Defisiensi genetik dari kemarahan neuronal melindungi terhadap cedera sinaptik yang disebabkan oleh usia | kematian sel & penyakit

Defisiensi genetik dari kemarahan neuronal melindungi terhadap cedera sinaptik yang disebabkan oleh usia | kematian sel & penyakit

Anonim

Subjek

  • Pensinyalan sel
  • Penuaan kognitif
  • Penyakit neurodegeneratif
  • Patogenesis

Abstrak

Disfungsi dan degenerasi sinaptik adalah fitur patologis awal dari penuaan dan penyakit terkait usia, termasuk penyakit Alzheimer (AD). Penuaan dikaitkan dengan peningkatan generasi dan deposisi produk akhir glikasi lanjutan (AGEs), yang dihasilkan dari glikasi (atau oksidasi) protein dan lipid glikasi nonenzimatik. Pembentukan AGE dipercepat pada diabetes dan otak yang terkena AD, berkontribusi terhadap gangguan seluler. Sejauh mana keterlibatan AGE, jika sama sekali, dalam perubahan dalam struktur dan fungsi sinaptik saat ini tidak diketahui. Di sini kami menganalisis kontribusi reseptor neuronal AGEs (RAGE) pensinyalan untuk cedera sinaptik yang dimediasi oleh AGE menggunakan tikus knockout RAGE neuronal transgenik yang secara spesifik ditargetkan ke otak depan dan tikus transgenik yang mengekspresikan neuronal dominan-negatif RAGE (DN-RAGE). Penambahan AGE ke irisan otak terganggu potensiasi jangka panjang hippocampal (LTP). Demikian pula, pengobatan neuron hippocampal dengan AGEs secara signifikan mengurangi kepadatan sinaptik. Efek merugikan seperti itu sebagian besar dibalikkan oleh penipisan RAGE genetik. Khususnya, irisan otak dari tikus dengan defisiensi RAGE neuronal atau DN-RAGE tahan terhadap defisit LTP yang diinduksi AGE. Lebih lanjut, kekurangan RAGE atau DN-RAGE memblokir aktivasi pensinyalan p38 yang diinduksi oleh AGE. Secara bersama-sama, data ini menunjukkan bahwa neuronal RAGE berfungsi sebagai transduser sinyal untuk disfungsi sinaptik yang diinduksi AGE, sehingga memberikan wawasan baru ke dalam mekanisme di mana kaskade pensinyalan yang tergantung AGEs-RAGE berkontribusi terhadap cedera sinaptik melalui jalur transduksi sinyal pase MAP kinase . Dengan demikian, blokade RAGE mungkin menjadi target untuk pengembangan intervensi yang bertujuan mencegah perkembangan penurunan kognitif pada penuaan dan penyakit neurodegeneratif terkait usia.

Utama

Produk akhir glikasi lanjutan (AGEs) adalah anggota kelas molekul heterogen, yang memodifikasi fungsi seluler dengan mekanisme yang berbeda, termasuk ligasi dan aktivasi reseptor transduksi sinyal. Produk glikasi non-enzimatik (atau oksidasi) dari protein dan lipid, AGEs berkontribusi pada proses penuaan normal dan ketika dipercepat memiliki peran penyebab dalam komplikasi pembuluh darah diabetes mellitus dan beberapa penyakit neurodegeneratif, termasuk Alzheimer (AD), Parkinson, dan penyakit Huntington. 1, 2, 3, 4, 5 Pada pasien diabetes, konsentrasi AGE yang bersirkulasi (kadar AGE serum) telah dilaporkan pada 7, 2–22 mU / ml (setara dengan 30-88 μ g / ml AGE-BSA), yang merupakan secara signifikan lebih tinggi daripada pasien non-diabetes (3 mU / ml, setara dengan 12 μg / ml AGE-BSA). 6, 7, 8 Tingkat AGE otak juga meningkat menjadi 5-6 μ M (setara dengan 325-390 μ g / ml AGE-BSA) dalam model hewan diabetes. Akumulasi AGE yang berlebih merusak neuron dan diyakini menjadi kunci patogenesis penurunan kognitif pada penuaan normal dan penyakit kronis spesifik penuaan. Misalnya, dalam studi klinis baru-baru ini, tingkat AGE perifer dikaitkan dengan penurunan kognitif pada orang dewasa yang lebih tua dengan dan tanpa diabetes. 10 Komplikasi diabetes memengaruhi otak, meningkatkan risiko depresi, demensia, dan DA. Bahkan, pasien dengan diabetes tipe 2 memiliki dua kali lipat hingga tiga kali lipat peningkatan risiko relatif untuk 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 dan percepatan disfungsi kognitif.

Protein berumur panjang seperti β- amiloid peptida (A β ) dan protein tau hiperfosforilasi yang terakumulasi dalam otak AD sangat rentan terhadap modifikasi AGE. 19, 20, 21, 22 AGE yang dimodifikasi A β atau protein tau menghasilkan peningkatan stres oksidatif dan peradangan kronis, mempercepat patologi AD dan gangguan neuron. 19, 20, 22, 23, 24, 25 Selain itu, glikasi β atau tau menghasilkan peningkatan agregasi dan pembentukan selanjutnya dari plak pikun atau kusut neurofibrillary, fitur patologis utama dari AD, 19, 22 menunjukkan bahwa modifikasi AGE merupakan risiko penting faktor untuk penyakit neurodegeneratif. 26 Meskipun peningkatan akumulasi AGE di otak, seperti yang terlihat pada penuaan, diabetes, atau penyakit neurodegeneratif, mempercepat kerusakan oksidatif pada neuron yang berkontribusi terhadap disfungsi sinaptik dan penurunan kognitif, mekanisme yang mendasarinya tidak dipahami dengan baik.

