Epex / epcam dan oct4 atau klf4 saja sudah cukup untuk menghasilkan sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi melalui stat3 dan hif2α | laporan ilmiah

Epex / epcam dan oct4 atau klf4 saja sudah cukup untuk menghasilkan sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi melalui stat3 dan hif2α | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Sel biologi
  • Sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi

Abstrak

Molekul adhesi sel epitel (EpCAM) dilaporkan dibelah menjadi domain ekstraseluler EpCAM (EpEX) dan domain intraseluler EpCAM (EpICD). Kami sebelumnya melaporkan bahwa EpCAM berfungsi sebagai penanda sel induk kuat yang sangat dan selektif diekspresikan oleh hESC yang tidak terdiferensiasi daripada terdiferensiasi. Namun, peran fungsional EpCAM tetap sulit dipahami. Di sini, kami menemukan bahwa EpEX dan EpCAM meningkatkan efisiensi pemrograman ulang OSKM. Menariknya, Oct4 atau Klf4 saja, tetapi bukan Sox2, dapat berhasil memprogram ulang fibroblast ke iPSC dengan EpEX dan EpCAM. Selain itu, EpEX dan EpCAM memicu pemrograman ulang melalui aktivasi STAT3, yang mengarah pada translokasi nuklir HIF2α. Studi ini mengungkapkan pentingnya sinyal EpEX / EpCAM-STAT3-HIF2α novel dalam proses pemrograman ulang, dan mengungkap cara baru untuk memicu pemrograman ulang dengan mengirimkan protein yang larut dan transmembran.

pengantar

Embryonic stem cells (ESCs) mampu menghasilkan ketiga lapisan kuman dan berdiferensiasi menjadi semua jenis sel tubuh, kecuali plasenta 1 . Namun, penerapan ESC dalam pengobatan regeneratif terhambat karena penolakan kekebalan dan onkogenitas. Untungnya, prospek untuk penelitian regeneratif dikembangkan oleh penemuan terobosan bahwa sel induk berpotensi majemuk (iPSCs) dapat dibentuk dari sel somatik, seperti fibroblas 2 . Penggunaan teknologi iPSC menghindari masalah penolakan kekebalan tubuh 3 . Studi sebelumnya menunjukkan bahwa iPSC menyerupai ESC dalam hal pluripotensi, morfologi, persyaratan pertumbuhan dan proliferasi, penanda dan ekspresi gen, dan fitur epigenetik dan fungsional 2, 4, 5 .

Secara tradisional, iPSC dihasilkan menggunakan empat faktor, Oct4 (O ), Sox2 (S ), Klf4 (K ), dan c-Myc (M ) (OSKM), yang sekarang disebut faktor Yamanaka 2 . Semua faktor Yamanaka adalah faktor transkripsi, dan mekanisme molekuler terperinci yang mendasari pengaruhnya masih belum sepenuhnya dipahami. Banyak upaya telah dilakukan untuk memperoleh iPSC dari spesies yang berbeda dan tipe sel somatik yang berbeda dengan memberikan empat faktor Yamanaka 6 .

Badan penelitian yang sedang berkembang dikhususkan untuk mengidentifikasi strategi pemrograman ulang yang lebih nyaman dan efisien. Laporan tertentu telah menunjukkan bahwa iPSC dapat dihasilkan oleh kurang dari empat faktor Yamanaka, tetapi sel yang diprogram ulang perlu mengekspresikan beberapa faktor Yamanaka secara endogen. Sebagai contoh, sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs) dan sel induk hematopoietik (HSCs) sudah menyatakan kadar Klf4, 7, 8, 9 yang tinggi, dan dengan demikian aplikasi Oct4 dan Sox2 cukup untuk memprogram ulang HUVEC dan HSC ke dalam iPSCs 7, 8, 9 . Demikian pula, sel induk saraf manusia (NSCs) atau sel papilla dermal dengan tingkat ekspresi endogen tinggi Sox2 dan c-Myc dapat diprogram ulang menjadi iPSC dengan Oct4 dan Klf4 10, 11, 12 . Karena NSC juga mengekspresikan protein Sox2, Oct4 cukup untuk memprogram ulang NSC menjadi iPSC dengan efisiensi rendah 13, 14 . Semua penelitian ini dengan satu atau dua faktor Yamanaka membutuhkan sel yang mengekspresikan tingkat endogen tinggi dari satu atau dua faktor pemrograman ulang (Hester et al . 10 ; Kim et al . 11 ; Ho et al . 7 ; Tsai et al . 12 ). Dalam fibroblast, sebuah penelitian telah berhasil memprogram ulang fibroblast tikus dan manusia dengan Oct4 dan Sox2 15, dan efisiensi pemrograman ulang iPSCs telah sangat meningkat dengan scompound molekul kecil tertentu yang telah ditentukan. Selain itu, fibroblast tikus dapat membentuk iPSCs dengan Oct4 dan senyawa molekul kecil 17 . Namun, beberapa faktor protein terlarut dan protein membran telah dilaporkan untuk mempromosikan pembentukan iPSC. Oleh karena itu, ada peningkatan minat dalam mengidentifikasi faktor pemrograman ulang novel yang bukan faktor transkripsi atau pengubah kromatin.

Molekul adhesi sel epitel (EpCAM) adalah protein transmembran tipe I 34 ~ 40-kDa, yang merupakan antigen terkait tumor yang terkenal yang diekspresikan secara melimpah dalam berbagai jenis karsinoma 18 . EpCAM terdiri dari tiga domain berbeda; wilayah ekstraseluler (EpEX), domain transmembran, dan domain intraseluler (EpICD) 19 . Kami sebelumnya menunjukkan bahwa EpCAM tidak hanya diperkaya dalam ESC, di mana ia mengatur empat faktor Yamanaka 20, tetapi juga memainkan peran penting dalam mengatur kemampuan memulai kanker, pembaruan diri, dan invasif pada kanker usus besar 21 . Selain itu, telah dilaporkan bahwa overekspresi EpCAM atau EpICD menurunkan ekspresi p53 dan p21, dan mengaktifkan aktivitas promotor Oct4 dalam memprogram ulang MEFs 4 . Namun, tidak diketahui apakah EpEX dapat meningkatkan efisiensi pembentukan iPSC dan apakah EpCAM / EpEX dapat menggantikan satu atau lebih faktor Yamanaka. Peran fungsional EpEX dalam sel punca dan proses pemrograman ulang, serta sinyal hilir dan reseptor Epex, tetap sulit dipahami. Di sini, kami menunjukkan bahwa EpEX dan EpCAM cukup untuk memprogram ulang fibroblast ke iPSC hanya dengan Oct4 atau Klf4. Selain itu, kami menggambarkan cara baru untuk memicu pemrograman ulang dengan faktor terlarut dan protein transmembran, dan menjelaskan mekanisme yang mendasari melalui mana EpEX meningkatkan ekspresi gen pluripotency dengan mengatur sinyal STAT3-HIF2α.

