Konsentrasi plastisitas sinaptik yang bergantung pada memori dari rangkaian rasa mengatur kemotaksis konsentrasi garam pada caenorhabditis elegans | komunikasi alam

Konsentrasi plastisitas sinaptik yang bergantung pada memori dari rangkaian rasa mengatur kemotaksis konsentrasi garam pada caenorhabditis elegans | komunikasi alam

Anonim

Subjek

  • Perilaku binatang
  • Sistem gosok
  • Belajar dan daya ingat

Abstrak

Sangat kurang dipahami bagaimana sistem sensorik menghafal intensitas stimulus sensorik, membandingkannya dengan stimulus sensor baru, dan mengatur perilaku orientasi berdasarkan memori. Di sini kami melaporkan bahwa elegans Caenorhabditis menghafal konsentrasi garam lingkungan selama budidaya dan menunjukkan preferensi perilaku yang kuat untuk konsentrasi ini. Neuron gustatory amphid sisi kanan yang dikenal sebagai ASER, merasakan penurunan konsentrasi garam, dan informasi ini ditransmisikan ke interneuron AIB postsinaptik hanya dalam kisaran konsentrasi garam yang lebih rendah daripada konsentrasi budidaya. Dalam kisaran ini, hewan bermigrasi ke konsentrasi yang lebih tinggi dengan mempromosikan perilaku berbalik pada penurunan konsentrasi garam. Pengamatan ini menyediakan mekanisme untuk menyesuaikan perilaku orientasi berdasarkan memori stimulus sensorik menggunakan sirkuit saraf sederhana.

pengantar

Semua hewan hidup diberkahi dengan kemampuan untuk mencari kondisi sekitar yang optimal. Perilaku seperti ini membutuhkan menghafal intensitas stimulus sensorik yang terkait dengan kondisi yang menguntungkan, mengenali perubahan spatio-temporal dari intensitas stimulus dalam kondisi saat ini, membandingkannya dengan intensitas stimulus yang dihafal dan mengatur output motor untuk menghasilkan gerakan menuju arah yang lebih disukai. Namun, dalam kebanyakan sistem sensorik bagaimana intensitas stimulus dihafal dan bagaimana perilaku orientasi yang berbeda dihasilkan tergantung pada memori telah dieksplorasi dengan buruk.

Natrium klorida diidentifikasi sebagai kemoattractan untuk C. elegans 1 . Berdasarkan pandangan ini mekanisme kemotaksis garam telah diperiksa selama beberapa dekade. Amphid taste neuron ASE, yang terdiri dari dua neuron simetris morfologis di sebelah kiri (ASEL) dan kanan (ASER), memiliki peran utama dalam kemotaksis terhadap NaCl dan garam anorganik lainnya 2, 3, 4 . Eksperimen pencitraan kalsium menunjukkan bahwa neuron-neuron ini asimetris secara fungsional: ASER didepolarisasi oleh penurunan konsentrasi garam, sementara ASEL merespons peningkatan 5 . Karena aktivasi ASER dan ASEL masing-masing mempromosikan pengalihan belokan dan gerak maju, disarankan bahwa neuron kanan dan kiri memiliki peran yang berbeda tetapi bertindak bersamaan untuk memigrasi gradien garam 5 . Melalui jalur penelitian lain tentang perilaku migrasi, dua mekanisme perilaku berbeda yang mengarahkan hewan ke konsentrasi garam yang lebih tinggi telah dikarakterisasi sejauh ini (lihat di bawah) 6, 7 . Meskipun set pengetahuan ini, sifat fisiologis dan mekanistik dari aliran informasi untuk kemotaksis garam hilir neuron sensorik belum jelas, karena ASEL dan ASER membentuk sinapsis ke target yang tumpang tindih (Gambar 1a).

Image

(A) Diagram ASE neuron penginderaan garam dan interneuron hilir. Panah tebal menunjukkan koneksi dengan lebih dari lima sinapsis 19 . ( B ) Prosedur untuk uji kemotaksis garam yang digunakan dalam penelitian ini. N menunjukkan jumlah hewan di wilayah yang ditunjukkan dalam tanda kurung. ( c ) Lintasan representatif hewan tipe liar yang dibudidayakan pada konsentrasi NaCl yang berbeda dan diuji pada lempeng dengan gradien NaCl dari 35 hingga 95 mM. Grafik menunjukkan posisi persimpangan antara lintasan dan punggungan gradien garam (garis putus-putus kuning). Berarti ± sem; n = 4 tes. ( D ) Chemotaxis tipe liar di pelat uji mirip dengan di b, kanan, dengan latar belakang konsentrasi NaCl yang berbeda. Gradien garam dihasilkan dengan blok agar yang mengandung 150 mM (untuk konsentrasi lebih tinggi) dan 0 mM (untuk konsentrasi lebih rendah) NaCl, yang belum diubah dari yang digunakan dalam c (lihat Metode untuk perincian). Berarti ± sem; n = 6 tes. ( e ) Perubahan konsentrasi penanaman yang disukai. Hewan tipe liar dibudidayakan pada 25 atau 100 mM NaCl dan dipindahkan ke 100 mM atau 25 mM, secara timbal balik, atau disimpan pada konsentrasi yang sama. Tes Chemotaxis dilakukan pada titik waktu yang ditunjukkan menggunakan pelat uji standar seperti pada c . 'naif' mewakili binatang sebelum dipindahkan. Berarti ± sem; n = 4 tes.

Gambar ukuran penuh

Sementara itu, kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa memasangkan kelaparan dengan paparan NaCl menyebabkan pembelajaran penghindaran garam pada C. elegans 8 . Komponen jalur pensinyalan insulin, reseptor insulin DAF-2, AGE-1 phosphoinositide 3-kinase dan AKT-1 AKT kinase, diperlukan di ASER untuk pembelajaran ini 9 . Aktivasi jalur pensinyalan Gq / DAG / PKC yang terdiri dari EGL-30 Gq, diacylglycerol (DAG) dan PKC-1 (juga dikenal sebagai TTX-4), suatu isoform protein kinase C-ε yang diduga bertindak di hilir Gq, memusuhi pensinyalan insulin dan meningkatkan daya tarik garam 10 . Modulasi serupa kemandirian bergantung pada garam kemotaxis yang disebut plastisitas gustatory juga telah dilaporkan. Dalam perilaku ini, ASH neuron, sepasang neuron sensorik polymodal yang mendorong penghindaran osmolaritas tinggi 12, 13, memiliki peran dalam penghindaran garam 11, 14 . Dengan demikian, kemotaksis menjadi garam dalam C. elegans dapat diubah oleh pengalaman kelaparan sebelumnya.