Reseptor untuk produk akhir glikasi lanjut (RAGE) pertama kali diidentifikasi sebagai reseptor permukaan sel dari superfamili imunoglobulin untuk AGEs. 27, 28 Peningkatan ekspresi RAGE terjadi pada sel-sel neuronal dan non-neuronal dalam sistem saraf perifer dan sentral pada penuaan, diabetes, dan individu yang terkena AD, di mana ligan RAGE diregulasi. 29, 30 Meskipun telah ditunjukkan bahwa interaksi AGEs-RAGE berkontribusi terhadap gangguan seluler yang relevan dengan patogenesis penyakit kardiovaskular dan komplikasi vaskular diabetes, 31, 32, 33 sedikit yang diketahui tentang peran AGE dan interaksinya dengan RAGE pada. disfungsi sinaptik. Untuk memahami mekanisme yang terlibat dalam kerusakan sinaptik yang dimediasi oleh AGE, pertanyaan-pertanyaan berikut perlu dijawab: (1) 'Apakah AGE mengubah struktur dan fungsi sinaptik? Jika demikian, apakah perubahan ini tergantung pada pensinyalan RAGE? '; (2) 'Apakah penyumbatan RAGE oleh penipisan genetik melindungi dari disfungsi dan kehilangan sinaptik yang diinduksi oleh AGE?'; dan (3) 'Apa dampak RAGE neuronal pada fungsi sinaptik menyimpang yang diinduksi AGE?'. Oleh karena itu penting untuk mengevaluasi dampak interaksi AGEs-RAGE pada disfungsi sinaptik dan untuk mengeksplorasi mekanisme yang mendasari transduksi sinyal tergantung AGE-RAGE dan kontribusinya terhadap kerusakan sinaptik.

Di sini kami menyelidiki pensinyalan RAGE neuronal pada cedera sinaptik yang diinduksi AGE menggunakan tikus KO kondusional RAGE bersyarat yang ditargetkan untuk neuron kortikal dan juga tikus transgenik yang mengekspres secara berlebihan mutan yang kekurangan transduksi sinyal kekurangan RAGE pada neuron. Mengingat bahwa sel-sel neuronal dan non-neuronal di otak dapat berkontribusi terhadap stres dan disfungsi neuron dan sinaptik berkelanjutan AGE yang diinduksi oleh AGE, kami menilai dampak dari penghapusan RAGE global dalam pengaturan ini dan lebih jauh menggambarkan mekanisme di mana aktivasi RAGE yang bergantung pada p38 MAP kinase mempotensiasi cedera sinaptik AGE-insulted.

Hasil

Generasi dan karakterisasi tikus neuronal RAGE knockout selektif (nRKO) bersyarat

Kami mengembangkan sistem model di mana ekspresi neuronal RAGE, khususnya di wilayah otak yang bertanggung jawab untuk pembelajaran dan memori, dihapus sehingga konsekuensi interaksi reseptor-ligan dapat dinilai dalam lingkungan yang kaya AGE. Untuk tujuan ini, kami baru-baru ini membuat Cre recombinase RAGE null tikus, disebut Tg nRKO tikus, melintasi tikus Tg yang ditargetkan neuronal dan dibatasi wilayah yang mengekspresikan Cre recombinase di seluruh otak depan di bawah kendali otak-spesifik kalsium-kalmodulin-dependen promotor kinase II (CAMKIIa, CK2) 34 untuk menghasilkan penghapusan RAGE neuronal di seluruh hippocampus dan korteks. Kami menggunakan dua sistem Cre-loxP untuk menghasilkan vektor penargetan dan tikus RAGE / flox (dilakukan oleh Ozgen Inc., Bentley DC, WA, Australia). Gambar 1a menunjukkan vektor penargetan yang mengandung lengan homologi 5,, lengan homologi 3,, dan lengan loxP. Dua situs loxP yang mengapit ekson RAGE 2–4 memungkinkan penghapusan yang dimediasi Cre menggunakan Cre recombinase (Gambar 1b). Eksisi ekson 2–4 oleh Cre recombinase menghasilkan pergeseran bingkai dan kodon stop dini dari urutan RAGE mouse, yang menghalangi ekspresi RAGE. Kami pertama kali membuat tikus alel homozigot RAGE floxed ( RAGE flox / flox ); kemudian tikus RAGE flox / flox disilangkan dengan target neuronal tikus CK2 untuk menghasilkan tikus nRKO ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ), yang kemudian diverifikasi dengan analisis DNA ekor dengan amplikasi PCR menggunakan primer untuk flox (700 bp) dan Cre transgen (300 bp) (Gambar 2a). Immunoblotting dari homogenat kortikal dengan antibodi anti-RAGE menunjukkan pengurangan yang signifikan dari tingkat ekspresi RAGE di korteks serebral tikus nRKO dibandingkan dengan tikus yang tidak Tg (pengurangan 80% dibandingkan otak yang tidak Tg, P <0, 01) (Gambar 2b). Penindasan ekspresi RAGE yang tidak lengkap disebabkan oleh homogenat otak, yang mengandung sel-sel non-neuronal. Tingkat ekspresi RAGE tidak diubah pada homogenat otak kecil (Gambar 2c). Mikroskopi confocal dengan imunostaining ganda RAGE dan MAP2 jelas menunjukkan bahwa hampir tidak ada sinyal RAGE di neuron positif MAP2 di korteks (Gambar 2d-e) dan hippocampus (Gambar 2f) tikus nRKO, dengan demikian memverifikasi penipisan RAGE pada neuron kortikal di otak tikus nRKO.