Hasil

EpCAM / EpEX meningkatkan efisiensi pemrograman ulang di iPSC yang dimediasi OSKM

Kami memeriksa apakah EpEX dan EpCAM dapat meningkatkan efisiensi pemrograman ulang selama pembentukan iPSC yang dimediasi OSKM. Kami menggunakan sistem transposon PiggyBac untuk menghindari mutagenesis insersi yang dimediasi virus 22, 23 . Elektroporasi nuklir digunakan untuk mentransfeksi gen Oct4 (O ), Sox2 (S ), Klf4 (K ), c-Myc (M ), dan EpCAM (E ), yang diinduksi oleh doksisiklin pada fibroblas embrionik tikus (MEF) dengan promotor Oct4 GFP berbasis tenaga. Transfectants untuk selanjutnya disebut 'OSKM', 'OSKME', 'OSKM + EpEX', dan 'OSKME + EpEX'. Gambar 1A menggambarkan prosedur pembuatan iPSC. Koloni positif GFP (menunjukkan ekspresi Oct4 endogen) diamati setelah pemrograman ulang (Gbr. 1B). Dibandingkan dengan OSKM, efisiensi pemrograman ulang meningkat lebih dari 1, 6 kali lipat dalam OSKME dan OSKM + EpEX, dan 2, 4 kali lipat dalam OSKME + EpEX (Gbr. 1C dan Tabel 1).

Image

( A ) Garis waktu induksi iPSC. Ekspresi gen pemrograman ulang eksogen diinduksi oleh doksisiklin dari hari 2-21. Setelah induksi, koloni positif GFP dibentuk dengan OSKM (O: Oct4; S: Sox2; K: Klf4; M: c-Myc) atau OSKME (OSKM + EpCAM; E: EpCAM), dengan atau tanpa EpEX (larut ekstraseluler larut pengobatan domain EpCAM). ( B ) Mikroskopi fluoresensi digunakan untuk mengungkap ekspresi Oct4 dalam koloni Oct-GFP iPSC pada hari ke 25. Skala bar: 50 μm. ( C ) Formasi iPSC Oct4-GFP dievaluasi dengan memeriksa nomor koloni pada hari ke 25 di bawah mikroskop fluoresensi. ( D ) Pewarnaan alkali fosfatase dilakukan untuk memeriksa iPSC yang tidak berdiferensiasi. Skala bar: 50 μm. ( E ) Ekspresi gen pluripotency di iPSCs. Analisis Q-PCR digunakan untuk menunjukkan bahwa iPSC mengekspresikan gen pluripotensi endogen Oct4, Sox2 , dan Nanog . MEFs orang tua digunakan sebagai kontrol (n = 3). ( F ) Analisis Western blot dilakukan untuk mengungkapkan bahwa iPSC mengekspresikan protein Oct4, Sox2, dan Nanog (n = 3). ( G ) Pluripotensi dari iPSC diperiksa dengan pembentukan teratoma. Tikus disuntik dengan OSKM dan OSKME + EpEX iPSCs (n = 3). Skala bar: 50 μm.

Gambar ukuran penuh

Tabel ukuran penuh

Status tidak terdiferensiasi dari semua iPSC dikonfirmasi oleh pewarnaan alkaline phosphatase (AP) (Gbr. 1D). Jumlah RNA ( Oct4, Sox2, Nanog ) dan protein (Oct4, Sox2, Nanog) dalam iPSC sebanding dengan yang ada pada ESC tikus (Gbr. 1E, F). Selanjutnya, pluripotensi iPSC diperiksa dengan pembentukan teratoma. The iPSCs (OSKM dan OSKME + EpEX kelompok) dibedakan menjadi tiga lapisan kuman: epitel saraf (ektoderm), otot rangka (mesoderm), dan epitel pernapasan (endoderm) (Gbr. 1G).

EpCAM / EpEX dengan Oct4 atau Klf4 dapat menginduksi iPSC

Selanjutnya, kami memeriksa apakah EpEX dan / atau EpCAM dapat menggantikan beberapa faktor Yamanaka dalam pembentukan iPSC. Gambar 2A menggambarkan protokol iPSC. Kami mentransfeksi sel dengan EpCAM yang diinduksi doxycycline, dengan atau tanpa faktor Yamanaka tunggal (Oct4, Sox2, atau Klf4), untuk menghasilkan empat kelompok: OE, SE, KE, dan E. Kami menghilangkan c-Myc karena oncogenisitas dan kemampuan mengeluarkannya. untuk pemrograman ulang 2, 24, 25 . Pembentukan koloni GFP tidak diamati dalam kondisi apa pun (Tabel 2).

Image

( A ) Protokol untuk generasi iPSC. ( B ) Mikroskopi fluoresensi digunakan untuk memvisualisasikan koloni iPSC ditransfeksi dengan Oct4 atau Klf4 dan EpCAM, dengan atau tanpa pengobatan EpEX (1 μg / mL). Grup OSKM berfungsi sebagai kontrol positif. Skala bar: 50 μm. ( C ) Pewarnaan alkaline fosfatase dilakukan untuk memeriksa status batang dari iPSCs. Skala bar: 50 μm. ( D ) Analisis microarray RNA dari profil gen global iPSC dari OSKM, OE + EpEX, dan KE + EpEX kelompok. Tiga klon berbeda dari sel ES tikus (mESC) (n = 3), empat klon berbeda dari setiap kelompok iPSC (n = 4). MEFs orang tua digunakan sebagai kontrol. Peta panas menunjukkan pola ekspresi gen global untuk setiap kelompok. ( E ) Scatter plot membandingkan profil ekspresi gen global iPSC yang dihasilkan oleh OSKM dan OE + EpEX atau KE + EpEX. ( F ) Status metilasi DNA dari promotor Oct4. Konversi disulfida dan pyrosequencing dilakukan untuk mendeteksi metilasi DNA promotor Oct4 pada kelompok yang ditunjukkan. Persentase tersebut mewakili tingkat metilasi pada posisi yang ditunjukkan.

Gambar ukuran penuh

Tabel ukuran penuh

Kami memperlakukan sel-sel ini dengan EpEX (ditunjuk sebagai EpEX, O + EpEX, S + EpEX, K + EpEX, OE + EpEX, SE + EpEX, KE + EpEX, dan E + EpEX). Koloni ditemukan pada kelompok KE + EpEX, OE + EpEX, dan OSKM (Gambar 2B dan Tabel 2). Efisiensi pembentukan iPSC adalah 0, 05% untuk kelompok OE + EpEX, 0, 03% untuk kelompok KE + EpEX, dan 0, 18% untuk kelompok OSKM (Tabel 2). Pewarnaan AP positif diamati untuk setiap kelompok (Gbr. 2C).

Karakterisasi iPSC dengan tes in vitro dan in vivo

Pola ekspresi gen global dari iPSCs tikus dan sel ES ini serupa (Gambar 2D). Plot pencar menunjukkan bahwa profil ekspresi gen global KE + EpEX dan OE + EpEX iPSCs mirip dengan OSKM iPSCs (Gbr. 2E). Keadaan metilasi DNA promotor Oct4 di iPSCs mirip dengan ESC, sementara promotor Oct4 sangat dimetilasi dalam MEF (Gbr. 2F). Ekspresi Oct4, Sox2, Nanog, dan SSEA1 (penanda permukaan sel ES tikus) dalam KE + EpEX, OE + EpEX iPSCs dan sel ES tikus sebanding (Gbr. 3A). Pewarnaan imunofluoresen menunjukkan sinyal positif yang kuat untuk Oct4, Sox2, Nanog, dan SSEA1 pada setiap kelompok iPSC, sebanding dengan ESC tikus (Gbr. 3B). Tingkat protein Oct4, Sox2, dan Nanog serupa pada semua iPSCs dan ESCs tikus (Gbr. 3C). OE + EpEX dan KE + EpEX iPSC mengekspresikan banyak gen pluripoten (lihat legenda Gambar Gambar. 3D) pada level yang setara dengan yang ada dalam garis sel ES tikus (Gambar. 3D). Selain itu, hilangnya me3H3K27 (merah) menunjukkan reaktivasi kromosom X di iPSC (Gbr. 3E).

