Analisis microarray fungsional gen yang diekspresikan berbeda dalam sel granulosa dari wanita dengan sindrom ovarium polikistik yang berkaitan dengan pensinyalan mapk / erk | laporan ilmiah

Analisis microarray fungsional gen yang diekspresikan berbeda dalam sel granulosa dari wanita dengan sindrom ovarium polikistik yang berkaitan dengan pensinyalan mapk / erk | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Ekspresi gen
  • Gangguan reproduksi

Abstrak

Sindrom ovarium polikistik (PCOS) adalah gangguan endokrin yang paling umum pada wanita usia reproduksi. Meskipun etiologi dan patogenesisnya masih belum jelas, penelitian terbaru menunjukkan bahwa disfungsi sel granulosa sebagian mungkin bertanggung jawab. Penelitian ini bertujuan untuk menggunakan teknologi microarray cDNA untuk membandingkan profil ekspresi gen sel granulosa pada wanita dengan dan tanpa PCOS untuk mengidentifikasi gen yang mungkin secara etiologis terlibat dalam patogenesis PCOS. Kohort penelitian termasuk 12 wanita yang menjalani fertilisasi in vitro , enam dengan PCOS dan enam tanpa PCOS. Profil ekspresi gen diferensial dikelompokkan berdasarkan post-analisis data microarray, diikuti oleh analisis western blot untuk mengkonfirmasi data microarray dari gen yang dipilih. Secara total, 243 gen diekspresikan secara berbeda-beda (125 diregulasi dan 118 diregulasi) antara sel-sel PCOS dan non-PCOS granulosa. Gen-gen ini terlibat dalam pengembangan sistem reproduksi, metabolisme asam amino dan pengembangan dan proliferasi sel. Analisis komparatif mengungkapkan gen yang terlibat dalam jalur pensinyalan kinase yang diaktifkan-mitogen / ekstraseluler yang diatur (MAPK / ERK). Analisis Western blot mengkonfirmasi bahwa protein kinase yang diaktifkan mitogen-kinase kinase 4 dan fosfo-ERK1 / 2 mengalami penurunan pada sel-sel PCOS granulosa. Penelitian ini mengidentifikasi kandidat gen yang terlibat dalam jalur pensinyalan MAPK / ERK yang dapat mempengaruhi fungsi sel granulosa dalam PCOS.

pengantar

Polycystic ovary syndrome (PCOS) adalah endokrinopati heterogen yang umum ditandai dengan hiperandrogenemia (HA), terhambatnya perkembangan folikel ovarium, ketidakteraturan menstruasi dan ovarium polikistik yang mengakibatkan anovulasi dan infertilitas pada wanita usia reproduksi 1, 2, 3 . Selain itu, PCOS adalah penyebab utama beberapa masalah kesehatan lainnya pada wanita, termasuk disfungsi menstruasi, hirsutisme, jerawat, obesitas, dan sindrom metabolik 4, 5, 6, 7, 8 . Meskipun bukti menunjukkan bahwa PCOS memiliki etiologi yang kompleks dengan dasar genetik, etiologi genetiknya masih belum jelas 9, 10 .

Sel-sel granulosa penting dalam folikulogenesis ovarium karena mereka menyediakan lingkungan mikro yang cocok untuk perkembangan folikel dan pematangan oosit. Menanggapi sekresi gonadotropin hipofisis, sel granulosa meningkatkan ekspresi berbagai gen yang menyandikan komponen jalur steroidogenik yang terlibat dalam biosintesis estrogen 11 . Studi terbaru menunjukkan bahwa pada wanita dengan PCOS, disfungsi sel granulosa dapat berkontribusi pada folikulogenesis abnormal, kelebihan produksi androgen intraovarian dan / atau peningkatan kadar hormon anti-mullerian yang bersirkulasi, meskipun mekanisme yang mendasari masih dijelaskan 12, 13, 14, 15, 16, 17 . Oleh karena itu, secara klinis penting untuk mengeksplorasi mekanisme yang mendasari disfungsi sel granulosa pada wanita dengan PCOS.