Image

Membentuk kaset target. Representasi skematis dari strategi yang digunakan untuk KO kondisional dari gen RAGE dengan mengeluarkan ekson 2–4 dari gen RAGE tikus. ( a ) Tampilan Beranotasi (MacVector 9.5.3) dari lokus yang mengidentifikasi wilayah yang ditargetkan untuk rekombinasi homolog. Vektor penargetan dibangun dari tiga fragmen, lengan homologi 5,, dua situs loxP, dan lengan homologi 3.. Kaset pilihan PGK-neo dimasukkan di bagian hilir exon 1. Kaset PGK-neo diapit oleh situs FRT dan ekson 2–4 diapit oleh dua situs loxP. ( B ) tikus RAGE flox / flox disilangkan dengan target neuronal tikus CK2 untuk menghasilkan tikus nRKO ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ). Dua situs loxP mengapit ekson RAGE 2 hingga 4 untuk memungkinkan penghapusan yang dimediasi Cre menggunakan Cre-recombinase. Eksisi ekson 2–4 oleh Cre recombinase mengarah ke perubahan bingkai dan kodon berhenti dini dari urutan RAGE mouse untuk memblokir ekspresi RAGE

Gambar ukuran penuh

Image

Karakterisasi tikus nRKO transgenik dengan penghapusan RAGE pada neuron kortikal. ( a ) Tikus nRKO transgenik diidentifikasi dari DNA ekor berdasarkan amputasi PCR menggunakan primer untuk flox (700 bp) di panel atas, dan CK2-Cre (300 bp) di panel bawah. Jalur 1 menunjukkan RAGE flox / flox (non-Tg) tikus dengan Cre transgene negatif dan jalur 2-3 menunjukkan tikus nRKO yang dibawa dengan flox dan Cre ( RAGE flox / flox / CK2-Cre ). ( b dan c ) Immunoblotting dari homogenat kortikal ( b ) dan otak kecil ( c ) dari tikus Tg yang diindikasikan untuk RAGE. Tubulin digunakan sebagai kontrol pemuatan protein. ( d - f ) Gambar representatif dari imunostaining ganda untuk RAGE dan MAP2 di korteks ( d dan e ) dan hippocampus ( f ). Gambar mikroskopi konfokal menunjukkan penghapusan RAGE pada neuron kortikal yang diberi label MAP2 positif sebagai penanda neuronal. Gambar besar yang diperbesar dari neuron yang berasal dari sel yang sesuai ditunjukkan dalam bingkai panel ( e ). Skala bar = 50 μ m

Gambar ukuran penuh

Karakterisasi imunokimia Nɛ-carboxymethyl-lysine (CML) dalam persiapan AGE

Dari semua bentuk AGEs, CML adalah produk glikasi utama yang dikenal stabil dan terakumulasi secara progresif dalam penuaan, AD, dan komplikasi terkait diabetes. 21, 35 Untuk memverifikasi apakah CML adalah komponen utama dalam persiapan AGE kami, kami menyiapkan AGE dengan menginkubasi bovine serum albumin (BSA) dengan glukosa 6-fosfat selama 6-8 minggu pada suhu 37 ° C dan kemudian melakukan karakterisasi imunokimia menggunakan monoklonal antibodi penargetan CML adducts. Menggunakan pewarna biru Coomassie untuk pewarnaan cepat dari pita protein dalam gel, kami mengamati co-migrasi BSA dan BSA yang dimodifikasi AGE pada ∼ 66 dan ∼ 70 kD, masing-masing (Gambar 3a). Peningkatan berat molekul BSA terglikasi disebabkan oleh modifikasi AGE, yang menghasilkan pengikatan silang intramolekul. Immunoblotting dari persiapan yang sama dari BSA dan AGE-BSA menggunakan antibodi spesifik terhadap CML menunjukkan imunoreaktivitas CML yang menonjol hanya di hadapan AGEs, menunjukkan bahwa BSA terglikasi. Sebaliknya, imunoreaktivitas seperti itu tidak ada pada BSA tanpa glukosa 6-fosfat (Gambar 3a). Hasil ini menunjukkan bahwa CML adalah komponen utama dari persiapan AGE kami, yang digunakan dalam semua percobaan kami.

Image

Potensiasi jangka panjang (AGB) terganggu AGE. ( a ) Penentuan tingkat CML dalam persiapan AGE. Protein (2 μg) dari BSA diinkubasi dengan glukosa 6-fosfat selama 8 minggu pada suhu 37 ° C dan kemudian mengalami SDS-PAGE. Pita protein diwarnai oleh Coomassie Blue (kiri). Glycation dideteksi dengan immunoblotting dengan antibodi terhadap CML (kanan). Jalur 1, BSA; jalur 2, BSA yang dimodifikasi AGE. ( B ) BSA saja tidak mempengaruhi LTP. Sisipan menunjukkan jejak representatif dari fEPSP dalam irisan yang diperlakukan dengan kendaraan atau 100 μ g / ml BSA sebelum stimulasi burst-burst (garis hitam) dan pada akhir rekaman 1 jam (garis abu-abu). ( c ) Potensiasi residu dari lereng fEPSP yang terjadi selama 5 menit terakhir dari rekaman LTP. ( d ) BSA tidak mempengaruhi transmisi sinaptik basal (BST). ( e ) Pengaruh AGE pada LTP. Irisan hippocampus disempurnakan dengan AGE (50, 100, dan 200 μ g / ml) atau BSA (100 μ g / ml) selama 1 jam dan kemudian dicatat LTP. N = 8–11 irisan dari 3 hingga 5 tikus. ( f ) Potensiasi sisa dari lereng fEPSP yang terjadi selama 5 menit terakhir dari rekaman LTP. ( g ) BST dari sinapsis hippocampal dicatat dari kelompok tikus yang diindikasikan