Di sini kami memberikan bukti bahwa chemotaxis terhadap NaCl pada hewan yang diberi makan dengan baik juga merupakan perilaku yang dipelajari dalam C. elegans . Hewan yang diberi makan dengan baik memigrasi gradien garam ke atas dan ke bawah menuju konsentrasi budidaya sebelumnya. Mekanisme saraf yang menghasilkan pengalihan bias migrasi yang bergantung pada pengalaman disediakan.

Hasil

C. elegans tertarik pada konsentrasi penanaman NaCl

Untuk mengamati konsentrasi garam yang dipilih dari C. elegans , kami mengembangkan uji perilaku di mana hewan dewasa dibudidayakan di bawah konsentrasi NaCl yang ditentukan dan perilaku mereka kemudian diperiksa pada gradien NaCl pada rentang konsentrasi yang luas, biasanya berkisar antara 35 hingga 95 mM ( Gambar. 1b dan Gambar Tambahan. S1). Kami menemukan bahwa C. elegans tipe liar bermigrasi ke konsentrasi garam di mana ia telah dibudidayakan dengan makanan yang cukup (Gambar 1c, d, Gambar Tambahan S2, dan lihat Metode untuk rincian). Preferensi untuk konsentrasi garam tertentu adalah plastik dan hewan beradaptasi dengan konsentrasi baru dalam beberapa jam (Gbr. 1e). Menariknya, hewan menghindari konsentrasi garam, yang telah mereka alami di bawah kondisi kelaparan (Gambar Tambahan S3a-c). Dengan demikian, kemotaksis garam C. elegans dipengaruhi oleh konsentrasi garam dari penanaman preassay ( kultus ) dan lingkungan saat ini pada pelat uji ( uji C ). Hewan yang diberi makan bergerak ke atas gradien garam ketika uji C > C dan menurunkan gradien ketika uji C < C ; hubungan ini terbalik pada hewan yang kelaparan.

Migrasi ke konsentrasi yang lebih rendah tidak mungkin menjadi perilaku penghindaran osmotik karena konsentrasi garam yang digunakan dalam penelitian ini jauh lebih rendah daripada yang membangkitkan penghindaran osmotik 11, penambahan osmolytes ke dalam piring budidaya di tempat NaCl tidak mempengaruhi kemotaksis terhadap NaCl (Tambahan Gambar. S4a), dan kemotaksis terhadap kultus dipertahankan dalam mutan yang rusak dalam respon osmotik, osm-9 dan osm-10 (saluran TRPV (transient receptor vanilloid potential) dan protein baru yang dikonservasi pada spesies Caenorhabditis , masing-masing, keduanya diperlukan untuk pensinyalan osmosensori pada neuron ASH) (Gambar Tambahan. S4b). Selain itu, perubahan perilaku bukan karena efek spesifik pada kemosensasi atau motilitas keseluruhan karena kemotaksis terhadap aroma tidak dipengaruhi oleh kultus C (Tambahan Gambar. S5).

Bias balik diatur oleh riwayat konsentrasi garam

Dua strategi perilaku diketahui untuk mengatur gerak C. elegans selama kemotaksis garam. Yang pertama adalah klinokinesis, juga disebut strategi pirouette, di mana migrasi diatur oleh bias acak berjalan 6 . Dalam mekanisme ini, frekuensi putaran redirect, atau pirouette, meningkat ketika turunan waktu konsentrasi garam negatif, sedangkan gerak menuju konsentrasi yang lebih tinggi ditopang oleh penekanan belokan (Gbr. 2a, kiri). Mekanisme kedua adalah klinotaxis, juga disebut mekanisme baling-baling cuaca, di mana hewan perlahan melengkung ke arah yang lebih disukai (Gbr. 2a, kanan) 7 . Kedua mekanisme ini pada awalnya menyumbang migrasi keseluruhan ke konsentrasi garam yang lebih tinggi dalam format chemotaxis standar.

Image

( a ) Strategi perilaku hewan dalam kemotaxis: klinokinesis (kiri) dan klinotaxis (kanan). ( B ) Bias klinokinesis (kiri) dan klinotaxis (kanan) masing-masing diwakili oleh indeks pirouette dan indeks baling-baling cuaca. Indeks positif menunjukkan bias migrasi menuju konsentrasi garam yang lebih tinggi dan indeks negatif menunjukkan migrasi menuju konsentrasi yang lebih rendah. Hasil dari hewan tipe liar dan ASER-ablated. n ≥9 pengujian; Uji dua sisi. ( c ) Probabilitas distribusi hewan selama 250-500 detik dari tes kemotaksis. Baris teratas, hasil dari hewan asli; baris kedua, simulasi hanya berdasarkan mekanisme klinokinesis; baris ketiga, simulasi hanya berdasarkan mekanisme klinotaxis; baris bawah, simulasi berdasarkan kedua mekanisme. Kolom kiri, hasil hewan dipelihara pada 25 mM NaCl; kolom tengah, 50 mM; kolom kanan, 100 mM.

Gambar ukuran penuh

Berdasarkan pengamatan kami bahwa C. elegans sebenarnya dapat bermigrasi ke arah konsentrasi garam yang lebih tinggi atau lebih rendah tergantung pada hubungan antara kultus C dan uji C , kami secara kuantitatif menganalisis perilaku hewan dan bertanya bagaimana chemotaxis ke kultus diatur oleh dua mekanisme ini, atau dengan mekanisme baru seperti orthotaxis, di mana kecepatan hewan diatur oleh intensitas stimulus 15 . Ketika konsentrasi garam budidaya lebih tinggi dari konsentrasi uji (uji C > C ), klinokinesis bias mendorong perpindahan ke konsentrasi yang lebih tinggi: hewan menunjukkan frekuensi pirouette yang lebih tinggi jika konsentrasi garam menurun (d C / dt <0), tetapi mereka menunjukkan lebih rendah frekuensi pirouette jika konsentrasi garam meningkat (d C / dt > 0). Di sisi lain, ketika uji C < C , bias klinokinesis terbalik (Gambar 2b dan Gambar Tambahan. S6a, panel kiri). Pembalikan strategi perilaku juga ditemukan di klinotaxis. Hewan menunjukkan klinotaxis positif ketika uji C > C uji dan klinotaxis negatif ketika uji C < C (Gambar 2b dan Gambar Tambahan. S6a, panel kanan). Ketika uji C = C , tidak ada bias dalam klinokinesis tetapi klinotaxis negatif yang diamati (Gambar 2b dan Gambar Tambahan. S6a). Tidak ada perubahan yang jelas dalam kecepatan gerak bersama dengan konsentrasi garam terlepas dari kultus C (Gambar Tambahan S6d), menunjukkan bahwa kontribusi orthotaxis minimal, jika ada, dalam uji kemotaksis saat ini. Simulasi komputer berdasarkan hubungan-hubungan ini menunjukkan bahwa klinokinesis memiliki efek yang lebih besar daripada klinotaxis dalam pengujian ini, sementara perilakunya paling baik direproduksi dengan kedua mekanisme yang bekerja bersama (Gbr. 2c). Hasil ini menunjukkan bahwa hewan yang diberi makan bermigrasi ke arah konsentrasi yang lebih tinggi dan lebih rendah dengan membalikkan output motor tergantung pada konsentrasi garam relatif antara tes C dan C.