Teknologi microarray DNA adalah modalitas yang cocok untuk memeriksa perubahan ekspresi gen global di antara sel granulosa dalam PCOS dan dapat membantu dalam identifikasi gen kandidat baru yang berkontribusi pada etiologi PCOS. Studi sebelumnya yang membandingkan susunan ekspresi gen dalam sel teka, sel ovarium, oosit, sel kumulus dan sel granulosa antara wanita dengan PCOS dan tanpa PCOS telah mengidentifikasi beberapa jalur kandidat yang mendasari ekspresi gen diferensial di antara berbagai jenis sel 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 . Namun, sejauh yang kami ketahui, profil ekspresi gen dan identifikasi mekanisme dalam sel granulosa-lutein yang diisolasi dari wanita Asia dengan berat normal dengan PCOS yang menjalani fertilisasi in vitro (IVF) belum dilaporkan.

Oleh karena itu, kami membandingkan profil ekspresi gen sel granulosa non-PCOS dan PCOS dari folikel preovulasi menggunakan chip microarray Affymetrix® untuk menilai perubahan global dalam profil ekspresi gen sel granulosa dan perubahan dalam jaringan genetika, transduksi sinyal, transkripsi / transkripsi / translasi dan / atau metabolisme jalur penting untuk fenotip sel granulosa PCOS yang dapat mempengaruhi pematangan oosit dan perkembangan folikel.

Hasil

Karakteristik klinis dan hormonal pasien dengan dan tanpa PCOS

Sel-sel granulosa diisolasi dari enam wanita tanpa PCOS dan enam wanita dengan PCOS yang menjalani IVF. Karakteristik klinis dan biokimia peserta penelitian tercantum dalam Tabel 1. Tidak ada perbedaan antara kelompok dalam hal usia; berarti BMI; tingkat FSH, LH dan E2 basal; glukosa AC; durasi stimulasi ovarium atau dosis total FSH. Panjang siklus menstruasi rata-rata, rasio LH / FSH, jumlah folikel yang disedot dan kadar testosteron total secara signifikan lebih tinggi pada kelompok PCOS daripada pada kelompok non-PCOS.

Profil gen yang diekspresikan secara diferensial

Semua 12 sampel dianalisis untuk memilih gen yang secara signifikan diregulasi atau downregulasi. Sebanyak 243 gen diekspresikan secara berbeda dalam sel granulosa dari kelompok non-PCOS dibandingkan dengan yang dari kelompok PCOS (Informasi tambahan 1). Gen yang diekspresikan secara diferensial divisualisasikan oleh pengelompokan hierarkis dan analisis komponen utama (Gbr. 1A, B). Dibandingkan dengan kelompok non-PCOS, 118 gen secara signifikan menurunkan regulasi dan 125 secara signifikan diregulasi dalam kelompok PCOS. 10 gen yang paling diregulasi dan downregulasi dalam kelompok non-PCOS dibandingkan dengan kelompok PCOS tercantum pada Tabel 2.

Image

( A ) Analisis komponen utama (PCA) dari seluruh tingkat ekspresi gen dari semua sampel. ( B ) Analisis kelompok hierarki dilakukan pada profil dari 243 gen yang diekspresikan secara berbeda-beda.

Gambar ukuran penuh

Tabel ukuran penuh

Fungsi, jaringan dan jalur transduksi sinyal dengan profil ekspresi gen yang diubah secara signifikan dalam sel granulosa dari wanita dengan PCOS

Perbedaan fungsional antara kedua kelompok digunakan untuk membangun jaringan interaksi gen-protein diferensial dari 243 gen yang diekspresikan secara berbeda yang diidentifikasi dalam sel granulosa. Ensiklopedia Kyoto analisis gen dan genom (KEGG) menunjukkan bahwa gen ini biasanya terlibat dalam pensinyalan MAPK, pensinyalan VEGF, metabolisme androgen dan estrogen dan metabolisme obat (Gbr. 2). Dari total delapan gen jalur pensinyalan MAPK yang diidentifikasi dalam sel granulosa non-PCOS, empat relatif diregulasi dan empat diregulasi dibandingkan dengan sel granulosa PCOS (Gbr. 2A). Dalam kelompok PCOS, kami juga mengidentifikasi tiga gen yang terkait dengan metabolisme androgen dan estrogen yang diturunkan regulasi (Gbr. 2B), lima gen terkait metabolisme obat (satu diregulasi dan empat diregulasi; Gbr. 2C) dan empat gen jalur pensinyalan VEGF (dua diregulasi dan dua diregulasi; Gbr. 2D). Selain itu, analisis IPA mengungkapkan keterlibatan dalam fungsi seluler berikut: pengembangan dan fungsi sistem reproduksi; metabolisme asam amino; morfologi sel; gangguan keturunan; pensinyalan dan interaksi sel-ke-sel; pengembangan dan proliferasi seluler; siklus sel dan replikasi DNA, rekombinasi dan perbaikan. Jaringan teratas yang diwakili dalam gen yang diekspresikan secara berbeda adalah pengembangan dan fungsi sistem reproduksi dan jaringan metabolisme asam amino (skor = 38) dalam sel granulosa non-PCOS dibandingkan dengan sel granulosa PCOS. Pengembangan sistem reproduksi dan jaringan fungsi menunjukkan representasi tinggi dari gen-gen berikut (Gbr. 3): gen reproduksi seksual, fosfolipase A2, grup IVA (sitosolik, tergantung-kalsium, PLA2G4A), steroid-5-alpha-reduktase, alpha polypeptide 2 (3-oxo-5 alfa-steroid delta 4-dehydrogenase alpha 2, SRD5A2), timidin kinase 1, TK1 terlarut dan faktor diferensiasi pertumbuhan 9 (GDF9) serta gen reproduksi yang terlibat dalam jalur MAPK / ERK. Selain itu, pengembangan sistem reproduksi dan jaringan fungsi ini dihubungkan oleh gen steroidogenik, LH, FSH, human chorionic gonadotropin (hCG) dan lipoprotein densitas rendah (Gbr. 3).