Gambar ukuran penuh

AGEs merusak potensiasi jangka panjang hippocampal (LTP)

Untuk menentukan efek langsung AGEs pada fungsi sinaptik, kami memeriksa transmisi sinaptik dalam kondisi basal dan selama LTP, suatu bentuk plastisitas sinaptik yang secara luas dipelajari sebagai model seluler untuk fungsi sinaptik, dalam irisan hippocampal dari tikus non-Tg yang diobati dengan AGE atau BSA sebagai kontrol. Dalam irisan yang dirawat kendaraan, BSA sendiri tidak mengubah LTP (228, 8 ± 17, 04% versus 223, 0 ± 7, 95% dalam irisan yang diobati BSA, P > 0, 05, Gambar 3b dan c) atau transmisi sinaptik basal (BST) yang diukur dengan input-output pengukuran (Gambar 3d). Pengobatan AGE secara signifikan mengurangi LTP dalam cara yang tergantung pada konsentrasi (180, 9 ± 15, 36%, 139, 1 ± 10, 42%, dan 124, 9 ± 7, 96% masing-masing untuk 50, 100, dan 200 μ g / ml AGE, masing-masing, dibandingkan 220, 9 ± 20, 75% untuk 100 μ g / ml BSA, P <0, 01, Gambar 3e dan f). Tidak ada perbedaan signifikan dari potensi lapangan-rangsang pasca-sinaptik (fEPSPs) pada CA1 stratum radiatum antara irisan yang diobati dengan AGE dan BSA, menunjukkan bahwa AGEs tidak mempengaruhi BST normal pada sinapsis hippocampal (Gambar 3g). Hasil ini menunjukkan bahwa AGEs merusak plastisitas sinaptik jangka panjang.

Defisiensi RAGE menyelamatkan defisit LTP yang diinduksi AGE

Untuk secara langsung menentukan dampak RAGE pada pengurangan LTP yang dimediasi oleh AGE, pertama-tama kami mencatat LTP dalam irisan hippocampal dari penipisan RAGE global (RKO) dan tikus non-Tg yang diobati dengan AGE. Kami menemukan potensiasi yang sama pada irisan kekurangan RAGE dibandingkan dengan irisan non-Tg di hadapan BSA (224, 3 ± 17, 81% dibandingkan 208, 8 ± 19, 50%, P > 0, 05, Gambar 4a dan e). Namun, defisiensi RAGE sebagian besar melindungi irisan hippocampal terhadap LTP berkurang dengan paparan AGEs (184, 5 ± 9, 73% dibandingkan 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, Gambar 4a dan e), menunjukkan bahwa defisiensi RAGE meningkatkan transmisi sinaptik. Karena RAGE diekspresikan dalam sel-sel neuronal dan non-neuronal di otak, kami selanjutnya memeriksa kontribusi RAGE neuronal terhadap fungsi sinaptik yang dimediasi oleh AGE. Kami merawat neuron dari irisan hippocampal dari nRKO mice (dengan deplesi RAGE) korteks dengan AGEs dan BSA selama setidaknya 60 menit, dan kemudian kami mencatat LTP. Irisan dari nRKO atau non-Tg tikus menunjukkan LTP serupa di hadapan BSA (240, 2 ± 9, 41% dibandingkan 208, 8 ± 19, 50%, P > 0, 05, Gambar 4b dan e). Sebaliknya, irisan nRKO secara signifikan menekan penurunan LTP yang diinduksi oleh AGEs dibandingkan dengan irisan non-Tg (191, 6 ± 15, 55% berbanding 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, Gambar 4b dan e). Hasil ini menunjukkan bahwa blokade neuronal RAGE yang berhasil melindungi dari fungsi sinaptik AGE-gangguan.

Image

Pengaruh deplesi RAGE pada penurunan LTP yang diinduksi AGE. ( a - c ) LTP direkam dalam irisan hippocampal dari non-Tg, RKO ( a ), nRKO ( b ), dan DN-RAGE ( c ) tikus setelah 1 jam perfusi dengan BSA atau AGEs (100 μ g / ml). Penghapusan RAGE sendiri tidak mengubah LTP di hadapan BSA. Sebaliknya, LTP meningkat pada irisan dari tikus RKO, nRKO, dan DN-RAGE dibandingkan dengan irisan non-Tg di hadapan AGE. ( D ) Jejak representatif dari fEPSP dalam irisan diperlakukan dengan kendaraan atau 100 μ g / ml BSA sebelum stimulasi burst-burst (garis hitam) dan setelah 1 jam (garis abu-abu). ( e ) Potensiasi residu dari lereng fEPSP yang terjadi selama 5 menit terakhir dari rekaman LTP. ( f ) Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam BST antara kelompok yang ditunjukkan. N = 8–11 irisan dari 3 hingga 5 tikus