Image

( A ) Flow cytometry dilakukan untuk mendeteksi Oct4, Sox2, Nanog, dan SSEA1 (n = 3). ( B ) Pewarnaan imunofluoresen dilakukan untuk mendeteksi Oct4, Sox2, Nanog, dan SSEA1 dengan mikroskop confocal (n = 3). Skala bar: 50 μm. ( C ) Western blotting untuk mendeteksi Oct4, Sox2, dan Nanog (n = 3). ( D ) Analisis Q-PCR (n = 3). Analisis Q-PCR digunakan untuk menunjukkan bahwa iPSCs mengekspresikan gen pluripotency endogen, termasuk Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog , Faktor Transkripsi Seperti Spalt-4 ( Sall4 ), pembalikan jenis kelamin yang sensitif terhadap dosis, pembalikan jenis kelamin yang sensitif terhadap dosis, wilayah kritis adrenal hipoplasia, pada kromosom X, gen 1 ( DAXR1 ), perkembangan pluripotensi terkait 5 ( Dppa5 ), protein jari seng ( ZFP ), faktor transkripsi sel embrionik ( UTF ) yang tidak dibedakan, protein pengikat PDZ yang kaya sistein ( CRIPTO ), ekspresi berkurang ( REX) ). Kelompok MEF orangtua digunakan sebagai kontrol. ( E ) me3H3K27 imunostaining MEF dan iPSC. Warna merah menunjukkan pewarnaan me3H3k27. Warna biru menunjukkan pewarnaan DAPI. Skala bar: 10 μm.

Gambar ukuran penuh

Kami memeriksa pluripotensi dari KE + EpEX dan OE + EpEX iPSC berdasarkan pada pembentukan teratoma (Gambar 4A). Kami menyuntikkan KE + EpEX dan OE + EpEX iPSC ke dalam blastokista berumur 3, 5 hari, dan mendeteksi kaset GFP di berbagai organ chimera dengan genotipe (Gbr. 4B). Transmisi germ-line pada kaset juga dikonfirmasi oleh sinyal positif GFP dalam punggungan gonad (embrio berusia 13, 5 hari) (Gbr. 4C).

Image

( A ) Pembentukan teratoma (n = 3). Tiga lapisan benih (ectoderm, endoderm, dan mesoderm) terdeteksi di semua iPSC. Skala bar: 50 μm. ( B ) Genotipe chimera. Klon iPSC tunggal diambil dan diperkuat untuk setiap kelompok. Kami menyuntikkan 6-11 iPSC ke dalam blastokista berumur 3, 5 hari (n = 3). Sinyal GFP mewakili chimerism di banyak jaringan. ( C ) Bubungan urogenital dalam embrio 13, 5 hari diamati di bawah mikroskop fluoresensi. Sinyal Oct4 dari iPSC terdeteksi di urogenital ridge (n = 3).

Gambar ukuran penuh

Sinyal STAT3 yang diinduksi EpEX / EpCAM selama pemrograman ulang

Array fosfo-kinase mengungkapkan bahwa EpEX secara signifikan meningkatkan protein STAT terfosforilasi, β-catenin terfosforilasi, dan protein kekurangan kinase 1 yang kekurangan lisin WNK (WNK1) (Gambar 5A, B). Selain itu, EpEX menurunkan fosforilasi p53, protein Ribosomal S6 kinase beta-1 (p70 S6 kinase), dan ribosom s6 kinase 1/2/3 (RSK1 / 2/3) (Gbr. 5A, B). Western blotting mengungkapkan bahwa EpEX secara signifikan mengaktifkan fosforilasi STAT3 (tirosin 705), dengan efek sedang pada fosfat-STAT2, STAT5, dan STAT6 (Gambar 5C).

Image

( A ) Susunan fosfo-kinase mendeteksi protein terfosforilasi dalam MEFs yang tidak diobati dan yang diobati dengan EpEX. ( B ) Kuantifikasi dengan kerapatan piksel rata-rata mengungkapkan bahwa enam protein terfosforilasi diatur oleh EpEX. ( C ) MEF dirangsang oleh EpEX dalam cara yang tergantung waktu. MEF diperlakukan oleh EpEX (1 μg / mL) selama 5, 15, 30, 60, atau 120 menit. Setelah pengobatan, sel dipanen, dan fosforilasi protein STAT terdeteksi oleh Western blotting (n = 3). ( D, E ) MEF dirangsang oleh EpEX dalam dosis dan cara waktu tergantung. MEF diperlakukan dengan EpEX pada konsentrasi 0, 0, 5, 1, 2, 5, 5, 10 μg / mL selama 15 menit, atau dengan EpEX (1 μg / mL) selama 5, 15, 30, 60, 120, 240, 360 min . Setelah pengobatan, sel dipanen, dan fosforilasi STAT3 terdeteksi oleh Western blotting (n = 3). ( F ) MEF dirangsang dengan EpEX (1 μg / mL) dan / atau LIF (1 μM) selama 1 jam. Fosforilasi STAT3 (Tyr 705) diperiksa oleh Western blotting (n = 3). (G dan H) MEF ditransfeksi dengan OSKM, OE, dan KE, dan diobati dengan EpEX. Setelah transfeksi, sel-sel dalam setiap kelompok (termasuk kontrol MEFs) dirangsang dengan doksisiklin (1, 5 μg / mL) dalam media iPSC (DMEM / F12 dengan serum sel punca sel batang, tanpa LIF) dan dipanen pada hari ke 3, 6, atau 9. STAT3 dan ekspresi protein phopho-STAT3 terdeteksi oleh Western blotting (n = 3). Ekspresi kinetik ditunjukkan setelah kuantifikasi.

