Dna metilasi menentukan hunian nukleosom di pulau 5′-cpg gen penekan tumor | onkogen

Dna metilasi menentukan hunian nukleosom di pulau 5′-cpg gen penekan tumor | onkogen

Anonim

Subjek

  • Metilasi DNA
  • Nukleosom
  • Protein penekan tumor

Abstrak

Hipermetilasi pulau CpG promotor dari gen penekan tumor adalah ciri epigenetik dari kanker manusia yang umumnya dikaitkan dengan hunian nukleosom dan pembungkaman transkripsi dari gen tetangga. Nukleosom dapat menentukan status metilasi DNA yang mendasarinya. Di sini, kami menunjukkan bahwa yang sebaliknya juga benar: Metilasi DNA dapat menentukan posisi nukleosom. Dengan menggunakan model kanker dan teknik penentuan posisi nukleosom digital, kami menunjukkan bahwa induksi peristiwa hipometilasi DNA secara genetik (sel defisiensi DNMT1 / DNMT3B) atau obat (agen demethylating DNA) berhubungan dengan pengusiran nukleosom dari pulau CpG yang sebelumnya hypermethylated dari gen penekan tumor. Yang paling penting, pembentukan garis sel stabil yang mengembalikan defisiensi DNMT1 / DNMT3B menunjukkan bahwa nukleosom menduduki kembali posisi mereka di pulau CpG yang dimetilasi dengan de novo . Akhirnya, kami memperluas hasil ini ke tingkat genomik, menggabungkan microarray metilasi DNA dan teknik penentuan posisi nukleosom. Dengan menggunakan pendekatan global ini, kami mengamati ketergantungan hunian nukleosom pada status metilasi DNA. Dengan demikian, hasil kami menunjukkan bahwa ada hubungan erat antara pulau-pulau CpG hypermethylated dan keberadaan nukleosom, sehingga masing-masing mekanisme epigenetik ini dapat menentukan rekrutmen yang lain.

pengantar

Secara umum, metilasi pulau CpG dikaitkan dengan pembungkaman gen. 1 pulau CpG biasanya tidak termetilasi dalam sel normal, meskipun beberapa di antaranya (∼ 6%) menjadi dimetilasi dalam cara spesifik jaringan selama pengembangan atau dalam jaringan berbeda. 2 Namun, dalam sel tumor banyak gen penekan tumor dibungkam melalui metilasi pulau CpG. 1, 2, 3 Promotor hipermetilasi juga terkait dengan konfigurasi kromatin tertutup, ditandai dengan pola modifikasi histon yang menampilkan deasetilasi histone H3 dan H4, metilasi histone H3 lisin 9 dan 27 dan demetilasi histone H3K4. 1, 2, 3, 4

Penting juga untuk diingat pengemasan DNA menjadi nukleosom. Nukleosom dapat bertindak sebagai penghalang untuk transkripsi, mengatur akses ke DNA dalam nukleus. Selama pemanjangan transkripsi, DNA dibuka dari nukleosom, memungkinkan RNA polimerase II untuk berkembang. 5 Faktanya, posisi tepat nukleosom di sekitar situs awal transkripsi (TSS) dapat menjadi penting untuk regulasi ekspresi gen. 6 Hilangnya nukleosom langsung di hulu TSS berkorelasi erat dengan aktivasi gen, sedangkan oklusi TSS oleh nukleosom dikaitkan dengan represi gen. 7, 8 Hubungan antara metilasi DNA dan pemosisian nukleosom telah secara tepat dijelaskan dalam gen mutL homolog 1 ( MLH1 ): pulau CpG yang teretilasi mencegah penipisan nukleosom dari promotor, sehingga mengurangi tingkat transkripsi MLH1 . 9 Dalam hal ini, DNA methyltransferases (DNMTs) lebih disukai ditargetkan untuk DNA yang terikat nukleosom, bahkan untuk promotor pulau non-CpG yang teretilasi. Dengan demikian, posisi nukleosom harus membantu membentuk lanskap metilasi DNA. 11, 12 Enzim terkait metilasi DNA lainnya (metil-CpG domain protein 2, MBD2; metil-CpG protein pengikat 2, MeCP2) juga dikenal diperkaya ketika nukleosomal yang dimetilasi dibandingkan dengan DNA yang dimetilasi. 13 Pengaruh metilasi DNA dalam konteks nukleosomal meningkatkan represi transkripsi, karena metilasi CpG menginduksi pembungkus DNA yang lebih ketat di sekitar inti histone dan perubahan topologi. 14

Tujuan dari penelitian kami adalah untuk menjelaskan hubungan antara positioning nukleosom dan metilasi DNA, menilai apakah itu merupakan fenomena searah atau dua arah. Penentuan posisi nukleosom dapat mengarahkan pola metilasi DNA, 11, 12 tetapi bisakah metilasi DNA juga menentukan penentuan posisi nukleosom?