Gambar ukuran penuh

RAGE berfungsi sebagai reseptor transduksi sinyal untuk AGEs dan A β , mengaktifkan beberapa jalur intraseluler hilir. 27, 28 Dengan demikian, kami mengevaluasi efek pensinyalan RAGE di neuron pada LTP yang diinduksi AGE menggunakan irisan hippocampal dari tikus DN-RAGE yang mengekspresikan mutan-mutan kekurangan transduksi-kekurangan RAGE (yang ditargetkan ke neuron untuk menentukan pensinyalan yang bergantung pada RAGE). Khususnya, irisan DN-RAGE secara signifikan resisten terhadap pengurangan LTP yang dimediasi oleh AGE dibandingkan dengan irisan non-Tg (167, 0 ± 12, 66% berbanding 131, 1 ± 7, 53%, P <0, 01, Gambar 4c dan e). Gambar 4d menunjukkan jejak representatif yang diambil 1 menit sebelumnya (garis hitam) dan 60 menit setelah induksi LTP (garis abu-abu). BST tidak terpengaruh pada KO RAGE atau tikus mutan (Gambar 4f). Hasil ini menunjukkan bahwa pensinyalan yang tergantung-RAGE pada neuron berkontribusi terhadap kerusakan sinaptik yang diinduksi AGE.

Aktivasi protein kinase teraktifkan mitogen 38 (MAPK p38) terlibat dalam defisit sinaptik yang diinduksi AGE

Untuk menentukan pemain molekuler mana yang mendasari efek AGE pada LTP hippocampal, kami mengevaluasi peran p38 dan c-Jun N-terminal kinase (JNK) dalam irisan hippocampal pada paparan AGEs, karena kinase ini diaktifkan (peningkatan level fosforilasi) di beberapa patologis. kondisi dan plastisitas sinaptik; 36, 37 lebih lanjut, p38 adalah mediator utama transduksi sinyal yang dimediasi RAGE. 37 Menggunakan antibodi terhadap bentuk p38 dan JNK terfosforilasi dengan ekstrak hippocampal setelah terpapar AGEs dan stimulasi frekuensi tinggi, kami memperkirakan aktivasi dua kinase ini. Penambahan AGEs pada irisan hippocampal non-Tg secara signifikan meningkatkan fosforilasi p38 dibandingkan dengan penambahan BSA, tetapi pengobatan dengan AGEs tidak mempengaruhi level p38 total (Gambar 5a). Analisis densitometri dari pita-pita imunoreaktif gabungan menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam fosforilasi p38 sebesar 1, 5-1, 7 kali lipat ketika dinormalisasi menjadi p38 total dibandingkan dengan kontrol yang diperlakukan dengan BSA (Gambar 5b). Pengobatan AGEs tidak mempengaruhi fosforilasi JNK (Gambar 5c).

Image

Efek AGEs pada aktivasi p38. Irisan otak diperfusi dengan BSA atau AGEs (100 μg / ml) selama 1 jam dan kemudian mengalami imunoblotting untuk fosforilasi dan p38 total ( a dan b ) atau JNK ( c ). ( a ) Immunoblotting homogenat otak dari irisan AGE atau BSA untuk fosforilasi dan p38 total. Tubulin digunakan sebagai kontrol pemuatan protein neuron. ( B ) Densitometri dari gabungan pita imunoreaktif fosfo-p38 relatif terhadap total p38. ( c ) Densitometri dari pita imunoreaktif fosfo-JNK relatif terhadap total JNK dalam irisan yang diobati dengan BSA atau AGE. Data dinyatakan sebagai peningkatan lipatan relatif terhadap kelompok kontrol yang diobati dengan BSA. Panel bawah menunjukkan imunoblot yang representatif untuk protein yang ditunjukkan. N = 3–5 per kelompok perawatan. ( d ) Efek p38 inhibitor (SB203580) pada fosforilasi p38 yang diinduksi oleh AGE. Densitometri pita fosfo-p38 imunoreaktif relatif terhadap total p38 dalam irisan non-Tg yang diperfusikan dengan AGE dengan atau tanpa SB203580. Immoboblot representatif untuk protein yang ditunjukkan ditunjukkan pada panel bawah. ( e ) Efek p38 inhibitor (SB203580) pada defisit LTP yang diinduksi AGE dalam irisan hippocampal. Irisan diperfusi dengan kendaraan, AGEs (100 μ g / ml), SB203580 (1 μ M), atau AGE plus SB203580 selama 1 jam sebelum perekaman LTP. n = 8–11 irisan per kelompok perawatan. Panel atas menunjukkan jejak representatif dari fEPSP dalam irisan dengan perawatan yang ditunjukkan sebelum stimulasi burst-burst (garis hitam) dan pada akhir 1 jam (garis abu-abu). ( f ) Potensiasi residu dari lereng fEPSP yang terjadi selama 5 menit terakhir dari rekaman LTP

Gambar ukuran penuh

Untuk lebih mengevaluasi efek aktivasi p38 pada penurunan LTP yang dimediasi oleh AGE, kami menyempurnakan slide hippocampal dengan SB203580, penghambat p38 spesifik, bersama dengan AGEs. Jelas, aplikasi SB203580 secara signifikan memblokir induksi p38 fosforilasi di hadapan AGE dibandingkan dengan pengobatan AGE sendiri tanpa p38 inhibitor (SB203580) (Gambar 5d). Akibatnya, AGP-gangguan hippocampal LTP dipulihkan oleh penghambatan p38 dengan perfusi SB203580 (Gambar 5e dan f). Hasil ini menunjukkan bahwa aktivasi p38 yang dimediasi oleh AGE berkontribusi terhadap cedera sinaptik.

