Dampak cairan ionik berbasis-permukaan guanidinium-, tetramethylguanidinium-, dan kolinium pada sel vibrio fischeri dan liposom dipalmitoylphosphatidylcholine liposom | laporan ilmiah

Dampak cairan ionik berbasis-permukaan guanidinium-, tetramethylguanidinium-, dan kolinium pada sel vibrio fischeri dan liposom dipalmitoylphosphatidylcholine liposom | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Cairan ionik
  • Struktur dan perakitan membran
  • Fosfolipid

Abstrak

Kami menyelidiki efek toksikologis dari tujuh cairan ionik (ILs) kolinium, guanidinium, dan tetramethylguanidinium karboksilat yang asli dari sudut pandang ekotoksikologis. Penekanannya adalah pada ketergantungan struktur-toksisitas potensial ILS permukaan-aktif ini di lingkungan berair. Konsentrasi efektif median (EC 50 ) didefinisikan untuk setiap IL menggunakan bakteri laut Vibrio (Aliivibrio) fischeri . Liposom dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) digunakan sebagai membran lipid biomimetik untuk mempelajari interaksi antara ILS permukaan-aktif dan liposom. Interaksi diselidiki dengan mengikuti perubahan perilaku transisi fase DPPC menggunakan diferensial pemindaian kalorimetri (DSC). Konsentrasi misel kritis untuk ILS ditentukan untuk mengklarifikasi analisis toksisitas dan hasil interaksi. Peningkatan panjang rantai alkil anion meningkatkan toksisitas, sedangkan percabangan rantai menurunkan toksisitas ILS. Toksisitas ILS dalam penelitian ini terutama ditentukan oleh anion permukaan aktif, sementara kation menginduksi dampak kecil pada toksisitas. Dalam percobaan DSC, tren yang sama diamati untuk semua anion yang diteliti, sedangkan kation-kation tersebut tampaknya memberikan dampak yang lebih bervariasi pada perilaku transisi fase. Pengukuran toksisitas yang dikombinasikan dengan studi interaksi liposom dapat memberikan alat yang berharga untuk menilai mekanisme toksisitas.

pengantar

Cairan ionik (IL) adalah garam organik yang biasanya dalam keadaan cair pada suhu di bawah 100 ° C. ILs telah dianggap sebagai alternatif "hijau" untuk pelarut molekuler, karena ada risiko pelepasan lingkungan yang lebih rendah melalui atmosfer karena tekanan uapnya yang rendah. Namun, karena kelarutannya dalam air, ILS mungkin merupakan bahaya lingkungan yang potensial dan karenanya berbahaya bagi organisme hidup dari mikroba bagi manusia. Risiko tetap sepanjang seluruh siklus hidup ILS, dari sintesis ke aplikasi dan dari aplikasi ke pembuangan. Potensi bahaya telah ditinjau misalnya oleh Cvjetko Bubalo et al . 1, Pham et al . 2 dan Amde et al . 3 .

Aplikasi ILS beragam seperti strukturnya dan potensi pasangan anion-kation baru praktis tak terbatas. IL-aktif permukaan, yaitu IL yang mengurangi tegangan permukaan dan tegangan antarmuka, biasanya mengandung satu atau lebih rantai alkil panjang yang melekat pada kation dan / atau kelompok kepala anion. Mereka telah digunakan dalam berbagai aplikasi, seperti, dalam ekstraksi senyawa organik, ion logam dan isotop radioaktif, sebagai template dalam produksi bahan berpori, dalam mikroemulsi dan sebagai penghancur dalam kimia minyak bumi (ditinjau oleh Martínez-Palou dan Aburto) 4 . Dalam penelitian terbaru ini ILS berbasis permukaan-aktif cholinium- (Ch), guanidinium- (GND), dan tetramethylguanidinium- (TMG), dalam kombinasi dengan anion isostearate, decanoate dan neodecanoate, diselidiki (Gambar 1 dan Tabel 1). ILS dikembangkan sebagai struktur toksisitas yang lebih maju atau rendah untuk meningkatkan proses ekstraksi, untuk digunakan dalam kimia biomassa atau minyak bumi, dan pasangan kation dan anion dipilih dari sudut pandang aplikasi ini.