Hasil

Hubungan lokal antara metilasi DNA, ekspresi gen, dan penentuan posisi nukleosom

Kami mempelajari metilasi DNA dan hunian nukleosom dalam garis sel kanker kolorektal HCT-116 dan garis sel isogeniknya dengan sistem KO ganda dari DNA methyltransferases DNMT1 dan DNMT3B (DKO). 15 Kami juga mempelajari peristiwa hipometilasi DNA dan hubungannya dengan penggusuran nukleosom putatif dalam garis sel HCT-116 yang diobati dengan agen demetilasi 5-aza-2′-deoxycytidine (Aza). Kami juga bertanya-tanya apakah hubungan antara metilasi DNA dan penentuan posisi nukleosom dapat ditentukan secara de novo . Untuk tujuan ini, kami menghasilkan garis sel baru (DKO DNMT1 / 3B), memperkenalkan kembali DNMT1 dan DNMT3B secara stabil ke dalam garis sel DKO (Gambar Tambahan S1). Sejak deskripsi asli sel DKO, beberapa artikel telah membahas fitur biologis sel-sel ini, 16, 17, 18 tetapi di sini, kami juga telah mengembangkan penentuan waktu penggandaan, pembentukan koloni, MTT (3- [4, 5-dimethylthiazol -2-yl] -2, 5 diphenyl tetrazolium bromide) dan uji pertumbuhan subkutan nude mencit untuk sel HCT-116, DKO dan DKO DNMT1 / 3B (Metode Tambahan). Secara keseluruhan, sel DKO memiliki pertumbuhan yang lebih lambat dalam waktu penggandaan, pembentukan koloni, MTT dan uji pertumbuhan tumor tikus nude in vivo dibandingkan dengan sel HCT-116 parental, sementara reintroduksi DNMT1 / DNMT3B meningkatkan pertumbuhan sel DKO dalam tiga analisis. (Gambar Tambahan S1).

Untuk menguji hipotesis kami bahwa metilasi DNA dapat menentukan hunian nukleosom, kami memilih dua pulau CpG 5-hypermethylated yang terkenal dari gen penekan tumor beta retinoic acid receptor beta ( RARB ) 19 dan homeobox D1 ( HOXD1 ) 16 dan dua baru-baru ini diidentifikasi, saluran kalium-tegangan gerbang subfamili anggota G 2 ( KCNG2 ) dan nefosis 2 idiopatik steroid-resistant ( NPHS2 ). 20 Ujung-ujung yang sesuai dari gen-gen ini dianotasi sebagai pulau-pulau CpG oleh Universitas California Santa Cruz, UCSC dan Pusat Informasi Bioteknologi Nasional, peramban genom NCBI, kecuali untuk RARB yang hanya diakui secara formal sebagai klasik dan kanonik. Pulau CpG oleh set data NCBI, meskipun telah dipelajari secara luas seperti itu. 1 Untuk empat gen, kami memvalidasi status metilasi DNA mereka, level ekspresi dan struktur posisi nukleosom dalam area 850 bp rata-rata yang berpusat pada TSS mereka. Sequencing bisulfit (Gambar 1a dan Gambar Tambahan S2) digunakan untuk analisis metilasi DNA, sedangkan ekspresi ditentukan oleh PCR waktu-nyata kuantitatif (Gambar 1b) dan transkripsi balik semi-kuantitatif PCR (Gambar Tambahan S3). Studi dilakukan dalam garis sel berikut: HCT-116, HCT-116 Aza, DKO dan DKO DNMT1 / 3B. Sebagai kontrol, karakteristik yang sama dipelajari dalam gen dehidrogenase gliseraldehida-3-fosfat ( GAPDH ) (Gambar Tambahan S2) dan supresor tumor p53 (Gambar Tambahan S4), yang tidak dimetilasi dan menunjukkan pola ekspresi yang sama di semua lini sel. digunakan disini Status metilasi DNA diperiksa di tiga daerah yang tumpang tindih: satu terletak di hulu TSS, yang lain berisi TSS dan ketiga hilir TSS (Gambar 1a, Gambar Tambahan S2 dan primer dijelaskan dalam Tabel Tambahan S1). Pola metilasi untuk setiap gen konsisten dalam setiap kasus untuk tiga daerah yang diteliti. Sel-sel HCT-116 menunjukkan promotor pulau CpG HOXD1, RARB, KCNG2 dan NPHS2 (Gambar 1a dan Gambar Tambahan S2), dan karenanya, tidak ada transkrip yang diekspresikan (Gambar 1b dan Gambar Tambahan S3). Di sisi lain, promotor GAPDH dan p53 (Gambar Tambahan S4) tidak mengalami metilasi dan gen diekspresikan. Dalam garis sel DKO, empat promotor tidak termetilasi (Gambar 1a dan Gambar Tambahan S2) dan mengekspresikan empat transkrip (Gambar 1b dan Gambar Tambahan S3). Ketika mengobati garis sel HCT-116 dengan agen demetilasi DNA 5-aza-2′-deoxycytidine selama 72 jam, tingkat metilasi CpG menurun (Gambar 1a dan Gambar S2 tambahan) dengan reaktivasi transkripsi yang sesuai dalam HOXD1 , RARB, Gen KCNG2 dan NPHS2 (Gambar 1b dan Gambar Tambahan S3). Reintroduksi stabil dari DNMT1 dan DNMT3B ke dalam sel DKO sebagian memulihkan pola metilasi gen HOXD1 , RARB , KCNG2 dan NPHS2 (Gambar 1a), sedangkan gen GAPDH (Gambar Tambahan S2) dan p53 (Gambar Tambahan S2 S4) dan p53 (Gambar Tambahan S4) tetap tidak dapat dimetilasi. Seperti yang diharapkan, tingkat ekspresi gen HOXD1 , RARB , KCNG2 , dan NPHS2 lebih rendah di garis sel DKO DNMT1 / 3B daripada di garis sel DKO (Gambar 1b dan Gambar Tambahan S3).