Defisiensi RAGE menghambat aktivasi p38 yang diinduksi AGE

Untuk menentukan apakah RAGE adalah pemain kunci dalam aktivasi p38 yang dimediasi AGE, kami menilai efek penghapusan RAGE pada fosforilasi p38 yang diinduksi oleh AGEs. Irisan dari tikus RKO menunjukkan aktivasi p38 yang benar-benar ditekan sebagaimana ditunjukkan oleh penurunan fosforilasi p38 dibandingkan dengan irisan non-Tg dengan AGEs (Gambar 6a dan b). Lebih lanjut, deplesi RAGE yang secara spesifik ditargetkan pada neuron kortikal / hipokampus atau ekspresi target neuron dari mutan yang kekurangan transduksi sinyal RAGE menghapuskan fosforilasi p38 yang diinduksi oleh AGE. Kuantifikasi semua pita imunoreaktif untuk phospho-p38 dinormalisasi ke total p38 diverifikasi secara signifikan mengurangi pita imunoreaktif fosfo-p38 dalam irisan dari RKO, nRKO, dan DN-RAGE dibandingkan dengan irisan non-Tg dengan pengobatan AGE (Gambar 6a dan b). Data ini menunjukkan bahwa kekurangan RAGE mencegah aktivasi p38 yang diinduksi AGE. p38 aktivasi transduksi sinyal adalah konsekuensi dari interaksi AGEs-RAGE pada neuron, berkontribusi terhadap gangguan neuronal dan sinaptik dalam lingkungan yang diperkaya AGE.

Image

Efek defisiensi RAGE pada aktivasi p38 yang diinduksi AGE. Irisan hippocampal dari tikus Tg dan non-Tg yang diindikasikan perfusi dengan AGEs selama 1 jam dan kemudian dikenakan imunoblotting untuk fosfo dan total-p38. ( a ) Immunoblot untuk fosfon dan p38 total dengan tubulin digunakan sebagai kontrol pemuatan protein. ( B ) Densitometri pita phosphore-p38 immunoreactive dinormalisasi oleh total p38 menggunakan perangkat lunak NIH Image J. N = 3-5 tikus per kelompok

Gambar ukuran penuh

Pengaruh interaksi AGEs-RAGE pada kepadatan sinaptik

Untuk menentukan tingkat kerusakan sinaptik yang diinduksi AGE pada neuron yang dihasut AGE, pertama-tama kami menganalisis efek AGE terhadap kepadatan sinaptik. Sinapsis diidentifikasi sebagai cluster positif-synaptophysin yang menempel pada dendrit berlabel penanda MAP2. Rekrutmen protein presinaptik, synaptophysin, untuk membentuk cluster synaptophysin-positif adalah cepat dan tergantung pada aktivitas sinaptik. 38 Dua jam setelah pengobatan AGEs, kepadatan synaptophysin dalam neuron hippocampal tidak diubah dibandingkan dengan sel kontrol yang diobati dengan BSA, sedangkan neuron hippocampal yang terpapar AGEs selama 48 jam menunjukkan cluster positif synaptophysin berkurang 50-60% (Gambar 7a). Yang penting, neuron yang kekurangan RAGE sebagian besar membalikkan penurunan kepadatan sinaptik yang diinduksi AGE (Gambar 7b). Data ini menunjukkan bahwa penipisan RAGE menyelamatkan kerugian sinaptik yang diinduksi AGE.

Image

Pengaruh kekurangan RAGE pada kerugian sinaptik yang diinduksi AGE. ( a ) Neuron Non-Tg diobati dengan AGE atau BSA 100 μg / ml selama 2 dan 48 jam dan kemudian menjalani imunostaining dengan synaptophysin dan MAP2. Kuantifikasi cluster synaptophysin positif per mikron dendrit secara signifikan menurun pada sel yang diperlakukan dengan AGE dibandingkan dengan sel yang diperlakukan dengan BSA. ( B ) neuron kekurangan RAGE sebagian besar dilindungi AGE-hilangnya gugus synaptophysin-positif dibandingkan dengan neuron non-Tg di hadapan AGEs. Panel bawah menunjukkan gambar representatif pewarnaan sinaptik. Sinapsis divisualisasikan dengan pewarnaan synaptophysin (hijau) dan dendrit oleh pewarnaan MAP2 (merah). Skala bar = 50 μ m

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Selain kemampuannya untuk secara langsung mengubah struktur dan fungsi protein yang ditargetkan dalam sel yang menyebabkan kerusakan sel atau jaringan, bukti yang muncul juga menunjukkan AGEs sebagai ligan pensinyalan, berinteraksi dengan RAGE; AGEs mendapatkan perubahan transduksi sinyal yang mempengaruhi banyak organ periferal. 39, 40, 41 Meskipun akumulasi AGE meningkat pada neuron kortikal, neuron piramidal hippocampal, astrosit, dan sel glial lain dalam penuaan dan otak AD, 4, 42, 43 efek langsung interaksi AGE-RAGE pada fungsi otak, khususnya pada perubahan struktur dan fungsi sinaptik, sebagian besar masih belum diketahui. Menggunakan model tikus transgenik baru kami dengan ekspresi neuronal dari pensinyalan RAGE dan kekurangan RAGE neuronal di otak depan untuk evaluasi transmisi sinaptik dan plastisitas (hampir setiap fungsi otak menyampaikan transmisi sinaptik), kami memberikan bukti yang meyakinkan untuk mendukung peran penting AGE neuronal– Interaksi RAGE pada aktivasi MAPK P38, defisit plastisitas hippocampal, dan cedera sinaptik.