Kelaparan juga mengubah sifat klinokinesis dan klinotaxis. Bias klinisokinesis kira-kira terbalik setelah 6 jam kelaparan (Gambar Tambahan. S3d dan S6b). Oleh karena itu, bias berubah tergantung pada konsentrasi garam relatif antara uji C dan C , tetapi dalam arah yang berlawanan dibandingkan dengan kondisi makan. Bias klinotaxis sangat berkurang tetapi tidak terbalik setelah kelaparan (Gambar Tambahan S3d dan S6b). Hasil ini secara kualitatif mirip dengan pengamatan sebelumnya pada penghindaran garam tergantung kelaparan 7, dengan beberapa perbedaan kecil mungkin karena perbedaan dalam kondisi pengujian.

Peran penting ASER dalam kemotaxis yang bergantung pada konsentrasi

Kami bertanya neuron mana yang bertanggung jawab atas perilaku tersebut (Gambar 3a). Kehilangan faktor transkripsi che-1 , yang diperlukan untuk diferensiasi neuron ASE 16, menyebabkan hilangnya kemotaksis penuh pada kultus C. Inaktivasi fungsional atau ablasi genetik ASER 4 mengakibatkan lemahnya daya tarik positif terhadap garam di mana plastisitas yang bergantung pada kultus hilang ( gcy-22 dan ASER (-) pada Gambar 3a). Sesuai dengan ini, bias klinokinesis sedikit positif pada setiap konsentrasi budidaya, sedangkan bias klinotaxis benar-benar hilang pada hewan yang mengalami abrasi ASER (Gambar 2b dan Gambar Tambahan. S6c). Di sisi lain, ablasi ASEL melemahkan bias perilaku, tetapi hewan-hewan masih bermigrasi gradien garam naik dan turun (ASEL (-) pada Gambar. 3a). Hasil ini menunjukkan bahwa ASER paling penting untuk migrasi gradien garam naik dan turun menuju kultus C.

Image

( a ) Chemotaxis dari mutan ASE. ASER tidak responsif terhadap garam pada mutan-mutan ASER yang diekspresikan guanylyl cyclase gcy-22 (ref. 4). Lihat teks utama untuk strain lainnya. Berarti ± sem; n ≥6 pengujian; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, berbeda dari tipe liar yang dibudidayakan pada kondisi yang sama; Tes Dunnett. ( B ) Chemotaxis dari dyf-11 dan garis penyelamatan spesifik selnya. Berarti ± sem; n = 10 tes; (**) P <0, 001, berbeda dari tipe liar dengan uji dua sisi; (+) P <0, 01, (++) P <0, 001, berbeda dari kontrol dyf-11 dengan uji Dunnett. ( c ) Stimulasi penyimpang ASER mengubah konsentrasi garam yang disukai. Tes kemotaksis dilakukan dengan atau tanpa 5 μM capsaicin yang termasuk dalam pelat uji. Berarti ± sem; n ≥6 pengujian; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001; Tes Tukey.

Gambar ukuran penuh

Kami selanjutnya memeriksa apakah ASER cukup untuk perilaku dengan pemulihan input sensorik spesifik sel (Gambar 3b). dyf-11 mengkodekan komponen transportasi silia, dan karena tidak adanya silia sensorik, mutan dyf-11 sangat terganggu dalam bahan kimia penginderaan 17 . Ekspresi spesifik sel dari dyf-11 DNA komplementer (cDNA) dalam ASER yang sepenuhnya diselamatkan dari chemotaxis menjadi C cult . Secara kolektif, kami menyimpulkan bahwa input ke ASER diperlukan dan cukup untuk perilaku: neuron sensorik tunggal ASER dapat menginstruksikan migrasi hewan baik naik turun gradien garam.

Jika ASER neuron saja dapat mendorong kemotaksis ke kultus C , memodulasi aktivitas ASER harus menggeser preferensi konsentrasi garam. Faktanya, aktivasi berkelanjutan ASER selama uji kemotaksis oleh TRPV1 (reseptor transien potensial reseptor vanilloid 1, juga dikenal sebagai VR1), saluran kation mamalia yang dibuka oleh capsaicin 5, 18, mengubah konsentrasi garam yang disukai hewan terhadap konsentrasi garam yang lebih tinggi ( Gbr. 3c).

Plastisitas sinaptik terjadi antara ASER dan AIB

Bagaimana ASER dan sirkuit neural hilirnya menyandikan konsentrasi garam yang dihafal dan menghasilkan perilaku dua arah tergantung pada pengalaman sebelumnya? Kami menjawab pertanyaan ini dengan memeriksa apakah respons neuron-neuron ini berubah tergantung pada kultus C , melalui pemantauan dinamika kalsium intraseluler menggunakan indikator kalsium G-CaMP 18 . Respons ASER terhadap perubahan konsentrasi garam dari 50 menjadi 25 mM lebih besar pada hewan yang dibudidayakan pada konsentrasi garam yang lebih tinggi, dalam kisaran kultus C antara 0 dan 50 mM, tetapi besarnya respon jenuh pada kultus C yang lebih tinggi (Gambar 4a dan Tabel Tambahan S1). Kami selanjutnya memeriksa respon interneuron AIB, yang langsung dipersarafi oleh ASER (Gambar 1a) 19 . Kami baru-baru ini menemukan bahwa neuron AIB diaktifkan oleh pengurangan konsentrasi garam dan responsnya berkurang setelah paparan garam yang berkepanjangan di bawah kelaparan 18 . Dalam pengujian saat ini, NaCl down-step dari 50 hingga 25 mM mengaktifkan AIB setelah kultivasi pada 50 mM atau lebih tinggi, tetapi tidak setelah kultivasi pada 25 mM atau lebih rendah (Gambar 4b). Hasil ini, bersama dengan percobaan menggunakan konsentrasi stimulus yang berbeda (Gambar Tambahan. S7 dan Tabel Tambahan S1), menunjukkan bahwa besarnya respon kalsium dimodulasi oleh pengalaman garam di ASER dan AIB. ASER menunjukkan tanggapan bertingkat menurut C Cult . Pengecualian adalah kasus di mana NaCl sepenuhnya dihapus (dari 25 hingga 0 mM) dan yang disebutkan di atas ( Kultus ≥50 mM pada Gambar. 4a). Dalam kondisi ini, intensitas fluoresensi mungkin tidak sebanding dengan respon seluler. Di sisi lain, AIB merespons secara mencolok ketika kultus C lebih tinggi dari konsentrasi stimulus, tetapi mereka tidak merespons ketika kultus C lebih rendah dari konsentrasi stimulus. Respons neuron ini paralel dengan perilaku: hewan merespons penurunan konsentrasi garam dengan meningkatkan belok hanya ketika uji C > C (Tambahan Gambar. S6a).