Image

Metilasi DNA pulau 5′-CpG dikaitkan dengan pembungkaman transkripsi. ( a ) Status metilasi DNA dari wilayah yang mengandung TSS ditunjukkan (daerah hulu dan hilir TSS ditunjukkan pada Gambar Tambahan S2). Dalam setiap kasus, delapan klon yang dimodifikasi bisulfit diurutkan. Kotak hitam dan putih sesuai dengan CpG teretilasi dan tidak termetilasi. ( B ) Ekspresi HOXD1 , RARB , KCNG2 dan NPHS2 ditampilkan untuk semua garis sel dan kasus yang dipelajari. Signifikansi statistik dalam percobaan waktu nyata telah dinilai dengan uji analisis varians (ANOVA) (* P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001).

Gambar ukuran penuh

Untuk menilai struktur kromatin dalam promotor yang dipilih, kami berusaha untuk memperoleh gambaran umum menggunakan uji aksesibilitas Msp I yang digabungkan dengan PCR waktu-nyata, dengan demikian untuk mengukur data. Uji aksesibilitas Msp I didasarkan pada struktur kromatin: semakin ketat kromatinnya dikemas, semakin sedikit aksesnya terhadap enzim restriksi. Dengan demikian, dalam kasus yang ekstrem, kromatin akan dikemas dengan sangat ketat sehingga situs-situs restriksi tidak dapat diakses, sehingga mencegah enzim dari mencerna DNA, bahkan ketika peningkatan unit enzim restriksi digunakan. Sebaliknya, semakin tidak kompak struktur kromatinnya, semakin besar pencernaan yang dicapai ketika menggunakan unit peningkatan enzim restriksi yang dipilih ( Msp I). Oleh karena itu, PCR yang dilakukan pada wilayah tertentu akan memberikan jumlah produk yang secara tidak langsung sebanding dengan aksesibilitas kromatin. Untuk mencapai akurasi dan reproduktifitas yang lebih besar, kami melakukan PCR real-time semi kuantitatif untuk mengukur jumlah produk yang diperoleh dalam setiap kasus. HCT-116, HCT-116 diperlakukan dengan inti Aza, DKO dan DKO DNMT1 / 3B diekstraksi dan diinkubasi dengan peningkatan konsentrasi enzim restriksi Msp I (0, 100 dan 400 U / ml). Selain itu kontrol positif dari DNA yang tidak dicerna dan kontrol negatif dari 100% DNA yang dicerna juga dianalisis. Untuk setiap gen, tiga daerah yang tumpang tindih dipelajari: satu terletak di hulu TSS, yang lain berisi TSS dan ketiga hilir TSS. Hasil yang diperoleh adalah serupa untuk semua daerah yang diteliti dalam setiap gen. Garis sel DKO menyajikan tingkat amplifikasi yang lebih rendah karena jumlah unit enzim restriksi meningkat pada semua gen yang diuji ( GAPDH , HOXD1, RARB, KCNG2 dan NPHS2 ), dengan demikian mengungkapkan struktur kromatin yang lebih terbuka (Gambar 2a dan Gambar Tambahan S5). Sel-sel DKO tidak 100% sepenuhnya dapat diakses oleh enzim karena garis sel ini belum kehilangan metilasi DNA sepenuhnya. 15 Di sisi lain, garis sel HCT-116 menyajikan tingkat amplifikasi yang lebih rendah setelah pencernaan Msp I, dan dengan demikian struktur kromatin terbuka hanya dalam GAPDH (Gambar 2a dan tambahan Gambar S5 data untuk Msp I 400 U / ml; Tambahan Gambar S6 data untuk gen Msp I 100 U / ml) dan p53 (Gambar Tambahan S4). Dengan demikian, daerah ini tampaknya tidak dapat diakses oleh Msp I dalam garis sel HCT-116 dan dianggap memiliki hunian nukleosom yang lebih padat. Ketika merawat garis sel HCT-116 dengan 5-aza-2′-deoksisitidin, struktur kromatin menyerupai yang diamati pada garis sel DKO, dengan aksesibilitas DNA yang lebih tinggi daripada sel HCT-116 yang tidak diobati (Gambar 2a dan Gambar Tambahan S5 dan S6) . Dalam hal ini, penipisan obat dari metilasi DNA (pengobatan 5-aza-2-deoxycytidine) mirip dengan penipisan genetik DNMT (sel DKO) untuk pola metilasi DNA, tingkat ekspresi dan tes aksesibilitas kromatin. Ketika DNMT1 dan DNMT3B secara stabil diperkenalkan kembali ke garis sel DKO (DKO DNMT1 / 3B), hunian nukleosom yang lebih padat diamati, berkorelasi dengan pemulihan sebagian metilasi DNA pada promotor dan penurunan ekspresi gen ( HOXD1, RARB, KCNG2 dan NPHS2) ). Hasil yang diperoleh konsisten dalam tiga wilayah yang dipelajari dari masing-masing gen.