Image

( A ) jalur pensinyalan protein diaktifkan mitogen (MAPK), ( B ) metabolisme androgen dan estrogen, ( C ) metabolisme obat, dan ( D ) jalur pensinyalan faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) pada sel granulosa. Bilah hitam mewakili gen dengan ekspresi lebih besar dalam kontrol non-PCOS; bilah putih mewakili gen dengan ekspresi lebih besar dalam PCOS.

Gambar ukuran penuh

Image

Gen disusun dalam 4 kompartemen horisontal (inti, sitoplasma, membran plasma, dan ruang ekstraseluler). Perbedaan intensitas warna molekul menunjukkan ekspresi yang lebih tinggi atau lebih rendah.

Gambar ukuran penuh

Validasi data microarray dengan analisis western blot: ekspresi MAP3K4 dan ERK1 / 2 fosforilasi berkurang dalam sel-sel PCOS granulosa

Dalam penelitian ini, kami menggabungkan data KEGG dan IPA untuk mengidentifikasi perbedaan signifikan secara statistik dalam pensinyalan MAPK / ERK antara sel-sel non-PCOS dan PCOS granulosa. Untuk lebih memvalidasi apakah ada perbedaan pada tingkat protein, kami membandingkan ekspresi MAP3K4 dalam sel granulosa yang diperoleh dari tiga pasien independen lain dari masing-masing kelompok dengan analisis western blot dan mengamati penurunan 30% dalam ekspresi MAP3K4 dalam sel granulosa PCOS (Gbr. 4A ). Jalur MAPK yang paling banyak dipelajari adalah kaskade ERK, di mana ERK1 dan ERK2 membentuk komponen sentral dan telah terbukti berhubungan dengan steroidogenesis dalam sel granulosa 31, 32 . Selanjutnya, kami memeriksa mekanisme molekuler hilir p-ERK1 / 2 dan ERK1 / 2 dengan analisis western blot pada tiga pasien independen masing-masing dari kelompok non-PCOS dan PCOS. Analisis kami menunjukkan bahwa p-ERK1 / 2 relatif menurun pada sel-sel PCOS granulosa (Gambar 4B). Perbandingan MAP3K4 dan p-ERK1 / 2 mengungkapkan bahwa keduanya berkurang dalam sel granulosa PCOS dibandingkan dengan sel granulosa non-PCOS. Hasil ini sesuai dengan data yang diperoleh oleh uji microarray pada tingkat protein.

Image

Analisis western blot protein MAP3K4 ( A ) dan protein p-ERK1 / 2 ( B ) dalam sel granulosa non-PCOS dan sel granulosa PCOS. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), kontrol internal untuk kuantisasi. Bar chart mewakili kuantisasi tingkat protein. * P <0, 05. Batangan mewakili ± standar deviasi (SD) data dari ≥3 percobaan independen. Dalam ( A, B ) bagian yang relevan dari citra Western blot dipotong dari full-length blots yang ditunjukkan pada Gambar. S1.