Image

( a, b ) Respons kalsium ASER ( a ) dan AIB ( b ) hewan tipe liar ke langkah turun NaCl dari 50 hingga 25 mM (jejak). Perubahan fluoresensi rata-rata selama 5 detik (ASER) atau 25 detik (AIB) setelah stimulasi (grafik batang). Daerah yang diarsir di sekitar kurva respons dan bilah kesalahan mewakili sem. Jumlah hewan yang diuji untuk setiap kondisi ditunjukkan dalam tanda kurung. Statistik untuk tanggapan ASER pada panel a adalah: (*) P <0, 01; Tes Tukey; Rinciannya ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1. Statistik untuk respons AIB pada panel b adalah: (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, (NS) tidak signifikan; Mann-Whitney U -test dibandingkan dengan prestimulation. ( c - e ) Perilaku berputar yang ditimbulkan oleh stimulasi optik ASER ( c, d ) atau AIB ( e ) oleh ChR2. AIB interneuron dihilangkan pada d . Hewan dibudidayakan pada kondisi yang ditunjukkan dan diterangi oleh cahaya biru (garis vertikal biru) pada piring agar dengan 50 mM NaCl (atas). Grafik batang menunjukkan laju belokan rata-rata selama periode sebelum dan sesudah pencahayaan (bawah). Berarti ± sem; n ≥6 pengujian; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, (NS) tidak signifikan; uji dua sisi.

Gambar ukuran penuh

AIB menerima input sinaptik dari banyak neuron sensorik, tetapi kami beralasan bahwa plastisitas respons neuron kemungkinan tergantung pada ASER karena input dari ASER cukup untuk kemotaksis hingga kultus C. Untuk menguji ini, kami melakukan pencitraan kalsium ASER dan AIB pada mutan dyf-11 , yang telah merusak silia sensorik. Pada mutan dyf-11 , respon kalsium yang ditimbulkan oleh stimulus kecil dan plastisitas yang bergantung pada kultus sepenuhnya dihapuskan pada ASER dan AIB (Gambar Tambahan S8a). Pada hewan yang ASER-nya diselamatkan semata-mata, respons ASER sepenuhnya pulih. Respons kalsium awal AIB juga dipulihkan agar sebanding dengan tipe liar tetapi tidak berkelanjutan, menunjukkan bahwa respons berkelanjutan membutuhkan input dari neuron selain ASER. Yang penting, plastisitas yang bergantung pada respons AIB pada dasarnya sama dengan tipe liar, menunjukkan bahwa plastisitas respons AIB tergantung pada ASER (Gambar Tambahan. S8b).

Aktivasi AIB memicu pembalikan dan berbalik 20, 21, dan kemungkinan akan mempromosikan perubahan arah selama chemotaxis 22 . Untuk menguji apakah ASER-dan AIB-balik yang dibangkitkan sebenarnya dimodulasi oleh pengalaman konsentrasi garam, kami mengambil pendekatan optogenetik dengan mengekspresikan channelrhodopsin-2 (ChR2) dalam neuron ini. ChR2 adalah saluran kation berpagar cahaya dan aktivasi oleh iluminasi cahaya mendepolarisasi neuron 23 . Aktivasi ASER oleh ChR2 mempromosikan pembubutan ketika konsentrasi garam dari pelat budidaya berada di atas pelat uji (uji C ≥ C ), sementara itu pembubutan berbelok ketika C Cult < C test (Gbr. 4c). Di sisi lain, aktivasi AIB mendorong perubahan terlepas dari kultus C (Gbr. 4e). Jika neuron AIB memediasi informasi dari ASER, ablasi AIB dapat memengaruhi kemungkinan ASER-evoked turning. Kehilangan AIB mengakibatkan penurunan keseluruhan frekuensi pirouette: indeks basal pirouette 50 mM hewan yang dibudidayakan NaCl adalah 0, 043 ± 0, 001 pada hewan liar dan 0, 022 ± 0, 001 pada hewan ablated AIB ( n ≥16, rata-rata ± sem, P < 0, 001 dengan uji dua sisi, lihat Metode untuk detail). Ketika ASER distimulasi pada hewan yang mengalami ablasi AIB, promosi ASER yang dipicu dari belokan masih diamati dalam kondisi uji C cult > C tetapi besarnya lebih kecil. Di sisi lain, perubahan tingkat balik dalam kondisi uji C = C dan uji C < C dihilangkan (Gbr. 4d). Hasil ini menunjukkan bahwa perubahan yang ditimbulkan oleh ASER dalam probabilitas belok setidaknya sebagian diatur melalui AIB dan koneksi sinaptik antara ASER dan hilir interneuron adalah salah satu tempat modulasi oleh pengalaman konsentrasi garam.

Analisis perilaku kuantitatif hewan ablasi AIB mengungkapkan bahwa meskipun AIB tampaknya terlibat dalam regulasi frekuensi pirouette, klinotaxis masih utuh pada hewan ablasi AIB (Gambar Tambahan S9a). Selain itu, ablasi AIB nyaris tidak mempengaruhi kemotaksis dalam pengujian saat ini (Tambahan Gambar. S9b). Hasil ini menunjukkan bahwa informasi dari ASER ditransfer juga oleh interneuron yang bertindak sejajar dengan AIB dalam chemotaxis garam (lihat Diskusi).

Karena ASER sendiri dapat mengatur seluruh perilaku orientasi pada gradien garam (Gbr. 3b), ada kemungkinan bahwa ASER juga memediasi respons perilaku untuk meningkatkan konsentrasi garam. Sesuai dengan ide ini, bias klinokinesis pada peningkatan konsentrasi garam benar-benar hilang pada hewan yang diabrasi ASER (Gambar Tambahan. S6c). Peningkatan konsentrasi garam menonaktifkan ASER 5 . Peningkatan bertahap dalam konsentrasi garam sebenarnya menghasilkan penurunan cepat dalam fluoresensi G-CaMP pada akhir stimulasi dalam percobaan pencitraan kami (Gbr. 4a). Namun, responsnya kurang menonjol ketika garam naik diberikan setelah 8 menit inkubasi pada konsentrasi garam konstan (Tambahan Gambar. S7d), yang menghalangi analisis lebih lanjut pada respon naik (lihat Diskusi).