Image

Metilasi DNA menentukan posisi nukleosom. ( a ) Uji aksesibilitas Msp I. Hasil digambarkan sebagai perbedaan n-lipat antara DNA yang tidak tercerna dan DNA yang dicerna 400 U / ml. Hanya hasil dari wilayah yang mengandung TSS yang disajikan (daerah hulu dan hilir TSS ditunjukkan pada Gambar S5 Tambahan). Hasil uji aksesibilitas Msp I berkorelasi dengan hunian nukleosom. Hasilnya mewakili rasio tidak tercerna / dicerna untuk setiap sampel dinormalisasi untuk dicerna / dicerna untuk HCT116. ( B ) Adaptasi protokol analisis promotor tunggal (M-SPA) berbasis metiltransferase untuk digunakan dalam mempelajari urutan metilasi. ( c ) Protokol M-SPA yang diadaptasi untuk mempelajari wilayah yang sama dipelajari dalam ( a ) pada resolusi yang lebih tinggi. Lingkaran, segitiga dan kotak, masing-masing, mewakili situs metilasi Msp I (C * CGG), Hae III (GGC * C) dan Alu I (AGC * T). Sosok hitam dan putih masing-masing mewakili situs yang dimetilasi dan tidak termetilasi. Daerah yang dapat diakses, di mana nukleosom tidak ada, menjadi termetilasi, sedangkan daerah yang tidak dapat diakses tidak. Hanya hasil dari wilayah yang mengandung TSS yang disajikan (daerah hulu dan hilir TSS ditunjukkan pada Gambar Tambahan S9). Signifikansi statistik dalam percobaan waktu nyata telah dinilai dengan uji ANOVA (* P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001).

Gambar ukuran penuh

Untuk menghindari hasil positif palsu dalam pengujian Msp I jika satu primer diposisikan di linker dari wilayah yang diduduki nukleosom, kami juga merancang set primer tambahan untuk percobaan ini dan data yang sama diperoleh (Tambahan Gambar S7). Selain itu, meskipun pencucian NaCl (0, 4 M) digunakan dalam pengujian kami untuk menghilangkan sebagian besar protein yang tidak terikat histone dari kromatin, 21 aksesibilitas DNA tidak dapat sepenuhnya mencerminkan nukleosom karena pengikatan protein lain dengan DNA juga dapat mempengaruhi sensitivitas terhadap enzim restriksi. Dengan demikian, kami menganalisis keberadaan protein histone inti untuk memberikan analisis lebih langsung terhadap nukleosom. Dengan menggunakan analisis imunopresipitasi kromatin untuk inti histone H3, kami menemukan bahwa pulau CX C1 promoter yang hipmetilasi , HOBD1 , RARB , CDH11 dan SCGB3A1 dalam sel HCT-116 diperkaya dalam histone H3 (Tambahan Gambar S8). Sebaliknya, pulau CpG promotor yang tidak termetilasi dari empat gen dalam sel DKO menunjukkan penipisan inti histon H3 (Tambahan Gambar S8).