Image

Fomulasi teknis Neodecanoate dan isostearate adalah campuran dari isomer. Struktur yang ditunjukkan adalah contoh.

Gambar ukuran penuh

Tabel ukuran penuh

Ketika mengembangkan ILS baru untuk aplikasi industri, efek toksikologisnya penting karena tanggung jawab lingkungan yang ditentukan oleh undang-undang, seperti, peraturan Uni Eropa tentang pendaftaran, evaluasi, otorisasi, dan pembatasan bahan kimia (REACH). Juga, investigasi sifat struktural IL dan mekanisme toksisitas dapat memberikan informasi berguna untuk pengembangan ILS yang efisien dalam penerapannya, tetapi kurang berbahaya bagi lingkungan.

Karena variasi struktural ILs secara umum, tidak ada keseragaman mekanistik mengenai toksisitas ILS (ditinjau oleh Egorova et al .) 5 . Berdasarkan data kolektif, toksisitas IL tergantung pada sifat struktural tertentu dari kation dan anion monomer, seperti jenis ion, keberadaan dan sifat kelompok fungsional dan panjang rantai alkil yang terpasang (terutama untuk kation). Namun, perilaku agregasi ILS perlu diperhitungkan juga. Mempertimbangkan spesies kation dan anion dan interaksi di antara mereka, aktivitas biologis dan toksisitas zat juga dapat dipengaruhi oleh organisasi skala mikro dan agregasi monomer IL.

Toksisitas kation umumnya diketahui meningkat sebagai fungsi dari panjang rantai alkil, seperti ditinjau oleh Amde et al . 3 Hanya ada beberapa penelitian yang menyelidiki efek rantai alkil pada anion IL dan khususnya dampak IL karboksilat. Berdasarkan studi ini, perpanjangan rantai alkil karboksilat meningkatkan efek toksik dengan cara yang sama seperti pada kation 6, 7, 8, 9 . Namun, hubungan antara panjang rantai anion dan toksisitas ini tampaknya tidak diakui secara luas sebagai efek dari panjang rantai kation, dan oleh karena itu perlu diselidiki lebih lanjut.

Dalam penelitian ini kami menyelidiki sitotoksisitas akut dari tujuh ILS tersebut di lingkungan akuatik. Karena karboksilat rantai panjang, ILS dalam penelitian ini diasumsikan aktif permukaan dan sifat anion ini diharapkan untuk menentukan toksisitas ILS. Sebaliknya, kation diharapkan memiliki peran yang kurang signifikan karena panjang rantai pendeknya. Efek dari kation pada perilaku ILS diselidiki dengan menguji juga toksisitas setara garam natrium isostearat, decanoate dan neodecanoate, sebagai bahan referensi. Anion isostearate dan neodecanoate berasal dari formulasi teknis asam isostearic dan asam neodecanoic. Keduanya adalah asam bercabang. Asam isostearat berbasis bio, berasal dari trimerisasi asam lemak minyak tinggi dan hidrogenasi dari residu monomer 10 . Asam neodecanoic adalah turunan berbasis petrokimia berbiaya rendah, diperoleh melalui kimia Reppe-Koch (hidrokarboksilasi yang dikatalisis asam) pada isomer oktene, yang berasal dari polimerisasi propena 11, 12 .

Dalam penelitian ini toksisitas ditentukan dengan memaparkan bakteri laut Vibrio fischeri ke larutan ILS pada konsentrasi yang berbeda. Bakteri ini telah berhasil digunakan untuk penilaian toksisitas IL dalam berbagai penelitian 7.13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 . Perbandingan terbaru dilakukan antara V. fischeri dan tiga uji toksisitas terstandarisasi lainnya yang menggunakan organisme akuatik, yaitu Daphnia magna (krustasea air tawar), Selenastrum capricornutum (ganggang air tawar) dan Phaeodactylum tricornutum (alga air laut) 40 . Berdasarkan penelitian, V. fischeri adalah yang paling sensitif untuk racun aktif permukaan (deterjen) dan, oleh karena itu, bakteri ini dipilih untuk penilaian toksisitas ILS permukaan-aktif dalam penelitian ini.