Kami pertama kali menunjukkan efek merugikan AGEs pada struktur dan fungsi sinaptik. Penambahan AGEs secara signifikan merusak plastisitas sinaptik dengan mengurangi LTP dan morfologi sinaptik. LTP penting untuk plastisitas sinaptik jangka panjang, dan mengubah morfologi sinaptik (kehilangan sinaptik), yang kemungkinan berkontribusi pada defisit pembelajaran dan memori yang terlihat pada penurunan kognitif yang berkaitan dengan usia. Penuaan ditandai dengan penurunan anatomis dan fungsional di berbagai sistem organ. AGEs ditemukan dalam serum dan menumpuk di jaringan selama penuaan; 5, 44, 45 akumulasi ini dipercepat dalam kondisi patologis seperti diabetes dan penyakit neurodegeneratif, termasuk AD. Peningkatan kadar AGE dilaporkan dalam neuron kortikal orang dewasa yang lebih tua dan berkorelasi positif dengan tingkat keparahan gangguan kognisi. 46 Kadar AGE serum meningkat secara signifikan pada pasien diabetes (setara dengan 30-88 μ g / ml AGE-BSA dibandingkan 12 μ g / ml AGE-BSA pada pasien non-diabetes). 6, 7, 8 Penelitian kami sebelumnya menunjukkan bahwa AGE albumin (1 μ M, setara dengan 66, 5 μ g / ml) menghasilkan stres oksidan dan aktivasi faktor transkripsi NF-kB secara in vitro dan in vivo , suatu proses yang melibatkan AGE-binding RAGE protein. Khususnya, gangguan seluler yang diinduksi AGE dan stres oksidan diblokir oleh antibodi terhadap RAGE. 47 Dengan demikian, peningkatan kadar AGE dan reseptornya, RAGE, memainkan peran penting dalam gangguan seluler yang diperantarai AGE selama patogenesis proses terkait usia dan diabetes. Konsentrasi AGEs yang digunakan dalam penelitian ini berkorelasi dengan kondisi patologis yang ditemukan pada penyakit manusia.

Dalam penelitian kami, perfusi dengan AGEs dalam irisan hippocampal merusak LTP dalam cara yang tergantung pada konsentrasi, konsisten dengan temuan yang diamati dalam model tikus bahwa pengobatan AGE eksogen dengan injeksi stereotaxic ke otak menyebabkan sinaps dan gangguan memori. 48 Namun, dampak RAGE neuronal pada kerusakan sinaptik yang diinduksi AGE tidak jelas. Mengingat bahwa pembentukan dan akumulasi AGE dipercepat di otak subjek diabetes dan AD, interaksi AGE-RAGE bisa menjadi target penting dalam mencari agen yang menghentikan percepatan penyakit atau eksaserbasi yang terkait dengan penurunan kognitif dan demensia terkait diabetes dan AD terkait dan AD.

Selanjutnya, dengan menggunakan model penipisan tikus RAGE genetik kami, kami menyelidiki efek pensinyalan bergantung-RAGE pada cedera sinaptik yang dihina oleh AGE. Pengurangan LTP yang diinduksi perfusi AGE dapat disebabkan oleh berbagai faktor; misalnya, satu penyebab melibatkan AGE yang berikatan dengan reseptor RAGE, dan yang lainnya adalah melalui malfungsi seluler yang disebabkan oleh pengikatan protein. Penghapusan genetik RAGE menawarkan kepada kita kemampuan untuk mengidentifikasi interaksi AGEs-RAGE dalam gangguan sinaptik yang diinduksi AGE. Kami mencatat pembacaan LTP normal dalam irisan otak tikus RAGE null global kami yang diobati dengan kendaraan dibandingkan dengan littermates non-transgenik, menunjukkan bahwa penghapusan RAGE genetik tidak secara signifikan mengubah struktur sinaptik yang penting untuk induksi dan ekspresi LTP dalam kondisi fisiologis normal. Khususnya, defisiensi RAGE melindungi terhadap defisit LTP yang diinduksi AGE. Demikian pula, data kami menunjukkan efek perlindungan dari deplesi RAGE pada kerugian sinaptik yang diinduksi AGE. Meskipun hasil kami tidak mengecualikan efek AGEs lainnya seperti ikatan silang protein, kami dengan jelas menunjukkan bahwa interaksi AGEs-RAGE terlibat dalam cedera sinaptik yang diinduksi oleh AGE.