Gambar ukuran penuh

Efek dosis dan tergantung waktu dari EpEX pada aktivasi STAT3 diperiksa oleh Western blotting. STAT3 fosforilasi (tirosin 705) secara signifikan diinduksi oleh EpEX dalam waktu 5 menit dan secara bertahap menurun setelah 4 jam (Gambar 5D). Dosis optimal EpEX untuk aktivasi STAT3 adalah 0, 5-5 μg / ml (Gbr. 5E). Karena LIF diketahui mempertahankan pembaharuan diri sel induk pluripotent embryonic stem (ESC) melalui STAT3 26, kami juga menguji efek EpEX dan / atau LIF pada fosforilasi STAT3 pada MEF. Dengan tidak adanya LIF, EpEX dapat mengaktifkan fosforilasi STAT3 ke tingkat yang sebanding dengan stimulasi LIF (Gbr. 5F). Co-inkubasi EpEX dan LIF secara signifikan meningkatkan fosforilasi STAT3, menunjukkan bahwa EpEX dapat menginduksi fosforilasi STAT3 tanpa LIF, dan sinyal-sinyal ini mungkin berbeda dari pensinyalan reseptor LIF / LIF; oleh karena itu, EpEX dan LIF memiliki efek sinergis yang signifikan pada aktivasi STAT3 (Gbr. 5F). Selain itu, kami menemukan tingkat total STAT3 dan fosfo-STAT3 meningkat pada OE + EpEX, KE + EpEX, dan pemrograman ulang OSKM pada hari 3, 6, dan 9, dibandingkan dengan MEF yang tidak dirawat (Gbr. 5G, H) . Setiap kelompok dipertahankan dalam media iPSC tanpa LIF. Dengan demikian, kami menunjukkan bahwa EpEX atau EpEX / EpCAM dapat mempromosikan pemrograman ulang melalui pensinyalan STAT3. Menindaklanjuti temuan bahwa pensinyalan STAT3 dan EpCAM / EpEX yang diinduksi EpEX dapat membantu memulai pemrograman ulang, kami melanjutkan untuk memeriksa apakah EpCAM sangat penting untuk pemeliharaan iPSC dengan merobohkan ekspresi EpCAM dengan dua klon shRNA EpCAM di iPSCs. Deplesi EpCAM menurun STAT4 Oct4, Nanog, Klf4, dan terfosforilasi, tetapi tidak total STAT3 (Gambar Tambahan S2A). Dengan demikian, EpCAM sangat penting untuk menjaga tingkat faktor pluripotent serta pensinyalan STAT3. Selain itu, WP1066, penghambat STAT3, secara signifikan menekan ekspresi Oct4, Klf4, dan Nanog, menunjukkan bahwa STAT3 sangat penting untuk pemeliharaan pluripotensi dalam iPSC (Gambar Tambahan S2B). Secara bersama-sama, EpEX mempromosikan aktivasi STAT3 di MEF, dan EpCAM mempromosikan ekspresi gen pluripotent melalui aktivasi STAT3.

EpEX mengaktifkan HIF2α melalui STAT3 selama pembentukan iPSC

HIF2α (hypoxia inducible factor 2α) mendukung Oct4 di ESCs tikus 27 dan meningkatkan batang dengan mengikat ke promotor Nanog di ESC manusia 28 . Pensinyalan IL6-STAT3-HIF2α berkontribusi terhadap angiogenesis pada kanker ovarium 29 . HIF2α telah ditemukan untuk meningkatkan kadar Oct4, Sox2, dan Nanog untuk mempertahankan pluripotensi 30 . Selain itu, ekspresi EpCAM diperlukan untuk ekspresi HIF2α (Gbr. 6A). Dengan demikian, kami berhipotesis bahwa HIF2α dapat berpartisipasi dalam pemrograman ulang yang diperantarai EpEX-STAT3. Kami telah menunjukkan bahwa EpEX menginduksi translokasi nuklir HIF2α pada fibroblast (Gambar 6B, C) dan WP1066 (penghambat STAT3) menghapuskan translokasi nuklir HIF2α yang diinduksi EpEX (Gbr. 6D). Kami telah mengkonfirmasi bahwa mekanisme yang mendasari WP1066 adalah melalui pendeteksian fosforilasi STAT3 yang dihambat (Gbr. 6D). Hasil ini menunjukkan bahwa translokasi nuklir HIF2α yang diinduksi EpEX diatur oleh STAT3. Selain itu, iPSC tidak terbentuk ketika kelompok OSKM, OE + EpEX, atau KE + EpEX diperlakukan dengan WP1066 atau HIF2α shRNA (dua klon, # 1 dan # 2) (Gbr. 6E).

Image

( A ) iPSC terinfeksi dengan dua shRNA EpCAM yang berbeda (dua klon, # 1 dan # 2). Ekspresi protein EpCAM dan HIF2α terdeteksi oleh Western blotting. ( B ) MEF dirangsang oleh EpEX (1 μg / mL) pada waktu yang ditunjukkan. Translokasi nuklir terdeteksi dengan antibodi spesifik terhadap HIF2α (n = 3). ( C ) Pewarnaan imunofluoresensi dilakukan untuk mendeteksi lokalisasi subseluler HIF2α. Inti diwarnai dengan DAPI. Skala bar: 10 μm. ( D ) MEF diobati dengan STAT3 inhibitor (WP1066, 10 μM), dan kemudian distimulasi dengan EpEX selama 30 menit. Translokasi nuklir HIF2α terdeteksi oleh Western blotting dengan antibodi anti-HIF2α (n = 3). ( E ) morfologi iPSC diamati pada hari ke 20 setelah induksi. Pemrograman ulang Okt4-GFP MEF diinduksi oleh transfeksi OSKM, OE + EpEX, dan KE + EpEX dengan atau tanpa STAT3 inhibitor WP1066, atau HIF2α shRNA (n = 3). Skala bar: 50 μm.

Gambar ukuran penuh

Dengan demikian, STAT3 dan HIF2α sangat penting untuk regulasi pluripotensi dan pemeliharaan di iPSC. Selain itu, kami mendeteksi ekspresi faktor pluripotent (Oct4, Sox2, Klf4, Nanog, EpCAM) selama pemrograman ulang (Gambar Tambahan. S1), ekspresi EpEX dalam medium terkondisi, dan ekspresi EpCAM dalam sel pada hari ke 3, 6 dan 9 (Gambar Tambahan. S3). Hasilnya menunjukkan bahwa EpEX dan EpCAM mempromosikan pemrograman ulang iPSC melalui aktivasi STAT3 dan translokasi HIF2α.

Diskusi

Studi ini mengungkapkan bahwa (i) EpCAM dan EpEX meningkatkan kemanjuran generasi iPSC, (ii) EpEX / EpCAM dapat membentuk iPSC hanya dengan satu faktor Yamanaka (Klf4 atau Oct4), (iii) EpEX / EpCAM mempromosikan pembentukan iPSC melalui STAT3-HIF2α pensinyalan. Ini adalah laporan pertama yang menunjukkan bahwa faktor Yamanaka dapat digantikan oleh protein transmembran, EpCAM, dan domain ekstraselulernya (EpEX).

EpCAM sangat penting untuk ekspresi Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc dan SSEA-1, dan aktivitas alkaline phosphatase 20, 31 . Di sini, kami menemukan bahwa EpCAM dan EpEX meningkatkan efisiensi pembentukan iPSC, sementara penghambatan EpCAM meregulasi ekspresi Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc (Gambar Tambahan S2A). Kami pertama kali menunjukkan bahwa fibroblast dapat diprogram ulang oleh faktor Yamanaka tunggal (baik Oct4 atau Klf4) dalam kombinasi dengan EpEX dan EpCAM. Ini menunjukkan bahwa EpEX dan EpCAM dapat menggantikan fungsi Sox2 dan Oct4 / Klf4 dalam pemrograman ulang.