Pensinyalan Gq / DAG / PKC di ASER mengatur bias migrasi

Untuk melihat apakah pensinyalan insulin dan pensinyalan Gq / DAG / PKC dalam plastisitas kemotaksis tergantung konsentrasi penanaman, kami memeriksa kemotaksis garam dari mutan setelah penanaman dalam kondisi makan dan kelaparan. Mutan daf-2 , usia-1 dan akt-1 , serta ins-1 , ligan diduga untuk DAF-2, rusak dalam menghindari kultus C setelah kelaparan. Tetapi ketertarikan terhadap kultus C terkait dengan makanan kurang terganggu pada mutan ini (Gambar 5a). Hasil ini menunjukkan bahwa jalur insulin bertindak untuk mengubah arah kemotaksis garam setelah kelaparan. Aktivasi jalur Gq / DAG / PKC dengan menambahkan analog DAG phorbol 12-myristate 13-acetate ke media kultivasi atau dengan mutasi gain-of-fungsi diduga dalam egl-30 (ref. 9) mengakibatkan migrasi ke lebih tinggi konsentrasi garam terlepas dari kondisi makanan (Gbr. 5c, d). Sebaliknya, inaktivasi jalur ini oleh mutasi nol pada pkc-1 menyebabkan migrasi ke konsentrasi yang lebih rendah (Gambar 5d). Konsisten dengan peran sentral ASER dalam perilaku, ekspresi spesifik sel dari bentuk teraktivasi PKC-1 atau inaktivasi pkc-1 di ASER meniru mutasi yang mengaktifkan atau menonaktifkan jalur, masing-masing (Gbr. 5e). Oleh karena itu, jalur Gq / DAG / PKC di ASER dapat bertindak untuk menentukan bias migrasi pada gradien garam di bawah kondisi makan dan kelaparan.

Image

( a ) mutan daf-2 (e1370) menunjukkan cacat pada modulasi kemotaksis garam yang bergantung pada kelaparan. Sebagai mutan menjadi larva dauer pada suhu tinggi, hewan ditumbuhkan ke L4 pada 15 ° C, kemudian dipindahkan ke 25 ° C di mana suhu preassay budidaya dan tes chemotaxis dilakukan. Berarti ± sem; n = 6 tes; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, berbeda dari jenis liar yang dibudidayakan pada kondisi yang sama; uji dua sisi. ( B ) Kemotaksis dari mutan jalur insulin lainnya. Lihat teks utama untuk deskripsi strain. Berarti ± sem; n ≥6 pengujian; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, berbeda dari jenis liar yang dibudidayakan pada kondisi yang sama; Tes Dunnett. ( c ) Penambahan 0, 25 mg l- 1 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ke media budidaya mendorong daya tarik garam. Berarti ± sem; n = 6 tes; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, berbeda dari kontrol yang dibudidayakan pada kondisi yang sama; uji dua sisi. ( D ) Chemotaxis dari egl-30 (pe914) dan pkc-1 (nj3) mutan. Lihat teks untuk deskripsi strain. Berarti ± sem; n ≥6 pengujian; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, berbeda dari jenis liar yang dibudidayakan pada kondisi yang sama; Tes Dunnett. ( e ) Aktivasi spesifik ASER untuk PKC-1. Berarti ± sem; n = 7 tes; (**) P <0, 001, berbeda dari kontrol yang dibudidayakan pada kondisi yang sama; uji dua sisi. ( f ) Inaktivasi spesifik ASER atas pkc- 1 oleh ekspresi RNA untai ganda spesifik sel. Berarti ± sem; n = 10 tes; (*) P <0, 01, (**) P <0, 001, berbeda dari kontrol yang dibudidayakan pada kondisi yang sama; uji dua sisi.

Gambar ukuran penuh

Dalam kesepakatan dengan ide ini, kami menemukan bahwa mutasi pada fosfolipase C (PLC) -ε plc-1 mengubah preferensi konsentrasi garam (Tambahan Gambar. S10a dan lihat Metode untuk perincian). Sebuah mutasi semi dominan plc-1 (pe1237) dan pengurangan fungsi mutasi plc-1 (pe1238) menunjukkan fenotip yang berlawanan: konsentrasi garam yang lebih disukai adalah terangkat ke atas di pe1237 dan diturunkan di pe1238 (Gbr. 6a). Reporter transkripsional plc-1 diekspresikan dalam neuron sensorik kepala AWC, AFD, ASE, ASG, dan BAG, serta interneuron RIF, neuron tali saraf ventral, neuron ekor, dan otot tubuh (Gambar Tambahan. S10b). Eksperimen penyelamatan spesifik sel menunjukkan bahwa PLC-1 bekerja di ASER tetapi tidak di ASEL atau interneuron hilir termasuk AIB (Gambar 6b). Respons kalsium ASER, termasuk modulasi oleh kultus C , sebanding dengan tipe liar di kedua plc-1 (pe1237) dan plc-1 (pe1238) mutan, menunjukkan bahwa pensinyalan DAG mungkin tidak mempengaruhi penginderaan garam dari ASER (Gbr. 6c, d). Sebaliknya, respons AIB ditambahkan dalam plc-1 (pe1237) setelah penanaman pada 0 mM (Gambar 6c), sementara berkurang pada plc-1 (pe1238) setelah penanaman pada 50 mM atau lebih tinggi (Gambar 6d). Ekspresi spesifik ASER dari plc-1 (+) mengembalikan respons AIB dalam plc-1 (pe1238) mutan tanpa mempengaruhi respons ASER (Gbr. 6e). Dengan demikian sifat respon AIB berkorelasi baik dengan perilaku yang diubah pada plc-1 mutan. Hasil ini konsisten dengan gagasan bahwa koneksi sinaptik antara ASER dengan interneuron, yang dimodulasi oleh pengalaman garam ASER, adalah situs plastisitas yang mendasari chemotaxis ke konsentrasi yang lebih disukai. Fenotipe kemotaksis dari mutan plc-1 lebih lemah dibandingkan dengan mutan egl-30 Gq atau pkc -1 nPKC, yang mungkin karena kami menggunakan mutan lemah plc-1 (mutan nol dari plc-1 mematikan 24 ) atau karena PLC lain, seperti egl-8 , bekerja paralel dengan plc-1 .