Konsentrasi efektif median (EC 50 ) ditentukan untuk setiap IL. Karena efek toksik diduga disebabkan oleh permeasi molekul permukaan-aktif ke dalam dinding sel bakteri, interaksi terkait ILS dengan liposom biomimetik diselidiki menggunakan diferensial pemindaian kalorimetri (DSC). Dalam percobaan DSC, liposom dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) digunakan sebagai membran biomimik dan perubahan suhu transisi fase utama ( Tm ) dari bilayer DPPC diikuti, sebagai fungsi dari konsentrasi IL. Pengukuran semacam itu berpotensi menawarkan informasi lebih lanjut tentang bagaimana ILS tersebut berinteraksi dengan lapisan ganda lipid. Terakhir, konsentrasi misel kritis (CMC) didefinisikan untuk ILS. Berdasarkan CMC, dapat ditentukan apakah ILS dilarutkan sebagai molekul yang terdispersi secara tunggal atau jika mereka membentuk dispersi misel, atau struktur rakitan (agregat) lainnya. Oleh karena itu, dapat ditentukan jika interaksi antara liposom terjadi antara agregat IL atau molekul IL yang terdispersi secara tunggal.

Hasil kami menunjukkan bahwa anion rantai panjang karboksilat menentukan toksisitas ILS ini, sedangkan kation non-permukaan-aktif kurang berdampak pada toksisitas. Selain itu, berdasarkan studi DSC, panjang rantai anion alkil dan bercabang terutama menentukan tingkat interaksi. Namun, berbeda dengan studi toksisitas, dampak anion lebih dipengaruhi oleh kation yang menyertainya.

Hasil dan Diskusi

Sitotoksisitas akut

Pengukuran toksisitas dilakukan terutama dari sudut pandang ekotoksikologis, karena ILS berpotensi berbahaya bagi lingkungan dan khususnya untuk organisme di lingkungan perairan tetapi juga untuk manusia. Oleh karena itu, bakteri laut V. fischeri digunakan dalam pengukuran ini. Nilai EC 50 ditentukan untuk tujuh ILS aktif permukaan yang larut dalam air. ILS dalam penelitian ini mencakup ILS berbasis Ch, GND, dan TMG dengan rantai asam lemak lurus dan bercabang (iso dan neo), yaitu isostearate, decanoate, dan neodecanoate. Sebagai referensi, toksisitas garam natrium karboksilat ini diukur untuk mendapatkan informasi tentang efek kation pada toksisitas ILS.

Klasifikasi toksisitas IL saat ini didasarkan pada konsentrasi massa, bukan molar. Oleh karena itu, nilai EC 50 disajikan pada Gambar. 2A, berdasarkan massa. Seperti yang diklasifikasikan oleh Ruokonen et al . 8 ILS dalam penelitian ini adalah racun sedang (decanoate dan isostearate antara 10-100 mg / L) atau praktis tidak berbahaya (neodecanoate 100-1000 mg / L) sesuai dengan nilai EC 50 mereka. Dua nilai EC 50, setelah inkubasi 5 dan 15 menit, disediakan untuk tujuan referensi, karena salah satu dari waktu inkubasi ini biasanya digunakan dalam penelitian sebelumnya 7, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 38, 39 memanfaatkan bakteri V. fischeri . Efek toksik tergantung pada waktu, terutama dengan waktu inkubasi yang relatif singkat (skala waktu menit). Ketika waktu inkubasi ditingkatkan, konsentrasi yang lebih rendah diperlukan untuk mencapai efek median. Oleh karena itu inkubasi 15 menit menghasilkan toksisitas yang lebih tinggi ( yaitu nilai EC 50 yang lebih rendah).

Image

Nilai EC 50 ditentukan untuk ILS menggunakan bakteri Vibrio Fischeri dengan inkubasi 5 menit dan 15 menit. Disajikan sebagai massa ( A ) dan sebagai konsentrasi molar ( B ).