Sebelumnya, telah ditunjukkan bahwa peningkatan ekspresi EpCAM meningkatkan pembentukan tumor sphere dan inisiasi tumor 21 . Pada 2009, Maetzel et al . mengusulkan konsep baru bahwa aktivasi jalur transduksi pensinyalan EpCAM permukaan-ke-nukleus pada kanker terjadi melalui proteolisis intraseluler yang diatur 32 . Setelah pembelahan proteolitik, domain ekstraseluler EpCAM dibelah oleh ADAM17 teraktivasi (TACE) untuk melepaskan EpEX yang larut. Selanjutnya, EpICD dipotong oleh γ-secretase. Peningkatan rilis EpEX meningkatkan produksi EpICD dan mengatur ekspresi faktor pemrograman ulang 21 . EpICD mengaitkan dengan β-catenin dan kofaktor FHL2 (empat setengah protein domain LIM 2) untuk membentuk kompleks transkriptome yang mentranslokasi ke dalam nukleus untuk memodulasi aktivitas transkripsi dari gen target, seperti c-Myc dan mempromosikan perkembangan tumor 32, 33 .

EpEX baru-baru ini diidentifikasi sebagai bagian ekstraseluler yang dikeluarkan dari protein transmembran, EpCAM 32 . Kami sebelumnya menunjukkan bahwa EpCAM diperkaya dalam ESC manusia dan bahwa EpICD mengikat promotor faktor Yamanaka 20 . Selain itu, ekspresi berlebih EpCAM mendorong pembentukan iPSC melalui penghambatan p53 dan p21 4 . Fungsi dan sinyal EpEX belum pernah dilaporkan dalam pemrograman ulang atau pembaruan ESC. Kami menemukan bahwa iPSC dapat dibentuk dengan menggunakan EpCAM dan EpEX, dikombinasikan dengan satu faktor Yamanaka, Oct4 atau Klf4 (Gambar 2, 3 dan 4) dan bahwa EpEX meningkatkan efisiensi pembentukan iPSC (Gbr. 1). Ini mendorong kami untuk menyarankan bahwa EpEX dan EpCAM dapat mengaktifkan pensinyalan untuk memulai pemrograman ulang. Karena iPSC tidak dibentuk dalam kelompok SE + EpEX tetapi terbentuk dalam kelompok OE + EpEX dan KE + EpEX, kami mengusulkan bahwa EpEX / EpCAM tidak dapat menggantikan fungsi Oct4 dan Klf4, tetapi dapat menggantikan Sox2, atau membantu meningkatkan Sox2, atau membantu meningkatkan Level Sox2 selama pemrograman ulang. Sebelumnya, dilaporkan bahwa sinyal STAT3 mengatur regulasi ekspresi Sox2 34, sehingga kami berhipotesis bahwa EpEX / EpCAM dapat mengatur regulasi Sox2 dengan mengaktifkan STAT3.

Telah ditunjukkan bahwa suatu penghambat molekul kecil dengan beberapa faktor tertentu dapat menggantikan Oct4 dan Sox2 35, 36, 37 . E-cadherin menginduksi pemrograman ulang dengan tiga faktor Yamanaka (Sox2, Klf4, dan c-Myc), tanpa Oct4 38 . Namun, tidak seperti EpCAM / EpEX, tidak satu pun dari sinyal-sinyal ini dapat secara bersamaan menggantikan Oct4 dan Sox2, dan memprogram ulang fibroblast dengan Klf4 saja. EpICD mengikat promotor faktor Yamanaka dalam ESC manusia 20, sementara EpEX memicu produksi EpICD serta mengatur ekspresi faktor pemrograman ulang dalam sel kanker usus besar 20, 21, 32 ; Oleh karena itu, faktor pemrograman ulang endogen dapat diatur naik di OE + EpEX dan KE + EpEX iPSCs. Soluble EpEX meningkatkan pembelahan EpEX dan menginduksi pensinyalan EpICD dengan cara autokrin atau parakrin, dan mempromosikan inisiasi dan perkembangan tumor 21 . Selain itu, kami menunjukkan bahwa aktivitas TACE di iPSCs dan ESCs tikus sangat diinduksi dibandingkan dengan MEF (Tambahan Gambar. S4A). Menariknya, kami mendeteksi aktivitas TACE di OSKM, OE + EpEX, KE + EpEX, OE + TACE, dan kelompok KE + TACE, dan menemukan efek menambahkan TACE mirip dengan pengobatan EpEX selama induksi awal pemrograman ulang pada hari 3 (Gambar Tambahan. S4B). EpEX menginduksi fosforilasi dan aktivasi TACE di MEFs (Gambar Tambahan. S4C, D). Selain itu, kami menyelidiki apakah pengobatan MEFs dengan TACE dapat mengakibatkan pelepasan EpEX dan mungkin memiliki efek yang sama untuk pemrograman ulang. Kami mentransfeksi EpCAM dengan Oct4 atau Klf4, dan diobati dengan TACE (5 ng / mL). Hasil penelitian menunjukkan bahwa iPSC tidak terbentuk dalam kelompok OE + TACE, dan KE + TACE pada hari ke 20 (Gambar Tambahan. 7). Hasil seperti itu menunjukkan bahwa pengobatan TACE dapat menyebabkan pelepasan EpEX. Namun, tingkat EpEX seperti itu kemungkinan tidak cukup untuk memicu sinyal pemrograman ulang.

Selain itu, kami menemukan bahwa EpEX menginduksi fosforilasi STAT3 dalam MEF, menunjukkan bahwa EpEX dapat berfungsi sebagai sitokin. Dengan demikian, kami menduga bahwa EpEX dapat mengaktifkan reseptor dan dapat memulai pemrograman ulang melalui transduksi sinyal hilir. Kami menunjukkan bahwa EpEX dapat menginduksi fosforilasi EGFR, PDGFR, HER2, dan Axl oleh array phospho-kinase (Gambar Tambahan. S5A, B). Studi terbaru menunjukkan bahwa EGFR dan PDGFR memainkan peran penting dalam pemrograman ulang 39, 40, yang konsisten dengan hasil kami sebelumnya dan dapat menjelaskan kemanjuran pengobatan EpEX. Selain itu, kami menganggap konsentrasi EpEX, yang kami optimalkan dalam penggunaan iPSC, jauh lebih tinggi dibandingkan dengan pelepasan EpEX. Oleh karena itu, perawatan EpEX dapat meningkatkan pensinyalan ini dan mendorong inisiasi generasi iPSC. Selain itu, kami menduga bahwa karena MEF tidak mengekspresikan EpCAM secara endogen, kemanjuran pengobatan TACE mungkin tidak memiliki pengaruh dalam memicu proses inisiasi pada awal pemrograman ulang, sementara pengobatan EpEX dapat memberikan dampak potensial pada inisiasi pemrograman ulang melalui pemicu dan peningkatan ini. pensinyalan.

Atau, kami mengkonfirmasi pentingnya EpICD selama induksi awal pemrograman ulang dan menyampaikan EpCAM terpotong EpicD dan Oct4 atau Klf4 dan sendirian dengan perawatan EpEX di MEFs. Konstruksi EpCAM terpotong EpICD dikonfirmasi oleh Western blotting (Tambahan Gambar. S6). Kami tidak mengamati pembentukan iPSC dalam kelompok EpCD terpotong EpICD dengan Oct4 atau klf4 dengan pengobatan EpEX pada Hari 20 (Tambahan Gambar. S7), yang menunjukkan perlunya EpICD.

