pH, jumlah sel diferensial, dan qPCR dengan primer spesifik regangan. Jumlah sel yang layak dihitung dengan pelapisan permukaan dengan pengenceran yang sesuai pada agar mMRS. Strain individu dibedakan berdasarkan morfologi koloni. Pencacahan diferensial dimungkinkan untuk kombinasi regangan biner L. reuteri LTH2584 vs 100-23, L. reuteri LTH2584 vs LTH5448, L. reuteri LTH5448 vs mlc3, dan L. reuteri LTH5448 vs lpuph, tetapi tidak untuk L. reuteri LTH5448 vs 100-23. Dalam kombinasi strain kuaterner, total gabungan L. reuteri LTH2584, TMW1.112 dan TMW1.656 dibedakan dari L. reuteri LTH5448.

Analisis mikrobiota penghuni pertama oleh qPCR

Total DNA diisolasi dari penghuni pertama 48 dan jumlah salinan gen L. reuteri dikuantifikasi dengan qPCR spesifik-regangan. Primer spesifik-regangan tercantum pada Tabel 1. Kurva standar untuk mengkonversi siklus ambang deteksi ke nomor salinan gen ditetapkan dengan analisis 10 kali lipat pengenceran serial DNA target konsentrasi yang diketahui. Primer spesifik-regangan untuk kuantifikasi spesifik regangan ditunjukkan pada Tabel 1.

Tabel ukuran penuh

Kurva kalibrasi untuk mengubah nomor salinan gen ke jumlah sel di penghuni pertama adalah kurva Kalibrasi untuk mengubah nomor salinan gen ke jumlah sel di penghuni pertama didirikan dengan penghuni pertama yang difermentasi dengan strain tunggal. Sampel dicampur dengan 2 volume saline steril, dan secara serial diencerkan dengan saline. Dari masing-masing pengenceran, jumlah sel ditentukan oleh pengenceran lebih lanjut dan pelapisan permukaan dan nomor salinan gen dikuantifikasi oleh qPCR seperti dijelaskan di atas. Kurva kalibrasi dibentuk dalam rangkap dua setelah 1 dan 3 hari fermentasi (Gambar S2).

Analisis PCR kuantitatif dilakukan dalam rangkap dua dalam pelat reaksi MicroAmp Fast Optical 96-well yang ditutup dengan MicroAmp Optical Adhesive Film (Applied Biosystems, Burlington, ON, Kanada). Campuran reaksi PCR terdiri dari 12, 5 μl Fast Master Green SYBR Green (Applied Biosystems), 0, 4 μM dari masing-masing primer (Tabel S1), 2 μl DNA templat dan air Milli-Q steril hingga volume akhir 25 μl. Kurva leleh diperoleh dengan peningkatan bertahap suhu 60-95 ° C pada 0, 05 ° C / s) dan data kurva leleh dianalisis untuk memverifikasi amplifikasi produk PCR yang ditargetkan dengan benar. Batas deteksi adalah 10 2 salinan angka / g penghuni pertama untuk primer strain-spesifik.

Daya saing strain isogenik reutericyclin-positif dan reutericyclin-negatif dan reutericyclin-sensitif dari L. reuteri

Eksperimen kompetisi antara strain tipe liar positif-reuteriklin L. reuteri TMW1.656 dan mutan yang rentan reutericyclin L. reuteri TMW1.656 ΔrtcNΔrtcT 16 dilakukan menggunakan tepung terigu putih dengan hasil adonan 200. Penghuni pertama diperbanyak setiap 24 jam dengan 1% inokulum selama 5 hari. Rasio tipe liar untuk strain mutan pada akhir setiap siklus fermentasi ditentukan oleh qPCR dengan primer yang tercantum dalam Tabel 1.

Perhitungan kebugaran relatif strain L. reuteri di penghuni pertama

Jumlah sel diferensial dan jumlah salinan gen spesifik-regangan digunakan untuk menghitung kebugaran relatif dari masing-masing strain L. reuteri . Kebugaran (w) regangan x relatif terhadap regangan y dihitung berdasarkan persamaan yang diturunkan dari 49 :

Image

di mana x 0 dan y 0 menunjukkan regangan kepadatan sel spesifik atau nomor salinan gen pada awal setiap siklus fermentasi dan x F dan y F adalah kepadatan sel pada akhir setiap siklus fermentasi. Untuk setiap percobaan kompetisi, kebugaran relatif diplot sebagai rata-rata 20 ulangan (percobaan ulangan dengan 10 siklus fermentasi masing-masing).

Informasi tambahan

Dokumen Word

  1. 1.

    Informasi tambahan

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.