Image

( a ) Kemotaksis garam mutan plc-1 . Lihat teks untuk deskripsi mutan. Berarti ± sem; n = 6 tes; (**) P <0, 001, berbeda dari tipe liar; Tes Dunnett. ( B ) Chemotaxis dari garis penyelamatan spesifik sel dari plc-1 (pe1238) . Berarti ± sem; n ≥6 pengujian; (++) P <0, 001, (NS) tidak signifikan, berbeda dari kontrol plc-1 (pe1238) ; Tes Dunnett. ( c - e ) Tanggapan kalsium dari ASER (panel kiri) dan AIB (panel kanan) di plc-1 (pe1237) ( c ), plc-1 (pe1238) ( d ) dan hewan plc-1 (pe1238) yang ASER-nya adalah semata-mata diselamatkan oleh plc-1 cDNA ( e ). Perubahan fluoresensi rata-rata selama 5 detik (ASER) atau 25 detik (AIB) setelah stimulasi ditunjukkan dalam grafik batang. Daerah yang diarsir di sekitar kurva respons dan bilah kesalahan mewakili sem. Jumlah hewan yang diuji untuk setiap kondisi ditunjukkan dalam tanda kurung. Statistik untuk tanggapan ASER ditunjukkan pada Tabel Tambahan S1. Statistik untuk respons AIB adalah: (+) P <0, 05, (**) P <0, 001, (NS) tidak signifikan; Mann-Whitney U -test dibandingkan dengan prestimulation untuk panel c - e .

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Mencari kondisi lingkungan yang disesuaikan biasanya diamati dalam perilaku adaptif pada hewan migran. Di sini kami menunjukkan bahwa C. elegans bermigrasi ke konsentrasi garam yang sebelumnya diberi makan. Strategi perilaku seperti itu mungkin bermanfaat untuk tinggal di lingkungan yang kaya makanan atau menemukan sumber makanan baru di lingkungan tersebut. Setelah budidaya pada konsentrasi yang lebih tinggi ( uji C > C ), penurunan konsentrasi garam mengaktifkan ASER dan AIB dan menginduksi perilaku belok, di mana mendorong hewan ke konsentrasi garam yang lebih tinggi (Gambar Tambahan S11), sedangkan ketika hewan dibudidayakan pada konsentrasi yang lebih rendah ( C cult < C test ), stimulasi ASER menekan perubahan arah (Gbr. 4c). Karena stimulasi yang ditimbulkan oleh ASER pada kondisi kultus C >> C masih terjadi pada hewan yang mengalami ablasi AIB (Gbr. 4d), informasi dimediasi oleh neuron yang tidak dikarakterisasi yang diinervasi oleh ASER dan juga AIB (Tambahan Gambar. S11 ). Selain itu, AIB tidak diperlukan untuk klinotaxis dalam kondisi pengujian saat ini (Gambar Tambahan. S9a). Pengamatan ini menunjukkan bahwa pemrosesan informasi garam tidak bergantung pada kelas interneuron tunggal tetapi diproses oleh sirkuit paralel seperti dalam penciuman atau termosensasi dalam organisme ini 22, 25 .

ASER ternyata merasakan tidak hanya penurunan tetapi juga peningkatan konsentrasi garam sebagaimana ditunjukkan oleh penurunan kadar kalsium intraseluler 5, dan analisis perilaku kami menunjukkan bahwa ASER sangat penting untuk respons perilaku untuk meningkat, serta penurunan konsentrasi garam (Tambahan Gambar. S6a, c). Namun, kami tidak dapat mendeteksi perubahan yang cukup dalam kadar kalsium ASER (Gambar Tambahan S7d), yang menghalangi analisis lebih lanjut dari kegiatan sirkuit saraf yang terkait dengan perilaku hewan yang bermigrasi ke atas gradien. Ini bisa jadi karena perbedaan dalam indikator kalsium karena GCaMP2 yang digunakan dalam penelitian ini memiliki K d lebih besar dari YC2.12 yang digunakan dalam penelitian sebelumnya 5 dan karena itu bisa kurang sensitif terhadap tingkat rendah kalsium intraseluler. Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengklarifikasi dasar saraf perilaku ini.

Ada kesamaan yang mencolok antara chemotaxis dan thermotaxis tidak hanya dalam pola perilaku homoeostatik 26, 27 tetapi juga dalam peran pensinyalan DAG; manipulasi genetik yang meningkatkan atau menurunkan pensinyalan DAG dalam neuron termosensori AFD menghasilkan migrasi ke suhu yang lebih rendah atau lebih tinggi, masing-masing 28 . Jalur DAG juga terlibat dalam aklimasi suhu lingkungan melalui modulasi output sinaptik AFD 29 . Dalam neuron motorik ventral ventral, DAG secara positif mengatur pelepasan sinaptik melalui PKC-1 dan UNC-13 (ref 30, 31). Secara analogi, transmisi neurot antara ASER dan AIB dapat diatur oleh jalur ini. Masih ada kemungkinan bahwa ambang batas dalam respons ASER mengalihkan transmisi rangsang dan penghambatan ke interneuron postinaptik seperti yang baru-baru ini disarankan antara AFD dan AIY 32 .

Metode

Strain dan budaya

Strain C. elegans dan garis transgenik yang digunakan dalam penelitian ini tercantum dalam Tabel Tambahan S2. Semua strain mutan disilangkan berkali-kali dengan N2. Hewan dipelihara pada suhu 20 ° C dalam kondisi standar kecuali dinyatakan sebaliknya. 33 . E. coli NA22 yang tumbuh cepat digunakan sebagai sumber makanan dalam tes perilaku untuk menghindari kelaparan. OP50 digunakan untuk percobaan pencitraan karena hewan yang dibiakkan dengan NA22 cenderung menunjukkan fluoresensi latar belakang yang tinggi di usus. Perbedaan dalam strain bakteri tidak mempengaruhi kemotaksis tergantung konsentrasi garam budidaya (Tambahan Gambar. S2). Metode genetika standar digunakan untuk menghasilkan galur dengan persilangan 33 .

Tes perilaku

Untuk mengevaluasi perilaku hewan pada gradien garam, uji chemotaxis yang dimodifikasi digunakan dalam penelitian ini. Hewan ditangani dengan chemotaxis buffer (25 mM kalium fosfat (pH 6, 0), 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4 ) yang dilengkapi dengan 50 mM NaCl. Plat uji disiapkan seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan. S1a. Agar latar belakang berdiameter 8, 5 cm dan tebal 1, 76 mm (larutan 10 ml dituangkan) dan termasuk 50 mM NaCl dan agar 2% dalam buffer chemotaxis. Di atas pelat, dua blok agar silinder (masing-masing berdiameter 14, 5 mm dan tebal 5, 3 mm, termasuk 0 mM (sisi bawah) atau 150 mM (sisi lebih tinggi) NaCl dan agar 2% dalam buffer chemotaxis dan dikeluarkan dari piring agar dengan menggunakan penggerek gabus) ditempatkan pada posisi 3 cm dari pusat piring dalam arah yang berlawanan selama 18 jam pada 20 ° C dan dilepaskan sesaat sebelum pengujian. Prosedur ini menciptakan gradien garam konsentris pada pelat uji dengan konsentrasi tertinggi di pusat blok garam tinggi, konsentrasi terendah di sisi yang berlawanan dan konsentrasi latar belakang di sekitar pusat. Konsentrasi aktual ion klorida diukur menggunakan elektroda klorida (Horiba). Latar belakangnya biasanya 55-56 mM, 3-4 mM lebih tinggi dari yang dihitung, mungkin karena jumlah jejak klorida dalam agar (//www.bd.com/ds/productCenter/) dan dengan pengeringan.