Gambar ukuran penuh

Karena tujuan dari penelitian ini adalah untuk menyelidiki apakah sifat toksik IL disebabkan oleh permeasi IL ke dalam lipid bilayer, jumlah molekul yang berpotensi berinteraksi dengan bakteri adalah yang paling menarik. Toksisitas dinormalisasi dengan jumlah molekul dalam larutan dan, oleh karena itu, disajikan pada Gambar. 2B dan pada Tabel 1 sebagai konsentrasi molar.

Diketahui dari penelitian sebelumnya bahwa rantai alkil yang lebih lama meningkatkan toksisitas ILs 3, 7, 8, 9, 13, 15, 18 . Oleh karena itu, hanya berdasarkan panjang rantai, Na dan Ch isostearate harus secara signifikan lebih beracun daripada decanoate yang sesuai (Gbr. 2B). Toksisitas serupa dari isostearate dan decanoate ini menunjukkan bahwa percabangan isostearat sangat mengurangi toksisitasnya. Sayangnya, perbandingan dengan stearat yang sesuai tidak dimungkinkan karena kelarutan airnya yang sangat buruk. Perbedaan antara nilai EC 50 dari Na dan Ch decanoate dan neodecanoate yang sesuai jelas menggambarkan efek percabangan pada toksisitas: decanoate rantai lurus lebih beracun daripada neodecanoate yang bercabang (nilai rata-rata ~ 0, 1 mM vs ~ 0, 5 mM, lihat Gbr. 2B untuk perbandingan).

Karena pengukuran toksisitas dilakukan dalam larutan NaCl 2%, perubahan halus dalam konsentrasi Na-kation tidak mempengaruhi viabilitas sel. Oleh karena itu, kation kolin tidak memiliki efek praktis pada toksisitas salah satu Ch yang mengandung ILs: Ch isostearate dan Ch neodecanoate agak kurang beracun daripada setara yang mengandung kation Na, sedangkan Ch decanoate lebih toksik daripada Na decanoate ( Gbr. 2B). Namun, dengan mempertimbangkan standar deviasi perbedaannya sangat kecil.

GND dan TMG isostearate memiliki toksisitas yang serupa dan tampaknya lebih toksik daripada yang setara dengan Na dan Ch (Gbr. 2B). Sebaliknya, dalam kelompok neodecanoate, GND dan TMG jelas kurang beracun dibandingkan dengan Na dan Ch mereka.

Singkatnya, panjang rantai anil asil tampaknya memiliki korelasi kuat dengan toksisitas ILS dalam penelitian ini. Efek yang serupa telah diamati sebelumnya dengan IL yang berbeda dan organisme uji. Berdasarkan Ruokonen et al . 8, peningkatan rantai alkil anion ILs fosfonium-karboksilat (C6, C10, C14, C16 dan C18) meningkatkan toksisitas IL (diukur menggunakan kultur sel ovarium hamster Cina), sejauh molekul dilarutkan sebagai molekul yang terpisah secara tunggal 8 . Petkovic et al . menunjukkan bahwa peningkatan toksisitas kolin-karboksilat-IL mengikuti panjang rantai alkil (C2 <C3 <C4 <C5 <C6 <C8 <C10) 9 . Berdasarkan Rengstl et al . efek yang sama diamati dengan IL-kolin-karboksilat dengan C2-C10 menggunakan sel HeLa dan SK-MEL28 (keratinosit) - namun, trennya tidak linear 7 . Khususnya, dengan rantai yang lebih pendek ( 6 . Tampaknya panjang rantai asil sebagian besar meningkatkan toksisitas dengan panjang rantai alkil> 6 karbon, sedangkan, dengan rantai yang lebih pendek efeknya tidak dapat diprediksi dan mungkin lebih terpengaruh oleh jenis kation.

Dalam penelitian ini, percabangan rantai alkil anion menurunkan toksisitas. Secara umum, efek percabangan, bagaimanapun, tidak mudah dan tampaknya sangat tergantung pada kelompok kepala komponen permukaan-aktif 9, 27, 31, 41 .

Secara keseluruhan, dalam penelitian ini efek kation itu kecil dibandingkan dengan efek anion. Efek seperti itu juga telah dideteksi dalam penelitian lain, misalnya, untuk kolin karboksilat 7, 9 . Dalam penelitian ini, kation memengaruhi nilai EC 50 hanya dalam analog neodecanoate: yang mengejutkan, kation GND dan TMG menurunkan toksisitas ILS bila dibandingkan dengan ekuivalen Na dan Ch mereka.