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menggunakan data microarray DNA untuk mengidentifikasi gen yang diekspresikan secara berbeda dalam sel granulosa wanita dengan dan tanpa PCOS untuk memberikan informasi baru untuk studi lebih lanjut tentang mekanisme penyakit terkait dan juga untuk membawa kemajuan dalam pengobatan penyakit. Profil microarray ini menunjukkan bahwa tingkat MAP3K4 dan p-ERK1 / 2 teraktivasi berkurang dalam sel PCOS granulosa, yang berpotensi berkorelasi dengan reproduksi. Temuan ini memberikan bukti lebih lanjut bahwa jalur pensinyalan MAPK memainkan peran penting dalam patogenesis PCOS. Lebih lanjut, gen-gen yang diekspresikan secara berbeda ini juga terlibat dalam metabolisme androgen dan estrogen, metabolisme obat, dan pensinyalan VEGF.

Keterbatasan penelitian genetik PCOS ini adalah jumlah subjek yang relatif kecil, yang disebabkan oleh terbatasnya akses klinis ke jaringan pasien. PCOS adalah endokrinopati heterogen yang secara genetis kompleks memengaruhi 5% -10% wanita usia reproduksi. Kekuatan penelitian ini adalah PCOS dinilai hanya di antara wanita usia reproduksi (usia rata-rata, 34 tahun) yang menjalani IVF. Sangat sulit untuk mengumpulkan kohort yang cukup besar dari pasien tersebut karena rekrutmen kami wanita dengan PCOS didasarkan pada kriteria diagnostik Rotterdam dan hanya mereka dengan BMI normal 19-24 kg / m2 dan kadar AC glukosa 70-100 mg / dL dimasukkan untuk meminimalkan efek obesitas dan resistensi insulin.

Kami menggunakan analisis microarray, data IPA dan KEGG untuk mengidentifikasi beberapa jalur penting, jaringan fungsi biologis dan kelompok-kelompok gen PCOS kandidat yang signifikan. Kami juga membandingkan jalur untuk mengidentifikasi umum, unik dan persatuan peserta jalur dengan menghitung dan membandingkan signifikansi berbagai gen potensial antara kasus dan kontrol kami. Meskipun perbedaan dalam profil ekspresi gen cukup kecil, signifikansi memenuhi kriteria perangkat lunak IPA untuk penelitian komprehensif lebih lanjut dari gen unik ini.

Di antara 10 gen yang diekspresikan paling berbeda yang terdeteksi dalam penelitian ini, beberapa sebelumnya terbukti berhubungan dengan PCOS, termasuk aldehyde oxidase 1, kotak polipeptida DEAH (Asp-Glu-Ala-His) 16, kromosom 1 kerangka bacaan terbuka 54 dan F -kotak protein 5 19, 21, 33, 34 . RNA nuklir kecil 7SK dilaporkan diekspresikan pada testis pria dan juga sangat diekspresikan pada ovarium wanita 35 . Selain itu, kami mengamati bahwa limfoma B-sel 2 seperti 15 (BCL2L15), yang dilaporkan memainkan peran penting dalam folikulogenesis dan pematangan oosit 36, adalah di antara gen yang diregulasi. Khususnya, protein keluarga BCL2 adalah pengatur utama proses apoptosis yang mengatur perkembangan oosit manusia dan kelangsungan hidup 36, 37 . Oleh karena itu, kami mengusulkan bahwa kadar BCL2L15 yang diamati rendah dalam sel-sel PCOS granulosa dibandingkan dengan sel-sel non-PCOS granulosa dapat terlibat dalam peningkatan risiko PCOS.