Hewan ditanam hingga dewasa pada medium pertumbuhan nematoda standar (NGM), dan kemudian dipindahkan ke lempeng NGM dengan berbagai konsentrasi NaCl untuk budidaya preassay selama 6 jam. Lima puluh hingga dua ratus hewan disapu keluar dari lempeng, ditempatkan di titik awal di lempeng uji (2, 5 cm dari tengah), dan dibiarkan berlari selama 45 menit. Satu mikroliter masing-masing 0, 5 M NaN 3 terlihat sampai puncak gradien NaCl dan ke posisi berlawanan untuk menjebak hewan. Jumlah hewan dalam radius 2 cm dari pusat setiap blok agar dianggap tertarik dan jumlah hewan dalam radius 1-cm dari titik awal diabaikan dari total jumlah hewan untuk menghitung indeks chemotaxis ( Gambar 1b). Indeks 1.0 dan .01.0 mewakili preferensi lengkap untuk konsentrasi yang lebih tinggi dan lebih rendah, dan indeks nol mewakili preferensi untuk konsentrasi latar belakang, distribusi yang sama untuk kedua sisi atau distribusi acak. Pada Gambar. 1d, gradien garam dihasilkan pada pelat uji yang mengandung konsentrasi NaCl latar belakang yang ditunjukkan, menggunakan blok agar yang konsentrasi NaClnya tidak berubah. Pada Gambar. 1e, durasi budidaya preassay bervariasi seperti yang ditunjukkan. Pada Gambar. 3c, 5 μM capsaicin (Sigma) atau pelarut saja (0, 1% etanol) ditambahkan ke pelat uji. Dalam Gambar. 5c, 0, 25 mg l- 1 PMA (Sigma) atau pelarut (0, 01% etanol) ditambahkan ke penanaman preassay. Dalam semua tes perilaku, setidaknya empat percobaan dilakukan secara independen untuk setiap titik data dan hasilnya divalidasi secara statistik seperti yang dijelaskan dalam setiap gambar.

Tes Chemotaxis untuk bau (Gambar Tambahan. S5) dilakukan seperti yang dijelaskan 34 . Pengenceran cairan dalam etanol adalah 1: 1.000 untuk diacetyl dan benzaldehyde, dan tidak ada pengenceran untuk 2-nonanone. Uji kemotaksis garam pada Gambar Tambahan. S5 dilakukan seperti yang dijelaskan pada 9 dengan penanaman preassay.

Pencitraan kalsium

Hewan yang mengekspresikan G-CaMP di ASER atau AIB di latar belakang tipe liar dijelaskan sebelumnya 18, 22 . Yang terakhir adalah hadiah dari C. Bargmann. Kami tidak menemukan cacat yang jelas pada kemotaksis garam pada hewan ini. Galur reporter yang memiliki latar belakang genetik tertentu dihasilkan oleh persilangan genetik (Tabel Tambahan S2). Eksperimen pencitraan dilakukan seperti yang dijelaskan 35 dengan modifikasi. Secara singkat, hewan dibiakkan pada NGM standar sampai dewasa muda dan selanjutnya diinkubasi semalam di NGM dengan berbagai konsentrasi NaCl dan yang osmolaritasnya disesuaikan hingga 350 mOsm. Hewan kemudian diimobilisasi dengan perangkat mikrofluida 36 dan langkah konsentrasi NaCl dikirim ke ujung hidung mereka dengan mengalihkan larutan (25 mM kalium fosfat (pH 6, 0), 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, gelatin 0, 02%, gelatin 0, 05%, NaCl pada saat itu. menunjukkan konsentrasi dan gliserol untuk menyesuaikan osmolaritasnya hingga 350 mOsm). Gambar time-lapse diperoleh dengan mikroskop DMI-6000B (Leica) yang dilengkapi dengan HCX-PL-APO 63x objektif (NA, 1, 40), perangkat filter L5 (kombinasi filter eksitasi jalur jalur 480/40 nm dan 505 nm cermin dichromatic, Leica), dan kamera ImagEM EM-CCD (Hamamatsu) dengan kecepatan dua frame per detik. Kerangka awal rekaman (Waktu = 0 dalam jejak) ditetapkan sebagai 8 menit setelah pemindahan hewan dari piring budidaya di seluruh makalah ini karena durasi lama inkubasi prestimulus sangat mempengaruhi besarnya dan lamanya respons. Masing-masing hewan menjadi sasaran rekaman tunggal dan diganti untuk setiap percobaan. Intensitas fluoresensi rata-rata dari sel tubuh dihitung dengan mengoreksi posisi daerah yang diminati oleh fungsi Track Objects dari perangkat lunak Metamorph (Perangkat molekuler) diikuti dengan mengurangi intensitas rata-rata wilayah latar belakang. Fluoresensi rata-rata di jendela 10-s (biasanya, Waktu = 4-14 dt) ditetapkan sebagai F 0 dan intensitas fluoresensi relatif terhadap F 0 ( F / F 0) dihitung untuk serangkaian gambar. Untuk jejak, F / F 0 dirata-rata untuk semua hewan di setiap titik waktu. Untuk grafik, rata-rata F / F 0 selama 5 detik (ASER) atau 25 detik (AIB) setelah stimulasi dihitung.