Untuk mengukur hunian nukleosom lebih akurat, kami mengadaptasi protokol uji analisis promotor tunggal berbasis metiltransferase, 21 untuk membuatnya cocok untuk mempelajari sekuens DNA teretilasi (Gambar 2b). Untuk tujuan kami, kami menggunakan Msp I, Hae III dan Alu I methyltransferases, yang memodifikasi residu sitosin (C5) dari CCGG (C eksternal), GGCC (internal C) dan situs AGCT, masing-masing. Penggunaan ketiga metiltransferase memungkinkan kami untuk meningkatkan resolusi peta metilasi in vitro yang diperoleh. HCT-116, DKO, HCT-116 diobati dengan Aza dan DKO DNMT1 / 3B inti diekstraksi secara in vitro menggunakan tiga metilase dalam inkubasi berurutan. Sequencing bisulfit kemudian dilakukan di daerah yang menarik (Gambar 2c dan Gambar Tambahan S9). Sekali lagi, untuk masing-masing gen, tiga daerah yang tumpang tindih dipelajari: satu hulu TSS, lainnya berisi TSS dan ketiga hilir TSS. Wilayah yang ditanyakan dalam percobaan uji analisis promotor tunggal berbasis promotor metiltransferase seluruhnya lebih dari 147 bp untuk memastikan hunian nukleosom dengan ukuran rata-rata 243 bp (ukuran amplikon PCR dirinci dalam Tabel Tambahan S1). Hasilnya serupa untuk semua wilayah yang dipelajari dalam setiap gen dan benar-benar komplementer dengan yang diperoleh dengan uji aksesibilitas Msp I, meskipun memiliki resolusi yang lebih tinggi (Gambar 2c dan Gambar Tambahan S9). Sangat menarik untuk dicatat bahwa perbedaan yang lebih besar dalam hunian nukleosom diamati di wilayah yang mengandung TSS. Keadaan kromatin terbuka dikonfirmasi untuk gen HOXD1, RARB, KCNG2 dan NPHS2 dalam sel DKO, sedangkan keadaan kromatin tertutup diamati pada sel HCT-116. Pengobatan sel HCT-116 dengan Aza melonggarkan posisi nukleosom, sementara reintroduksi aktivitas DNMT1 dan DNMT3B dalam sel DKO menghasilkan reposisi nukleosom.

Kami juga melakukan studi waktu untuk metilasi DNA dan hunian nukleosom dalam sel HCT-116 setelah penggunaan agen demetilasi DNA menggunakan enam belas titik waktu yang berbeda (Tambahan Angka S10). Kami telah menentukan konten metilasi DNA dan aksesibilitas Msp I dari tiga wilayah yang diteliti di pulau HOXD1 dan RARB promoter CpG selama 192 jam pada interval 12 jam: enam poin dengan pengobatan Aza berkelanjutan dan sepuluh poin setelah penarikan Aza (total dari 16 poin waktu). Kami telah mengamati bahwa titik aksesibilitas DNA tertinggi diamati 12 jam lebih lambat dari titik tertinggi hipometilasi DNA (Gambar Tambahan S10), menunjukkan bahwa penggusuran nukleosom dapat terjadi setelah hilangnya metilasi DNA. Selain itu, penarikan obat demethylating dari media menyebabkan penurunan ekspresi gen progresif (Gambar Tambahan S11).