Kalorimetri Pemindaian Diferensial

Tujuan dari studi DSC adalah untuk menyelidiki apakah ada hubungan antara nilai EC 50 yang didefinisikan dengan bakteri V. fischeri dan titik pecah (atau kisaran) dari model lipid layer (DPPC). ILS dalam penelitian ini, dan khususnya komponen anioniknya, adalah molekul permukaan-aktif. Mereka diharapkan meresap ke dalam bilayers liposom DPPC yang digunakan sebagai membran biomimetik. Ini akan menghasilkan penurunan urutan bilayer DPPC, dan akibatnya dalam transformasi bertahap bilayer menjadi fase yang lebih fluid, seperti yang dibentuk oleh fosfolipid tak jenuh pada suhu kamar. Pendekatan serupa dalam studi IL telah digunakan oleh Gal et al . 42 dan Rengstl et al . 7 .

Karena Tm dari lapisan DPPC murni terbentuk dengan baik (sekitar 41, 3 ° C) dan sangat berulang 43, DPPC dipilih sebagai referensi membran biomimetik. Transisi terjadi ketika lipid bilayer mengalami transisi dari fase gel yang dipesan menjadi fase L-alpha yang cair. Transisi fase bilayer lipid (seperti DPPC) adalah fenomena kooperatif (lihat deskripsi lebih rinci tentang kooperatifitas di Chiu dan Prenner 44 ), yaitu perubahan konformasi dalam satu molekul yang memaksa molekul yang berdekatan untuk beradaptasi karena tingginya urutan bilayer. Oleh karena itu, transisi fase bilayer yang terbuat dari lipid murni berlangsung dalam kisaran suhu yang sangat sempit dan menghasilkan puncak endotermik yang tajam. Sebaliknya, pengotor seperti molekul aktif permukaan lainnya (surfaktan) yang dicampur dengan fosfolipid menurunkan urutan lapisan ganda. Ini mengurangi kooperatifitas lipid dan menghasilkan puncak yang lebih luas.

Surfaktan berinteraksi dengan atau meresap ke dalam lapisan lipid, Tm mulai bergeser secara bertahap menuju suhu yang lebih rendah, sebagai fungsi dari konsentrasi surfaktan 43 . Ini disebabkan menurunnya urutan lipid dalam membran fase-gel yang terkondensasi. Karena interaksi antara surfaktan dan liposom, sangat mungkin bahwa vesikel surfaktan-lipid terorganisir baru terbentuk. Setidaknya dua skenario yang berbeda dimungkinkan: i) Surfaktan yang dicampur dengan lipid mengganggu pengorganisasian lapisan lipid, dan puncak endoterm, yang disebabkan oleh transisi, menghilang secara bertahap ketika proporsi surfaktan meningkat. ii) Surfaktan dan lipid membentuk lapisan ganda baru yang cukup teratur, dan pembentukan fase baru masuk akal. Ketika jumlah komponen IL dalam bilayer tumbuh cukup tinggi, vesikel yang baru terbentuk juga dapat pecah (berlaku untuk kedua skenario).

Mekanisme pecahnya mungkin mirip dengan apa yang telah diamati untuk surfaktan netral, anionik, dan kationik dan model lipid bilayers 45, 46 . Pertama-tama komponen IL-aktif permukaan meresap ke dalam lapisan ganda DPPC dan IL / DPPC terbentuk (IL monomer + DPPC liposom = IL / DPPC vesikel). Pada fase ini endoterm yang dihasilkan oleh transisi fase utama diamati, tetapi pada Tm berbeda dari untuk lapisan lipid murni. Perembesan surfaktan terjadi sampai membran jenuh dengan surfaktan. Ketika konsentrasi surfaktan ditingkatkan melebihi ambang batas IL- dan / atau lipid tertentu, masuk akal bahwa bilayer berangsur-angsur hancur dan agregat IL / DPPC tambahan terbentuk. Oleh karena itu, mungkin suatu keadaan tercapai di mana agregat hidup berdampingan dengan vesikel IL / DPPC yang tersisa. Namun, kelompok agregasi mungkin tidak memiliki struktur yang terorganisir sehingga transisi fase apa pun akan terjadi. Endoterm hanya akan dihasilkan oleh transisi yang berasal dari bilayer IL / DPPC yang tersisa. Ketika konsentrasi surfaktan semakin meningkat, vesikel IL / DPPC pecah dan tetap sebagai agregat IL / DPPC.