Beberapa jenis faktor diidentifikasi untuk dapat menggantikan Oct4 selama pemrograman ulang, seperti GATA3, GATA6 dan SOX7 (penentu garis keturunan mesendoderm) 35 atau pengganti Sox2, ZNF521 (penentu ektoderm) 36 . Selain itu, faktor transkripsi ibu Glis1 dan Nr5a2 dapat menggantikan Oct4 untuk pemrograman ulang 41, 42 . E-cadherin juga telah dilaporkan menginduksi pemrograman ulang dengan tiga faktor Yamanaka (Sox2, Klf4, dan c-Myc), tanpa perlu untuk Oct4 38 . Menariknya, E-cadherin dan molekul adhesi sel lainnya juga memiliki peran fungsional dalam transisi mesenchymal ke epithelial (MET) 43, 44, yang sangat penting untuk pemrograman ulang iPSC. Namun, dengan pengecualian EpCAM dan EpEX, tidak ada yang secara bersamaan dapat menggantikan sinyal Oct4 dan Sox2 dan memprogram ulang fibroblast dengan hanya Klf4. Kami juga mengusulkan bahwa EpCAM / EpEX tidak cukup untuk menggantikan Oct4 dan Klf4 dan bahwa itu dapat bertindak sebagai driver ectoderm karena kegagalan pembentukan iPSC dalam kelompok SE + EpEX. Hipotesis lain adalah bahwa EpEX dan EpCAM mempromosikan pembentukan iPSC melalui rute lain. Misalnya, EpCAM diekspresikan dalam sel epitel 18 . Dengan demikian, akan menarik untuk menentukan apakah EpCAM dan EpEX mempromosikan MET untuk memfasilitasi pembentukan iPSC. Di sini, kami menggambarkan jalur novel: pensinyalan EpEX / EpCAM / STAT3 / HIF2α. Pensinyalan STAT3 sangat penting untuk ESC tikus dan sel induk pluripoten naif, dan diaktifkan oleh LIF 26 ; EpEX menginduksi fosforilasi STAT3 pada MEF tanpa adanya LIF (Gbr. 5C – E). Penambahan EpEX dan LIF secara sinergis meningkatkan fosfat-STAT3, dibandingkan dengan sel yang diobati dengan hanya EpEX atau LIF (Gbr. 5F). STAT3 total dan terfosforilasi diatur ulang selama induksi awal pemrograman ulang oleh EpEX tanpa adanya LIF (Gambar 5G, H).

HIF2α juga memediasi pluripotensi dengan membentuk kompleks dengan Oct4 dan dengan meningkatkan aktivitasnya 45 . Oleh karena itu, EpEX dapat menginduksi translokasi nuklir HIF2α dan mempromosikan ekspresi gen target. Menariknya, ekspresi HIF2α nuklir membutuhkan EpEX dan STAT3 (Gbr. 6A – D). HIF2α berinteraksi dengan enzim glikolitik, piruvat kinase isozyme M2 (PKM2), untuk mempromosikan transkripsi Oct4 28 . Ekspresi berlebih PKM2 meningkatkan level Oct4 dan mendukung pembaruan diri tanpa adanya LIF di ESCs 46 . Dengan demikian, EpEX juga dapat mengaktifkan PKM2 / HIF2α, di mana mengatur Oct4. Selain itu, EpICD sangat penting untuk pluripotensi dan pembaruan diri dalam ESC manusia 20 . Kami akan menentukan apakah EpEX mempromosikan pensinyalan EpICD dan apakah EpICD mengaitkan dengan HIF2α dan STAT3 untuk membentuk transkripsi yang berinteraksi untuk mempromosikan pemrograman ulang.

Sebagai kesimpulan, hasil kami menunjukkan bahwa EpCAM / EpEX mengaktifkan kompleks STAT3-HIF2α dalam pemrograman ulang iPSC. EpEX sangat menguntungkan pada generasi iPSC karena mengurangi risiko mutagenesis insersional. Temuan tersebut memberikan strategi baru untuk pembentukan iPSC dan dapat berkontribusi pada teknik kedokteran regeneratif di masa depan.

Metode

Isolasi sel pengumpan

Untuk isolasi MEF, kami mengisolasi uteri dari tikus pada hari ke 13, 5 kehamilan. Kepala, kaki, ekor, dan organ janin diangkat. Mayat yang tersisa dicuci dalam PBS segar (mengandung 1% v / v penicillin-streptomycin), dicincang dengan gunting, dan diinkubasi dengan 0, 5% Trypsin-EDTA pada 37 ° C selama 20 menit. Sel dikumpulkan dengan sentrifugasi (200 g selama 5 menit pada suhu 4 ° C) dan diresuspensi dalam media segar. Sel dikultur pada piringan 100 mm pada suhu 37 ° C dengan 5% CO 2 .

Konstruksi plasmid

PB-TET-OSKM dibeli dari Addgene (20959; Addgene, Cambridge, MA, USA). Segmen OSKM dari PB-TET-OSKM telah dihapus menggunakan penghapusan gen berbasis PCR 41, dan Oct4, Sox2, Klf4, atau EpCAM kemudian dimasukkan masing-masing ke dalam tulang punggung PB-TET dengan pembatasan kloning enzim. Setiap konstruk dikonfirmasi dengan urutan DNA. Wilayah ekstraseluler asam amino N-terminal 289 dan domain transmembran dari tikus EpCAM diamplifikasi dengan reaksi rantai Polymerase (PCR) dan disubkloning ke dalam vektor ekspresi PCDNA3.1 / V5-A dan PB-TET-nya. Fragmen DNA HIF-2α masing-masing diamplifikasi dengan menggunakan HIF-2α cDNA (GenScript) sebagai templat. Fragmen HIF-2α PCR diapit oleh situs pembatasan KpnI dan XhoI, dibelah dengan KpnI / XhoI, dan kemudian dikloning ke situs terkait pcDNA3.1 / V5-vektor ekspresi A (Invitrogen).

generasi iPSC

Generasi iPSC dilakukan seperti yang dijelaskan 47 . Singkatnya, MEF dengan GFP yang didorong oleh promotor Oct4 diisolasi dari tikus E13.5 (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm1 (rtTA * M2) Jae / J; B6.129S4-POU5f1tm2Jae / J) (Jackson Lab) digunakan untuk menghasilkan iPSC. Kami menggunakan MEF dalam empat bagian dan dikultur dengan DMEM glukosa tinggi, 10% FBS (Invitrogen), 1 mM L-glutamin (Invitrogen), 10 mM asam amino nonesensial (Invitrogen), 10 mM penicillin / streptomycin (Invitrogen), dan 10 mM HEPES (Invitrogen). Okt4-GFP MEFs (1 × 10 6 ) yang nukleofeksi dengan 2, 5 μg PiggyBac helper plasmid dan 2, 5 μg PB-TET-OSKM (20959; Addgene) 41, atau dengan kombinasi berbeda dari PB-TET-Oct4, PB-TET- Sox2, PB-TET-Klf4, atau PB-TET-EpCAM (tercantum dalam Tabel 1 dan 2). Setelah 24 jam, 1, 5 μg / ml doksisiklin ditambahkan untuk menginduksi ekspresi faktor pemrograman ulang untuk seluruh program pemrograman ulang. Media kultur pertama kali diubah 48 jam setelah nukleofeksi; diikuti oleh perubahan harian sampai pembentukan koloni yang terlihat sangat mengekspresikan GFP (biasanya setelah 21 hari). To estimate the reprogramming efficiency, we counted the number of GFP positive colonies (Oct4 positive) and divided them by the numbers of seeding cells (20000 cells/well). Wild type MEFs were isolated from C57BL/6 J mice at embryonic day 13.5 (E13.5) and were treated with mitomycin C (10 μg/mL) (MDBio, Inc. Taipei, Taiwan). The mouse iPSC and ESC medium consisted of Dulbecco's modified Eagle's medium/F-12 (DMEM/F12, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) with 20% knockOut serum replacement (Invitrogen), 1 μM LIF (Millipore, Billerica, MA, USA), 1 mM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10 mM nonessential amino acids (Invitrogen), and 1 mM L-glutamine (Invitrogen). After 24 h, doxycycline (1.5 μg/mL) (Sigma-Aldrich) was added to induce the expression of reprogramming factors for 21 days. The culture medium was changed daily after nucleo-transfection.