Hubungan hunian metilasi-nukleosom DNA adalah fenomena luas genom

Setelah menunjukkan hubungan antara metilasi DNA dan hunian nukleosom untuk gen tertentu, kami bertanya-tanya tentang sejauh mana mekanisme ini pada tingkat genom yang lebih global. Untuk mengatasi hal ini, DNA genomik dan mononukleosomal dari garis sel HCT-116 dan DKO diperoleh dan diseragamkan ke BeadArray metilasi DNA Golden-Gate (Illumina Inc., San Diego, CA, AS), yang berisi 1505 situs CpG yang terletak di antara −1500 bp dan +500 bp di sekitar TSS 808 gen yang berhubungan dengan kanker 22, 23, 24, 25 (Gambar 3a). Data dianalisis sebagai berikut (Gambar 3b). Urutan dianggap hypermethylated ketika perbedaan nilai CpG β antara HCT-116 dan garis sel DKO adalah -70%. Perbandingan pertama dibuat dari DNA genomik dari garis sel HCT-116 dan DKO. Ini memungkinkan kami untuk memilih daerah hipermetilasi dalam garis sel HCT-116 (272 situs CpG yang sesuai dengan 190 gen). Data mononukleosomal HCT-116 dan DKO genom kemudian dibandingkan. Perbandingan kedua ini memungkinkan pemilihan daerah HCT-116 hypermethylated yang telah lolos dari pencernaan nuklease mikrokokok karena lokasinya di sekitar nukleosom (252 situs CpG yang sesuai dengan 181 gen). Data mononukleosomal DKO digunakan sebagai kontrol negatif, yang mengkonfirmasi bahwa daerah yang tidak termetilasi lebih mudah dicerna oleh nuklease mikrokokokus, karena kebanyakan dari mereka tidak dilindungi oleh nukleosom. Akhirnya, pertimbangan bersama dari kedua perbandingan memungkinkan kami untuk memilih daerah-daerah genmic hypermethylated yang telah dilindungi dari pencernaan MNase karena lokasinya di sekitar nukleosom. Wilayah yang tumpang tindih berisi 228 probe yang sesuai dengan 162 gen (Tabel S2 Tambahan). Dengan demikian, sekitar 84% (83, 82% dalam konteks probe dan 84, 21% dalam gen) dari daerah hipermetilasi yang dipilih dalam DNA genomik dari garis sel HCT-116 dilestarikan dalam DNA HCT-116 mononukleosomal, yang berarti bahwa 84 % dari daerah hypermethylated ditempati oleh nukleosom. Hasil genom-lebar jelas menyoroti hubungan yang kuat antara metilasi DNA dan posisi nukleosom, menyiratkan bahwa hubungan ini standar dalam urutan teretilasi, daripada menjadi fenomena langka.

Image

Pendekatan Genome untuk metilasi DNA dan penentuan posisi nukleosom. ( a ) Alur terperinci dari protokol diikuti untuk mendapatkan data genom-lebar. ( B ) Analisis data genome-lebar. Diagram Venn menunjukkan analisis yang dilakukan untuk memilih daerah yang dimetilasi DNA yang dilindungi oleh nukleosom. Gambar di bawah adalah dua daerah signifikan dari microarray metilasi DNA. Persegi panjang hijau, sekuens DNA yang tidak termetilasi; Persegi panjang merah, urutan DNA termetilasi.

Gambar ukuran penuh

Untuk memulai validasi hasil susunan, pertama-tama kami mengkonfirmasi bahwa kandidat gen yang awalnya dipelajari, RARB , juga diidentifikasi dalam pendekatan genome-lebar sebagai memiliki pulau CpG promotor yang termetilasi dengan ditempati oleh nukleosom (Tabel Tambahan S2). Situs CpG untuk tiga gen kandidat lainnya ( HOXD1 , KCNG2 dan NPHS2 ) tidak dicetak dalam platform microarray metilasi DNA yang digunakan dan, dengan demikian, tidak dapat dikarakterisasi. Untuk lebih memvalidasi data array, dua kandidat gen yang diperoleh dengan pendekatan epigenomik tersebut, dipilih untuk studi lebih lanjut: cadherin-11 ( CDH11 ), gen penekan tumor dalam bidang keahlian kami 26 dan secretoglobin- 3A1 ( SCGB3A1 ), sebuah gen kandidat yang dipilih secara acak untuk menghindari segala jenis bias fungsional. Kedua gen dianalisis untuk menguji metilasi DNA mereka (Gambar 4a dan Gambar Tambahan S12), ekspresi gen (Gambar 4b) dan tingkat hunian nukleosom (Gambar 4c dan d dan Gambar Tambahan S13). Dalam kasus ini, profil metilasi DNA dipelajari di tiga daerah (hulu TSS, yang mengandung TSS dan hilir TSS) untuk kedua gen. Namun, uji aksesibilitas Msp I hanya dilakukan di dua wilayah (hulu TSS dan mengandung TSS) pada gen CHD11 , karena wilayah hilir TSS tidak mengandung situs pembatasan Msp I. Sekali lagi, hasil yang diperoleh untuk daerah yang berbeda dari masing-masing gen konsisten di setiap garis sel yang diteliti. CDH11 dan SCGB3A1 dimetilasi dalam garis sel HCT-116 dan tidak termetilasi dalam DKO. Pengobatan sel HCT-116 dengan agen demetilasi Aza, sebagian mengurangi metilasi DNA di semua daerah yang diteliti. Reintroduksi aktivitas DNMT1 dan DNMT3B di garis sel DKO sebagian remethylated daerah yang diteliti (Gambar 4a dan Gambar Tambahan S12). Metilasi DNA (HCT-116 dan DKO DNMT1 / 3B) selalu dikaitkan dengan penekanan atau pengurangan ekspresi, sementara promotor yang tidak termetilasi (DKO) atau pengurangan metilasi (HCT-116 Aza) dikaitkan dengan peningkatan transkripsi (Gambar 4b). ).