Eksperimen DSC dilakukan untuk menentukan konsentrasi IL yang menyebabkan pergeseran suhu transisi fasa bilayer DPPC. Gambar 3 mengilustrasikan termogram representatif, yang direkam selama pemindaian pemanasan kedua. Karena pemanasan dan pemindaian pendingin dilakukan tiga kali, termogram pemanasan kedua dipilih sebagai yang representatif. Seringkali termogram pertama berbeda dari dua yang terakhir, yang sebagian besar identik satu sama lain. Jika variasi awal yang diamati selama pemindaian pemanasan pertama tidak diamati pada dua pemindaian berikut dan dengan konsentrasi ILS yang sama, mereka dianggap sebagai artefak. Dengan ILS tertentu, intensitas puncak berkurang dengan pemindaian pemanasan. Pergeseran sedikit dari puncak juga diamati. Perubahan-perubahan ini kemungkinan besar disebabkan oleh reorganisasi membran IL-lipid ketika sistem dipanaskan dan didinginkan. Perbedaan diamati terutama antara scan pemanasan pertama dan kedua dijelaskan oleh fakta bahwa; ketika lapisan lipid DPPC dipanaskan ke kondisi fluid, komponen IL dapat lebih mudah meresap ke dalam lapisan lipid dan sistem menyeimbangkan. Selama pendinginan dan pemindaian pemanasan kedua, pengotor permukaan-aktif sudah ada dalam lapisan dan oleh karena itu, sedikit perubahan yang diamati antara kedua pemindaian terakhir. Pindaian pendingin (tidak ditampilkan) direkam untuk mengikuti stabilitas sistem, namun, tidak ada analisis lebih lanjut dari pindaian pendinginan yang dilakukan. Pemindaian pemanasan dan pendinginan seperti itu merupakan standar dalam percobaan DSC.

Image

Termogram diukur untuk liposom DPPC murni (0, 4 mM) dan campuran liposom DPPC dan konsentrasi isostearate ( A ) yang berbeda, decanoate dan neodecanoates IL ( B ). Puncak merupakan transisi fase endotermik. Garis putus-putus (jika ada) menunjukkan batas setelah IL didispersikan sebagai agregat (CMC).

Gambar ukuran penuh

Nilai EC 50 yang disediakan oleh uji toksisitas mungkin tergantung pada mekanisme interaksi kompleks yang berbeda antara racun dan organisme. Sebaliknya, interaksi antara toksik aktif-permukaan dan liposom lebih sederhana. Konsentrasi IL menghasilkan dampak yang dapat diamati pada transisi fase bilayer (konsentrasi efektif) tergantung, tidak hanya pada konsentrasi dan sifat ILS, tetapi juga pada konsentrasi liposom (konsentrasi molar lipid). Efeknya tergantung pada rasio kedua komponen ini. Oleh karena itu, karena perbedaan antara kedua sistem, konsentrasi efektif ILS yang diperoleh dari DSC tidak diharapkan sama dengan nilai EC 50 . Konsentrasi lipid 0, 4 mM dipilih karena memberikan sinyal berbentuk simetris dan berulang dengan kalorimeter yang kami gunakan.

Hasil DSC dibahas secara lebih rinci dalam teks berikut untuk setiap kelompok IL karboksilat. Kisaran konsentrasi di mana endoterm transisi fase hilang disajikan pada Tabel 1. Alih-alih merujuk ke daerah puncak, yang menentukan energi yang diambil oleh transisi (kal / mol), ketinggian puncak yang sesuai disebut dalam teks, karena perubahan relatif pada ketinggian puncak lebih mudah diamati dengan inspeksi visual.