Alkaline phosphatase assay

Alkaline phosphatase staining was performed according to the manufacturer's recommendations (System Biosciences, SBI; AP100 R-1). Briefly, cells were fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) for 5 min, and then washed with PBS. Cells were stained with staining solution for at least 1 min, and the results were observed under a reflected-light microscope (Axio Scope Vario HAL 100, Carl Zeiss, Inc, Jena, Germany). Images were captured using a ZEISS cool SNAP camera (Carl Zeiss, Inc).

Quantitative real time RT-PCR

Total RNA was extracted using TRI reagent (Invitrogen, CA, USA), and 5 μg of total RNA were reverse transcribed into cDNA using oligo (dT) primer (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) with SuperScript III reverse transcriptase (Invitrogen). With the cDNA, quantitative real time RT-PCR (QRT-PCR) was performed using the Light Cycler® 480 SYBR Green I Master kit (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) and the LightCycler480 System (Roche Applied Science). The gene expression levels of each sample were normalized to the expression levels of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).

Primers are listed as follows: Oct4, forward: 5′-TCTTTCCACCAGGCCCCCGGCTC-3′; reverse: 5′-TGCGGG CGGACATGGGGAGATCC-3′; Sox2, forward: 5′-GGTTACCTCTTCCTCCCA CTCCAG-3′; reverse: 5′-TCACATGTGCGACAGGGGCAG-3′; KLF4, forward: 5′- GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC-3′; reverse: 5′-TCGCTTCCTCTTCCT CCGACACA-3′; c-Myc, forward: 5′-TGACCTAACTCGAGGAGGAGCTGGAATC -3′; reverse: 5′-AAGTTTGAGGCAGTTAAAATTATGGCTGAAGC-3′; Nanog, forward: 5′-AAAAAGCAGGCTCTGACATGAGTGTGGGTCTT-3′; reverse: 5′- AGAAAGCTGGGTAAGTCTCATATTTCACCTGG-3′; Sall4, forward: 5′-CAC CATGTCGAGGCGCAAGCAGGCGAAGCC-3′; reverse: 5′-TTAGCTGACAGC AATCTTATTTTCCTCCAG-3′; Dnmt3, forward: 5′-AAAAAGCAGGCTCAA TGGGTTCCCGGGAGACA-3′; reverse: 5′-AGAAAGCTGGGTCCTGGTTCT AGGAAAGACTT-3′; Dppa5, forward: 5′-AAAAAGCAGGCTGGA TGATGGTGACCCTCG TG-3′; reverse: 5′-AGAAAGCTGGGTCTGCATCCAGGT CGGAGAC-3′; DAX1, forward: 5′-TGCTGCGGTCCAGGCCATCAAGAG-3′; reverse: 5′-GGGCACTGTTCAGTTCAGCGGATC-3′; ZFP296, forward: 5′-CCA TTAGGGGCCATCATCGCTTTC-3′; reverse: 5′-CACTGC TCACTGGAGGGGGCTTGC-3′; UTF1, forward: 5′-GGATGTCCCGGTGAC TACGTCTG-3′; reverse: 5′-GGCGGATCTGGTTATCGAAGGGT-3′; CRIPTO, forward: 5′-ATGGACGCAACTGTGAACATGATGTTCGCA-3′; reverse: 5′-CTTTGAGGTCCTGGTCCATCACGTGACCAT-3′; REX, forward: 5′-ACG AGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA-3′; reverse: 5′-TATGACTCACTTCCA GGGGGCACT-3′.

Western blot analysis and Phospho-Kinase Array

Western blotting was performed as previously described 48 . Cells were lysed in lysis buffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1% Nonidet P-40) containing a protease inhibitor mixture (Roche Applied Science). Nuclear fraction and cytoplasmic fraction were separated by Nuclear/Cytosol Fractionation Kit according to the manufacturer's instructions (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA). Protein samples were separated by SDS-PAGE under denaturing conditions, and transferred to a PVDF membrane (Millipore). PVDF membranes were incubated with primary antibodies includes anti-Oct4 monoclonal antibody (ab107156, Abcam, Oxford, UK), anti-Sox2 monoclonal antibody (ab107156, Abcam), and anti-Nanog antibody (ab107156, Abcam), anti-phopho-STAT3 monoclonal antibody (ab94768, Abcam), anti-HIF2α antibody (NB100-122, Novus Biologicals, Cambridge, UK), anti-STAT3 (Catalog No. 9139, Cell Signaling Technologies), anti-EpEX (G8.8, eBioscience), anti-EpICD (E144, Abcam) anti-α-tubulin (1:5000; Sigma-Aldrich) and anti-GAPDH antibody (GeneTex, Irvine, CA, USA). Tubulin and GAPDH are the loading controls. Membranes were washed three times, and then incubated with horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse or anti-rabbit IgG (1:5000; Jackson ImmunoResearch, USA) for one hour. Finally, membranes were washed three more times, and subsequently developed using Chemiluminescence Reagent Plus (Thermo Fisher Scientific, Runcorn, UK). The Phospho-Kinase Array Kit (Proteome Profiler Antibody Array, R&D Systems) was used according to the manufacturer's instructions.

DNA microarray

Total RNA from ES cells, iPSCs, or MEFs were isolated using RNeasy® Plus Mini Kit (QIAGEN). RNA templates were then reverse-transcribed to cDNA and labeled with Cy3. Samples were hybridized to a mouse expression array 430 (51100, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) according to the manufacturer's protocol. Arrays were scanned with a Microarray Scanner System. Data were analyzed using GeneSpring GX software (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

Analisis aliran cytometry

Cells were dissociated with 0.25% trypsin-EDTA (1 mM) (Invitrogen) for 3 min, washed with fluorescence-activated cell sorting buffer (FACS buffer, PBS containing 1% fetal bovine serum), fixed in 4% PFA, and then permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS. Subsequently, cells were stained with Oct4, Sox2, Nanog, and SSEA1 antibodies (1:100) (ab107156, Abcam, UK), washed and suspended in FACS buffer, and incubated with secondary antibody (1:200; Jackson ImmunoResearch) for 60 min at room temperature. Flow cytometry analysis was performed with a BD FACSCanto II flow cytometer (BD Biosciences, CA, USA).