Image

Metilasi DNA, ekspresi, dan posisi nukleosom gen kandidat yang diperoleh dari array. ( a ) Status metilasi DNA dari wilayah yang mengandung TSS ditunjukkan pada gen yang dipilih untuk memvalidasi susunan: CDH11 dan SCGB3A1 (wilayah hulu dan hilir TSS ditunjukkan pada Gambar Tambahan S12). Dalam setiap kasus, delapan klon yang dimodifikasi bisulfit diurutkan. Kotak hitam dan putih sesuai dengan CpG teretilasi dan tidak termetilasi. ( B ) Ekspresi CDH11 dan SCGB3A1 ditentukan oleh PCR kuantitatif. ( c ) Uji aksesibilitas Msp I. Hasilnya digambarkan sebagai perbedaan n-lipat antara DNA yang tidak tercerna dan DNA yang dicerna 400 U / ml. Hanya hasil dari wilayah yang mengandung TSS yang disajikan (wilayah hulu dan hilir TSS ditunjukkan pada Gambar Tambahan S13). ( d ) Protokol M-SPA yang disesuaikan untuk mempelajari wilayah yang sama seperti pada ( a ) pada resolusi yang lebih tinggi. Lingkaran, segitiga dan kotak, masing-masing, mewakili situs metilasi Msp I (C * CGG), Hae III (GGC * C) dan Alu I (AGC * T). Sosok hitam dan putih masing-masing mewakili situs yang dimetilasi dan tidak termetilasi. Daerah yang dapat diakses, di mana nukleosom tidak diposisikan, menjadi termetilasi, sementara daerah yang tidak dapat diakses tetap tidak termetilasi. Hanya hasil dari wilayah yang mengandung TSS yang disajikan (wilayah hulu dan hilir TSS ditunjukkan pada Gambar Tambahan S13). Signifikansi statistik dalam percobaan waktu nyata telah dinilai dengan uji ANOVA (* P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001).

Gambar ukuran penuh

Gen CDH11 dan SCGB3A1 juga dievaluasi pada tingkat hunian nukleosom melalui uji aksesibilitas Msp I (Gambar 4c dan Gambar Tambahan S13) dan mengadaptasi uji analisis promotor tunggal berbasis methyltransferase berbasis analisis (Gambar 4d dan Gambar Tambahan S13). Sekali lagi metilasi DNA dan represi transkripsi dikaitkan dengan hunian nukleosom padat di garis sel HCT-116, sementara DNA yang tidak termetilasi dikaitkan dengan tingkat ekspresi yang tinggi dan hunian nukleosom rendah di garis sel DKO (Gambar 4 dan Gambar Tambahan S12 dan S13) . Pengurangan metilasi DNA dalam garis sel HCT-116 setelah pengobatan Aza atau reintroduksi aktivitas DNMT1 dan DNMT3B dalam garis sel DKO menciptakan hasil antara, dengan sekitar 50% metilasi DNA (Gambar 4a dan Gambar Tambahan S12), ekspresi antara (Gambar 4b) dan hunian nukleosom menengah (Gambar 4c dan d dan Gambar Tambahan S13). Untuk menghindari hasil positif palsu dalam pengujian Msp I jika satu primer diposisikan di penghubung dari wilayah yang diduduki nukleosom, kami juga merancang set primer tambahan untuk percobaan ini dan data yang sama diperoleh (Gambar Tambahan S14).

Dengan demikian, baik pendekatan kandidat gen dan uji genomik mendukung kesimpulan bahwa metilasi DNA di pulau 5′-CpG gen penekan tumor berkontribusi untuk menentukan hunian nukleosom di wilayah ini dan bahwa peristiwa hipometilasi DNA menghilangkan nukleosom dari sekuens kaya CpG di sekitarnya. TSS masing-masing.