Isostearates

Perilaku Ch, GND dan TMG isostearate sangat mirip dan sebagian besar independen dari kation (Gambar 3A). Konsentrasi 0, 1 mM telah menyebabkan transisi bergeser ke suhu yang lebih rendah dan puncak kehilangan profil yang tajam, menunjukkan bahwa urutan dan kerja sama dalam bilayer sangat menurun. Pada 0, 5 mM transisi bergeser ke ~ 35 ° C dan di bawah, tergantung pada IL, dan ketinggian puncak semakin menurun dari konsentrasi sebelumnya. Puncak yang disebabkan oleh transisi fase utama tidak terdeteksi lagi pada konsentrasi 1, 0 mM - puncak luas samar masih nyaris tidak terlihat untuk TMG isostearate.

Menariknya, endoterm samar pada suhu transisi DPPC asli tetap di seluruh rentang konsentrasi, terutama terlihat dalam termogram Ch dan GND isostearate. Untuk GND isostearate 5, 10 dan 20 mM konsentrasi juga diukur (tidak ditunjukkan pada Gambar. 3A) dan puncak kecil masih dapat diamati di semua termogram ini, mirip dengan konsentrasi 0, 5 dan 1, 0 mM. Juga dengan TMG sinyal yang hampir tidak terdeteksi diamati dalam termogram pemindaian pemanasan pertama pada konsentrasi 0, 5 mM dan 1, 0 mM, tetapi puncaknya tidak terlihat pada pemindaian kedua dan ketiga, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3A. Dalam semua percobaan ini, intensitas puncak kecil ini menurun sekitar 2-4 kali lipat antara pemindaian pemanasan pertama dan kedua. Tampaknya karena alasan tertentu, sejumlah kecil liposom DPPC tetap tidak terpengaruh dalam larutan atau daerah yang dipisahkan fase tetap berada dalam vesikel IL / DPPC.

Perilaku Na isostearate menyimpang secara substansial dari isostearate lain sejak hilangnya fase transisi utama, mungkin disebabkan oleh pecahnya bilayer, telah terjadi antara konsentrasi 0, 01 dan 0, 001 mM. Data kolektif ini menunjukkan bahwa dengan isostearates kation juga berdampak pada interaksi IL-liposom yang sangat mengurangi efek berbahaya anion.

Decanoates

The decanoates, memiliki nilai EC 50 yang sangat mirip dengan isostearate, menunjukkan perilaku yang agak berbeda dalam percobaan DSC (Gbr. 3B). Dibandingkan dengan isostearate, konsentrasi Na decanoate yang lebih tinggi diperlukan untuk menginduksi pergeseran dalam Tm . Pergeseran minor dalam Tm terlihat pada konsentrasi 10 mM. Pengamatan lebih dekat menyiratkan bahwa puncak dibentuk oleh dua endoterm yang tumpang tindih, menunjukkan bahwa dua transisi endoterm yang tumpang tindih terjadi. Selain kotoran bertahap dalam Tm, ketinggian puncak lebih lanjut menurun pada konsentrasi 50 dan 100 mM tetapi meningkat pada konsentrasi 500 mM. Selain itu, dengan meningkatnya konsentrasi decanoate, endoterm yang tumpang tindih menjadi lebih jelas. Pengamatan ini menunjukkan bahwa vesikel IL-lipid campuran baru terbentuk dan bahwa bilayer dapat beradaptasi fase yang agak terorganisir, ketika proporsi IL-lipid tertentu tercapai. Namun, perilaku transisi fase terperinci dari vesikel yang baru terbentuk ini berada di luar ruang lingkup penelitian ini. Dibandingkan dengan Na decanoate, konsentrasi yang lebih rendah diperlukan untuk Ch decanoate. Hilangnya transisi terjadi antara 2 hingga 5 mM konsentrasi, mungkin karena pecahnya vesikel. Perbandingan data yang diperoleh untuk decanoate Na dan Ch, menunjukkan bahwa keberadaan kation kolin sangat mengubah efek anion decanoate.