Analisis penggerak

Sistem pelacakan cacing secara simultan mengidentifikasi dan melacak puluhan hewan di piring uji, dan mengekstrak parameter perilaku masing-masing hewan 37 . Chemotaxis tests were prepared as described above, but only 30–50 animals were placed at the start point to reduce the chance of collision of animals. Images of the whole test plate were acquired for 30 min at one frame per second. Probability of pirouette and curving rate were calculated as described 7 . Pirouette index was defined as the difference of probability of pirouette between negative d C /d T rank and positive d C /d T rank. Weathervane index was defined as the slope of the regression line in relationship between NaCl gradient in normal direction and the curving rate. These values were calculated for each test, and average and sem were shown in figures. Concentrations of NaCl on the test plate were calculated by three-dimensional Euler's method based on Fick's low adopting D =0.000013 (cm 2 s −1 ) as diffusion constant for NaCl (Supplementary Fig. S1b). This enabled us to analyse locomotion of animals on salt gradient precisely. In Supplementary Fig. S6, pirouette frequency was calculated according to the time derivative of salt concentration by 0.1 mM s −1 bins. Curving rate was calculated according to the NaCl gradient in normal direction by 0.5 mM mm −1 bins. Bins with <20 data points were omitted from further analyses. Data from the initial 500 s were used to calculate the behavioural parameters because most of the animals migrated to C cult within the period. The trajectories of animals in Fig. 1c and Supplementary Fig. S3a were reconstructed by the tracking system by excluding those interrupted by collision of animals. Simulation of animals' behaviour was performed as described 7 except that the curving rate

Image

(change of movement direction per unit length of progression, degree mm −1 ) of the animals followed a first-order autoregression, namely

Image

where k =0.933 is a decay constant determined from the data of real animals 7, and

Image

is a Gaussian white noise whose sd was also determined from real measurements.

Optogenetics

All optical stimulation experiments were carried out in lite-1(ce314) mutants to eliminate intrinsic light response 38 . For ASER-specific stimulation, animals that harbour chromosome-integrated gcy-5 promoter-driven ChR2 transgene, Is[gcy-5p::ChR2::yfp] (90 ng μl −1 ), were used. For AIB-specific activation, animals that carry extra-chromosomal Ex[npr-9p::ChR2::yfp] (90 ng μl −1 ) were used. A cDNA clone for murine caspase-1 (ref. 37) was expressed by npr-9 promoter to ablate AIB neurons. In the resultant Is[npr-9p::casp1] strain, AIB neurons were absent in >90% of animals. Adults grown on standard NGM plates were further cultivated overnight under various concentrations of salt supplemented with 5 μM all-trans retinal (Sigma). Their behaviour was tested on a retinal-free chemotaxis plate without salt gradient. One- (for ASER) or two-second (for AIB) pulse of blue light (peak wavelength=470 nm; 190 W m −2 ) was delivered by a ring-shaped light-emitting diode light (CCS). Each animal was tested six times with a 120-s interval between each test. Locomotion was monitored by the worm tracking system. The event rate was calculated as the ratio of animals that are during pirouettes, turns or pauses at each time point. At least six independent experiments were performed for each condition.

Characterization of plc-1

plc-1(pe1237) was isolated by a genetic screen as a mutation that confers preference for high concentrations of salt 35 . We assigned the mutation to a predicted gene frm-9 /F31B12.3, which encodes a 4.1 ezrin-radixin-moesin (FERM) domain-containing protein with unknown function (WormBase Release WS230) (Supplementary Fig. S10a). Then, we obtained a deletion allele of the gene pe1238 by ultraviolet/trimethylpsoralen mutagenesis. Interestingly, pe1238 showed chemotaxis phenotype opposite to the original mutation; it preferred lower concentrations if compared with wild type (Fig. 6a). In the course of rescue experiments, we noticed that gene prediction of frm-9 is incomplete because fosmids that cover the entire frm-9 region, WRM065aD07 and WRM0620c09 failed to complement pe1238 (Supplementary Fig. S10a). Extensive reverse transcription–PCR experiments revealed that there exists a 10.6-kbp cDNA that spans from frm-9 to plc-1 /F31B12.1 (Supplementary Fig. S10a). PLC-1 regulates epidermal morphogenesis in embryogenesis and also function in spermatheca to regulate ovulation through production of inositol 1, 4, 5-triphosphate 24, 39 . plc-1(tm753) showed chemotaxis defects similar to that of pe1238 , as well as partial sterility consistent with the previous report 24 . The cDNA clone for long isoform, but not the short isoform of plc-1 , rescued the salt preference defects in plc-1(pe1238) (Fig. 6b and Supplementary Fig. S10a). These results collectively show that the newly identified isoform is required for salt chemotaxis. The amino terminal region of PLC-1 is not required for fertility and may function as a regulatory domain of the enzyme.

Biologi molekuler

Plasmids were generated by the GATEWAY system (Invitrogen) as described 34 . Details are available at our web site ( // molecular-ethology.biochem.su-tokyo.ac.jp/Gateway/Gateway_overview1.html) Promoters for flp-6 (ref. 40), odr-2 (ref. 41), dyf-11 (ref. 17), npr-9 (ref. 42), gcy-5 and gcy-7 (ref. 43) were described previously. Structure of the cDNA for plc-1 was determined by reverse transcription of total RNA of wild type followed by 5′- and 3′- rapid amplification of cDNA ends (RACE) using primers 5′-CCGTCTAGAACTAGTCCTCCTTTTTTTTTT-3′ for reverse transcription, 5′-TAGGTACCGGTTTAATTACCCAAGTTTGAG-3′ for 5′-RACE, and 5′-CCGTCTAGAACTAGTCCTCC-3′ for 3′-RACE. To generate a destination plasmid for plc-1 , full-length cDNA was amplified using primers 5′-GTGGACTCAATGCCAACATC-3′ and ATCACTCGTGTCTGGGATCCAT. A 5.1-kbp plc-1 promoter was amplified by PCR using primers 5′-ATGTCCTTACGCCAAGCATC-3′ and AAAATTTTCAGCATTTCAAACAT. Expression constructs for dyf-11 (ref. 17), pkc-1 (ref. 10) and fluorescence reporter proteins 44 were described previously.

Transformasi

Germ-line transformations were performed by standard microinjection methods 45 . Expression constructs for dyf-11 were injected at 5 ng μl −1 along with transformation marker (20 ng μl −1 ) and pPD49.26 (75 ng μl −1 ) as carrier DNA. The expression constructs for plc-1 were introduced at 100 ng μl −1 with transformation marker (20 ng μl −1 ). An empty vector was introduced in place of the expression construct in control experiments.

Cell-specific RNA interference

Hairpin-structured double-stranded RNA for pkc-1 was expressed in a cell-specific manner using the pWormgate vector 46 . A 0.86 kb of pkc-1 cDNA fragment, which corresponds to the carboxyl terminal half of PKC-1, was driven by the gcy-5 promoter for ASER-specific expression. In control experiments, an empty pWormgate vector with gcy-5 promoter was introduced. Plasmids were introduced into wild-type animals at 100 ng μl −1 along with myo-3p::venus (15 ng μl −1 ).

Informasi tambahan

How to cite this article: Kunitomo, H. et al. Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans . Nat. Komunal. 4:2210 doi: 10.1038/ncomms3210 (2013).

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Informasi tambahan

    Supplementary Figures S1-S11 and Supplementary Tables S1-S2

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.