Diskusi

Pembungkus DNA di sekitar nukleosom 6 dan metilasi DNA 1 adalah dua mekanisme terkenal yang terlibat dalam regulasi ekspresi gen. Namun, seperti yang baru-baru ini dilaporkan, kejadian fenomena ini tampaknya lebih erat terkait daripada independen. 11, 12 Di satu sisi, meskipun ada hambatan untuk mencapai DNA yang mungkin dimiliki oleh nukleosom pada suatu enzim, enzim DNMT1 dan DNMT3B keduanya mampu mengetilasi situs CpG pada nukleosom yang dirakit secara in vitro . 27 DNA nukleosomal lebih teretilasi daripada mengapit DNA, menunjukkan bahwa DNMT mungkin mudah direkrut ke DNA yang terikat nukleosom, meningkatkan metilasi DNA dalam DNA nukleosom. 11 Dalam hal ini, menarik untuk melihat pola remetilasi yang diperoleh ketika DNMT1 dan DNMT3B secara stabil diperkenalkan kembali dalam garis sel DKO. Kehadiran nukleosom meningkatkan perekrutan DNMT, membuat metilasi DNA yang membungkus nukleosom lebih mudah. 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 Telah ditunjukkan bahwa DNMT3A dan DNMT3B sangat berlabuh pada nukleosom yang mengandung DNA teretilasi. 29 Faktanya, penahan ini berfungsi sebagai mekanisme umpan balik positif, memungkinkan penyebaran pola metilasi DNA melalui pembelahan sel somatik, dan mencegah degradasi DNMT3A dan DNMT3B. 30 Dengan demikian, posisi nukleosom membantu membentuk lanskap metilasi DNA. 11 Namun, di daerah remethylated dipelajari di DKO DNMT1 / 3B, tidak ada nukleosom diposisikan dalam garis sel DKO asli. Jadi tidak mungkin nukleosom dapat memandu proses remetilasi dalam garis sel DKO DNMT1 / 3B. Selain itu, panjang daerah yang lebih banyak dimetilasi dalam garis sel DKO DNMT1 / 3B tidak terkait dengan panjang DNA nukleosomal (∼ 147 bp). Oleh karena itu dapat dibayangkan bahwa ini juga terjadi sebaliknya: reintroduksi DNMT1 dan DNMT3B dalam garis sel DKO memetilasi DNA, nukleosom menjadi diposisikan dan dengan demikian transkripsi ditekan. Metilasi dan hunian nukleosom akan bertindak kooperatif untuk menekan transkripsi. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31

Di sisi lain, laporan lain telah mengusulkan bahwa DNMT1 hanya terkait secara longgar dengan kromatin, sebagian besar di daerah bebas linker atau nukleosom, sementara DNMT3A dan DNMT3B cenderung dikaitkan dengan nukleosom yang mengandung DNA yang sudah dimetilasi. 29 Memang, pada mamalia, substitusi I662N di DNMT3B bertanggung jawab untuk afinitas yang lebih tinggi dari enzim ini untuk DNA nukleosom. 28 Selain itu, metilasi DNA juga tampaknya mempengaruhi sifat-sifat struktural DNA, mengurangi afinitas DNA untuk histone octamer. 32 Namun, perubahan yang terdeteksi dalam pembentukan nukleosom dan posisi translasi sesuai dengan status metilasi CpG dari gen yang diteliti adalah halus. Lebih lanjut, penurunan afinitas oktamer oleh DNA teretilasi 29 mungkin menunjukkan bahwa penipisan nukleosom yang diamati pada peristiwa hipometilasi DNA, mungkin melibatkan kendala struktural tambahan selain interaksi histone / DNA sederhana. Kompleksitas proses ditunjukkan oleh temuan bahwa, meskipun dalam sebagian besar genom, DNA nukleosomal lebih disukai dimetilasi, 11 urutan spesifik seperti situs CTCF (faktor pengikat CCCTC) mungkin tidak mengikuti tren ini. 34

Data kami menunjukkan bahwa metilasi DNA dan pemosisian nukleosom membentuk satu sama lain dalam cara dua arah yang saling melengkapi: dalam model kami, metilasi DNA menentukan pemosisian nukleosom, tetapi dalam konteks lain hunian nukleosom menentukan pola metilasi DNA. Dalam penelitian kami, pulau 5′-CpG (HCT-116) yang hypermethylated DNA selalu dikaitkan dengan level rendah atau nol ekspresi gen, sementara promotor yang tidak termetilasi (DKO) berkorelasi dengan tingkat ekspresi gen yang lebih tinggi. Selain itu, represi transkripsi juga berkorelasi dengan domain kromatin tertutup dengan hunian nukleosom padat, sementara gen yang ditranskripsi aktif memiliki tingkat hunian nukleosom yang lebih rendah. Perawatan 5-aza-2′-deoxycytidine dan sel DKO telah mengurangi tingkat metilasi DNA, meningkatkan transkripsi gen dan menurunkan hunian nukleosom, relatif terhadap garis sel HCT-116 tipe liar yang tidak diobati / liar. Reintroduksi aktivitas DNMT1 dan DNMT3B dalam sel DKO menyebabkan peningkatan metilasi DNA, represi transkripsi gen dan peningkatan hunian nukleosom. Hasil ini menunjukkan korelasi erat antara metilasi DNA, represi transkripsi dan hunian nukleosom tinggi. Hubungan ini tidak hanya bersifat lokal tetapi juga seluruh genom. Selain itu, jika penentuan posisi nukleosom mempengaruhi lanskap metilasi DNA, 11, 12 bukti kami menunjukkan bahwa proses timbal balik juga mungkin terjadi.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Data pelengkap

    Informasi Tambahan menyertai makalah ini di situs Oncogene (//www.nature.com/onc)