Pewarnaan imunofluoresensi

Feeder MEFs were seeded first onto Millicell EZ slides (Millipore), followed by iPSCs or ESCs. Cells were washed, fixed in 4% PFA for 10 min, and then permeabilized with 0.1% Triton X-100 for 10 min. For detection of SSEA1, a surface marker of iPSCs/ESCs, the cells were not permeabilized. Nonspecific binding sites on the cells were blocked with blocking buffer (1% BSA in PBS). Cells were stained with antibodies against Oct4, Sox2, Nanog, SSEA1 (1:100) (ab107156, Abcam), HIF2α (1:200) (NB100-122, Novus), me3H3k27 (1:200) (ab6147, Abcam) respectively for 60 min at RT, and then washed with PBS. Then the slides were incubated with goat anti-rabbit antibody conjugated with Alexa Fluor 568 (1:250; Invitrogen) for 1 h. After washing, the nuclear were stained with 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1:1000) (Invitrogen). Cells were observed under confocal microscopy (TCS SP5; Leica, Wetzlar, Germany).

Teratoma formation and histological analysis

The mice were supplied with sterile water and rodent pellets under the control of the animal facility of the Institution of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica, Taiwan. All procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica (AS IACUC). Protocol ID: 11-04-166.

The iPSCs (5 × 10 6 ) were suspended in DMEM containing 10% FBS, and was injected subcutaneously into the dorsal flank of nude mice. Four weeks after the injection, tumors were surgically dissected from the mice. Samples were fixed in PBS containing 4% PFA, and embedded in paraffin. Bagian diwarnai dengan hematoxylin dan eosin.

Chimeric mouse production and examination

The mice were supplied with sterile water and rodent pellets under the control of the animal facility of the Institution of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica, Taiwan. All procedures were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Academia Sinica (AS IACUC). Protocol ID: 11-04-166.

The iPSCs were injected into 3.5 day-old blastocysts by the Transgenic Mouse Model Core Facility of Academia Sinica (Taiwan). For genotyping of the chimera, genomic DNA was extracted using a DNA extraction kit according to the manufacturer's recommendations (QIAGEN, Valencia, CA, USA). The following primers were used: GFP, forward: 5′-ACGTAAACGGCCACAAGTTC-3′; reverse: 5′-GACTGGGTGCTCAGGTAGTG-3′; GAPDH, forward: 5′-AAGTCGCAGGAGACAACCTG-3′; reverse: 5′-CGTGCAGGACCTCACTCATT-3′. The urogenital ridge region of 13.5 day-old embryos was dissected under anatomical microscopy, and the tissues were mounted. The region was observed under a reflected-light microscope Axio Scope Vario HAL 100 (Carl Zeiss, Inc), and recorded with a ZEISS CoolSNAP camera (Carl Zeiss, Inc) controlled by MetaMorph software (Universal imaging Corporation, PA, USA).

Bisulfite pyrosequencing

Genomik DNA (1 μg) diisolasi menggunakan kolom QIAquick dan dikonversi menjadi bisulfit dengan kit modifikasi CEPAT Bisulfit sesuai dengan instruksi pabrik (QIAGEN). Daerah promotor dari tikus Oct4 diamplifikasi dengan metilasi PCR, dan produk PCR dideteksi oleh pyrosequencing (Genomics Inc, Taipei, Taiwan). Tiga kelompok primer biotinilasi dirancang untuk mendeteksi tingkat metilasi di daerah pada promotor Oct4. Primer terdaftar sebagai berikut: Assay 1, forward primer: 5′-GGTGGAGGAAGTAGATAATAATGAGAAT-3 ′; reverse primer (dibiotinilasi): biotin-ACACTTCAAAAACATAATCTCCAAACTC-3 ′; primer sequencing: 5′-AATAATGAGAATTTTTAGGAGATA-3 ′. Uji 2, pengalihan primer: 5′-AGAATAGTGTGAGGTGGAGTTTG-3 ′; reverse primer (terbiotinilasi): biotin-ACCATACTCCAACCACATCCTTCTCTAA-3 ′; primer sequencing: 5′-AGT TTGGAGATTATGTTTTTG-3 ′. Assay 3, forward primer: 5′-TAATTAGTTTGG GTTAGAGAAGGATGT-3 ′; membalikkan primer (terbiotinilasi): biotin-CCCCCCCTAAAAAAATATCCCTATAAC-3 ′; primer sequencing: 5′- GTT AGAGAAGGATGTGG -3 ′.

Ko-Imunopresipitasi

Sel T HEK 293 ditransfeksi bersama dengan HIF2α-V5 dan STAT3-Flag ekspresi plasmid menggunakan Reagen Transfeksi DNA PolyJet (Laboratorium SignaGen, Ijamsville, MD, USA) dan diisikan dalam buffer lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40) ditambah dengan protease (Roche). Untuk IP, lisat sel dikenakan inkubasi dengan antibodi yang ditunjukkan semalaman pada suhu 4 ° C. Kemudian, 20 μl Dynabeads® Protein G (Life Technologies, Inc.) ditambahkan dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4 ° C untuk menurunkan protein yang terikat antibodi. Sampel IP dicuci dengan buffer lisis lima kali, didenaturasi dalam buffer sampel SDS, dan dianalisis dengan analisis immunoblotting (IB).

Aktivitas TACE

Aktivitas ADAM17 diukur menggunakan kit aktivitas InnoZyme ADAM17 (Calbiochem). Singkatnya, sel lisat dipanen dan lisat dari masing-masing kelompok dimuat ke dalam lapisan berlapis antibodi TACE. Setelah 1 jam inkubasi, lisat diangkat dan piring dicuci dua kali. Substrat ditambahkan ke masing-masing sumur selama 5 jam pada 37 ° C. Setelah inkubasi, fluoresensi reaksi terdeteksi pada eksitasi dan panjang gelombang emisi 324 nm dan 405 nm.

transduksi shRNA

Untuk percobaan knockdown, mouse EpCAM dan luciferase shRNAs diperoleh dari fasilitas inti RNAi (Taipei, Taiwan) (klon EpCAM shRNA # 1, 5′-CCTGGTTATATCTACAAGGAA-3 ′; EpCAM klon # 2, 5′-CTCTGAATGAATATGGGAGA; klon shRNA 5′-CTTCGAAATGTCCGTTCGGTT-3 ′; HIF2α klon shRNA # 1, 5′-CGACAGAATCTTGGAACTGAT-3 ′; HIF2α shRNA klon # 2, 5′-GCCTCATGTCTCCATGt menjadi sel-sel dengan 3 ′ yang harus ditransfer ke dalam 3 sel ′. menghasilkan lentivirus Sel dipilih dengan 2 μg / mL puromisin 16 jam pasca infeksi.

Analisis statistik

Semua data disajikan sebagai rata-rata ± SEM untuk jumlah percobaan yang ditunjukkan. Uji t Student yang tidak berpasangan dilakukan untuk menghitung signifikansi statistik dari persentase ekspresi versus yang dari budaya kontrol. Nilai p kurang dari 0, 05 dianggap signifikan secara statistik.

informasi tambahan

Kode aksesi : Data RNA-seq mentah dan diproses telah disimpan dalam database Gene Expression Omnibus (GEO) di bawah nomor akses GSE71255.

Cara mengutip artikel ini : Kuan, I.-I. et al . EpEX / EpCAM dan Oct4 atau Klf4 saja sudah cukup untuk menghasilkan sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi melalui STAT3 dan HIF2a. Sci. Rep. 7, 41852; doi: 10.1038 / srep41852 (2017).

Catatan penerbit: Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Informasi tambahan

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.