Karena RAGE diekspresikan dalam neuron dan sel non-neuronal (yaitu glial, sel endotel, dan pericytes penghalang darah-otak), 49, 50 hasil yang diperoleh dari tikus KO global RAGE tidak menggambarkan jenis sel mana yang (Apakah) penting dalam penurunan plastisitas sinaptik yang diinduksi AGE. Oleh karena itu, kami menciptakan tikus transgenik dengan nRKO dan mutan kekurangan transduksi-sinyal RAGE (DN-RAGE) khusus di otak depan, termasuk hippocampus, untuk menjawab pertanyaan apakah aktivitas RAGE neuronal bertanggung jawab untuk LTE hippocampal yang diinduksi oleh AGE yang bertanggung jawab atas LTE hippocampal yang diinduksi oleh AGE. pengurangan. Memang, temuan kami jelas menunjukkan bahwa irisan otak nRKO dan DN-RAGE sebagian besar resisten terhadap gangguan LTP melalui paparan AGE, melibatkan keterlibatan RAGE neuronal dalam mekanisme yang mendasari disfungsi sinaptik yang diinduksi AGE. Lebih lanjut, pengenalan neuronal DN-RAGE atau defisiensi RAGE pada neuron kortikal (nRKO) gagal mencegah sepenuhnya AGP-gangguan LTP dibandingkan dengan perfusi dengan BSA. Hasil ini menunjukkan bahwa RAGE non-neuronal (yaitu, ekspresi RAGE dalam mikroglia, astrosit, atau sel endotel) dapat terlibat dalam disfungsi sinaptik yang diinduksi AGE. Studi selanjutnya akan diperlukan untuk menyelidiki peran RAGE non-neuronal dalam kegagalan sinaptik yang disebabkan oleh AGEs. Apapun, penelitian kami menggambarkan mekanisme yang melibatkan transduksi sinyal yang diperantarai RAGE neuronal dalam disfungsi dan degenerasi sinaptik yang diinduksi AGE. Neuron rentan terhadap penghinaan AGE melalui interaksi AGEs-RAGE langsung yang berkontribusi terhadap disfungsi dan degenerasi sinaptik.

Akhirnya, hasil kami menunjukkan bahwa jalur pensinyalan MAPK P38 sangat penting untuk kerusakan sinaptik yang diinduksi AGEs-RAGE. Penurunan LTP yang diinduksi oleh AGE dilemahkan dalam irisan DN-RAGE dengan mutan yang kekurangan transduksi sinyal dari RAGE, yang menunjukkan kontribusi pensinyalan yang bergantung pada RAGE terhadap gangguan sinaptik yang diinduksi oleh AGE. Kaskade pensinyalan yang diaktifkan setelah interaksi ligan-RAGE meliputi jalur p21ras, kinase yang diatur sinyal ekstraseluler 1/2 (ERK1 / 2), p38, dan JNK, Rho GTPases, phosphoinositol-3 kinase, GSK-3 β , dan JAK / STAT (transduser sinyal dan aktivator transkripsi). 51, 52 Aktivasi kaskade protein kinase yang berbeda dapat mewakili target utama aktivasi RAGE untuk mengendalikan plastisitas sinaptik. 37, 53

Secara khusus, kami mempertimbangkan potensi keterlibatan dua kinase yang berbeda, JNK dan p38 dalam penghambatan LTP berdasarkan penelitian kami sebelumnya yang menunjukkan bahwa aktivasi p38 dan JNK diperlukan untuk penghambatan LTP yang diinduksi oleh interaksi β- RAGE. 37, 54 irisan Hippocampal yang diperfusi dengan AGEs menunjukkan peningkatan aktivitas p38 tetapi tidak ada perubahan pada JNK, menunjukkan keterlibatan aktivasi p38 dalam pensinyalan p38 dan defisit plastisitas sinaptik yang diinduksi oleh AGE. Memang, penambahan p38 inhibitor mencegah aktivasi p38 yang diinduksi AGE dan penurunan LTP. Catatan, deplesi RAGE menghalangi induksi fosforilasi p38 dan kerusakan yang dipulihkan dalam plastisitas dan kepadatan sinaptik dari paparan AGE. Hasil kami menunjukkan bahwa AGE-RAGE interaksi neuron mengaktifkan p38 MAK kinase, yang pada gilirannya menyebabkan disfungsi sinaptik.

We further observed that if AGEs level remained chronically high, synapses become structurally damaged. Using hippocampal neuronal cultures, we showed that short-term AGEs exposure (for 2 h treatment) barely affected synaptic structure, whereas long-term treatment of AGEs (for 48 h) caused significant changes in synaptic density. Importantly, RAGE deletion rescues AGE-induced synapse loss. These data indicate that neuronal AGEs–RAGE interaction has functional (long-term plasticity) as well as structural effects on synapses, which may be important in the learning and memory deficit present in age-related dementia and age-associated neurodegenerative disease.

In summary, we provide substantial evidence of the protective effect of RAGE depletion on AGE-induced alterations in synaptic plasticity and density. Genetic depletion of RAGE and RAGE signaling in cortical neurons blocks AGE-mediated activation of p38 MAP kinase signal transduction with LTP deficits. We propose that AGEs-RAGE-dependent activation of p38 MAP kinase is responsible for AGE-induced synaptic damage. Blockade of AGEs-RAGE axis may protect against the impaired cognitive function in aged subjects with and without neurodegenerative diseases, including those with diabetes and AD.

Glosarium

aCSF

artificial cerebrospinal fluid

IKLAN

Penyakit Alzheimer

AGEs

advanced glycation endproducts

CK2

calcium-calmodulin-dependent kinase II

CML

Nɛ-carboxymethyl-lysine

DN-RAGE

dominant-negative RAGE

fEPSP

field-excitatory post-synaptic potential

JNK

c-Jun N-terminal kinase

LTP

long-term potentiation

nRKO

neuronal RAGE selective knockout

p38 MAPK

p38 mitogen-activated protein kinase

RAGE

receptor for advanced glycation endproduct

RKO

global RAGE knockout