Hasil kami juga menunjukkan bahwa sekelompok gen yang diregulasi atau downregulasi dalam sel PCOS granulosa terlibat dalam pengembangan dan fungsi sistem reproduksi. Gen-gen ini termasuk regulator transkripsi, leukemia 1 limfositik akut sel-T dan jari seng dan domain BTB yang mengandung 17; transporter, neuroglobin dan alpha-2-glikoprotein 1 dan protein pengikat seng, PLA2G4A, SRD5A2, TK1, GDF9, myeloperoxidase, reseptor transmembran limfosit-aktivasi gen 3 dan 6-fosfofrukto-2-kinase / fruktosa-2, 6-bifosfatase 1. Enzim PLA2G4A distimulasi oleh lonjakan LH / hCG yang preovulasi dalam sel granulosa folikel ovulasi 38 . SRD5A2 (enzim 5α-reductase) memainkan peran penting dalam kaskade metabolisme steroid untuk mengubah testosteron dan kortisol menjadi dihidrotestosteron dan dihidrokortisol, masing-masing 39 . Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa penurunan aktivitas SRD5A2 dikaitkan dengan patogenesis PCOS, bahkan pada wanita dengan berat badan normal. Oleh karena itu, peningkatan aktivitas enzim ini dapat menurunkan produksi kortisol dengan konsekuensi peningkatan kadar androgen. Bersama-sama, pengamatan ini menunjukkan bahwa SRD5A2 dapat mempengaruhi fungsi ovarium dan mempromosikan gejala HA pada PCOS, seperti hirsutisme, jerawat dan alopecia 40, 41 . Ekspresi abnormal dari enzim TK secara signifikan terkait dengan kejadian PCOS 42 . GDF9 adalah faktor pertumbuhan spesifik oosit yang memainkan peran kunci dalam komunikasi sel oosit-granulosa selama folikulogenesis 43, dan disregulasinya dapat berkontribusi pada folikulogenesis menyimpang pada PCOS 44 . Selain itu, gen-gen ini mengatur perkembangan dan fungsi reproduksi melalui beberapa jalur pensinyalan, termasuk MAPK / ERK, Akt, transduser sinyal dan aktivator transkripsi 5 dan mentransformasikan beta faktor pertumbuhan. Jalur MAPK / ERK terdiri dari rantai protein sel yang memfasilitasi transduksi sinyal dari sitosol ke nukleus untuk pengaturan kelangsungan hidup sel, proliferasi, dan diferensiasi melalui kaskade fosforilasi 45, 46 . Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa jalur pensinyalan MAPK / ERK alternatif dikaitkan dengan biosintesis steroid yang diinduksi FSH dalam sel granulosa 47, 48 . Selain itu, penelitian lain telah menentukan bahwa aktivasi abnormal jalur pensinyalan MAPK / ERK dalam jaringan yang berbeda dapat berkontribusi terhadap kerusakan yang diamati dalam pensinyalan metabolik dan produksi androgen ovarium berlebihan pada wanita dengan PCOS 49, 50 . Data microarray kami menunjukkan bahwa MAP3K4 diturunkan regulasi dalam sel granulosa PCOS dibandingkan dengan sel granulosa non-PCOS. Analisis IPA mengungkapkan bahwa pengembangan sistem reproduksi utama dan jaringan fungsi (skor = 38) berkorelasi dengan jalur pensinyalan MAPK / ERK. Atas dasar hasil ini, kami lebih lanjut menyelidiki pensinyalan MAP3K4 dan menentukan bahwa ekspresi hilir p-ERK1 / 2 menurun dalam sel-sel PCOS granulosa pada tingkat protein. MAP3K4 adalah MAPK yang mengaktifkan jalur pensinyalan kinase p -terminal N-terminal pAP dan c-Jun dalam sel somatik gonad embrionik dan mengatur aktivitas gonad embrionik 51, 52 . Studi ini adalah yang pertama untuk menunjukkan hubungan aktivasi MAP3K4 dengan PCOS dan untuk menunjukkan bahwa ia terlibat dalam jalur pensinyalan MAPK / ERK. Yang penting, profil ekspresi gen microarray yang diidentifikasi dalam penelitian ini memberikan wawasan lebih lanjut ke dalam mekanisme molekuler yang mendasari patogenesis PCOS. Namun, studi masa depan akan diperlukan untuk mengklarifikasi interaksi jalur pensinyalan MAPK / ERK dalam patofisiologi sel granulosa pada PCOS.

Sebagai kesimpulan, kami mengidentifikasi beberapa gen yang diekspresikan secara berbeda antara sel-sel non-PCOS dan PCOS granulosa. Data saat ini menunjukkan untuk pertama kalinya bahwa ekspresi pemain baru MAP3K4 berkurang dalam sel PCOS granulosa dan berpartisipasi dalam jalur transduksi sinyal MAPK / ERK. Gen-gen yang diekspresikan secara berbeda ini terlibat dalam berbagai fungsi biologis, khususnya reproduksi dan pengembangan, dan menyediakan mekanisme di mana sel-sel granulosa dapat berkontribusi pada patogenesis PCOS. Hasil ini akan membantu untuk lebih memperjelas dasar molekuler dan signifikansi fungsional dari beberapa gen baru yang terlibat dalam patogenesis PCOS.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Informasi tambahan

File Excel

  1. 1.

    Kumpulan Data Tambahan 1

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.