Rengstl et al . meneliti efek Ch nonanoate (C9) pada liposom DPPC menggunakan DSC 7 . Anehnya, konsentrasi efektifnya jauh lebih besar daripada yang diamati di sini dengan Ch decanoate. Konsentrasi meningkat hingga 50 mM dan puncak untuk Tm masih diamati, sedangkan endoterm hilang antara 2 dan 5 mM konsentrasi menggunakan Ch decanoate dalam penelitian ini.

Neodecanoates

Perilaku Na neodecanoate mirip dengan Na decanoate, namun, pada konsentrasi yang jauh lebih rendah (Gambar 3B). Transisi lain terlihat pada konsentrasi 10 mM dan lebih jelas pada konsentrasi 20 mM dan 40 mM. Berbeda dengan Na decanoate, transisi fase hilang antara 40 mM dan 60 mM konsentrasi yang paling mungkin karena pecahnya liposom. Neodecanoate ChD dan GND menunjukkan perilaku yang lebih mudah diprediksi. Untuk Ch neodecanoate, puncak luas samar yang disebabkan oleh transisi diamati hingga konsentrasi 60 mM. Karena tidak ada perubahan signifikan pada ketinggian puncak yang diamati antara konsentrasi 10 mM dan 60 mM, tidak ada konsentrasi yang lebih tinggi yang diukur. GND neodecanoate menunjukkan perilaku yang sangat dapat diprediksi dan konsisten sampai pecahnya vesikel antara konsentrasi 15 dan 25 mM.

Neodecanoate TMG menunjukkan perilaku yang sangat mirip dengan neodecanoate GND hingga konsentrasi 5 mM. Pada 15 mM, hanya puncak luas yang sangat samar diamati. Peningkatan konsentrasi lebih lanjut, hingga 30 mM, menghasilkan transisi lain. Intensitas puncak ini meningkat dengan meningkatnya konsentrasi, melebihi intensitas transisi asli. Neodecanoate TMG murni 75 mM juga diukur sebagai referensi dan hanya sinyal yang sangat kecil (tidak ditunjukkan) yang hampir tidak menyimpang dari baseline yang diamati, pada suhu transisi yang kira-kira sama dengan puncak terbesar dalam percobaan IL / DPPC 75 mM. Data ini juga menunjukkan bahwa fase baru terbentuk ketika proporsi IL / lipid tertentu tercapai dalam lapisan ganda vesikel. Ini didukung oleh hasil yang diperoleh dengan vesikula asam lemak / DPPC dengan mengubah proporsi asam lemak dalam lapisan ganda 47 . Pembentukan puncak endotermik baru yang serupa, di bawah Tm, dideteksi dengan asam oleat. Menurut penulis, ini disebabkan oleh pembentukan fase yang hidup berdampingan di vesikel.

Konsentrasi misel kritis

Konsentrasi misel kritis diukur untuk menentukan ambang konsentrasi untuk agregasi molekul IL terdispersi tunggal (pembentukan misel). ILS dapat berinteraksi secara berbeda dengan liposom tergantung pada apakah mereka sebagai molekul terdispersi secara tunggal (monomer) atau sebagai agregat. Karena anion IL dalam penelitian ini adalah isostearat permukaan aktif, decanoat, dan neodekanoat, anion diharapkan terutama menentukan CMC IL.

CMC untuk ILS disajikan pada Tabel 1. Seperti yang diharapkan, untuk rantai panjang isostearate, CMC lebih rendah daripada untuk decanoate rantai pendek. Juga, percabangan neodecanoates meningkatkan CMC. Gambar 4 mencontohkan tiga grafik yang berbeda yang digunakan untuk mendefinisikan CMC Ch isostearate, decanoate dan neodecanoate. Untuk Ch isostearate, break point yang berbeda terlihat pada konsentrasi ~ 0, 5 mM. Untuk kasus seperti itu, kecocokan linear, sigmoidal, dan logaritmik memberikan hasil yang sangat mirip tanpa tergantung pada metode pemasangan. Untuk Ch decanoate dan neodecanoate, kemiringannya lebih ringan dan penentuan titik spesifik untuk CMC lebih sulit. Untuk ILS seperti itu, logaritma konsentrasi IL dan kesesuaian logaritma digunakan karena nilai yang lebih tepat dapat diperoleh dengan menggunakan metode ini. Metode pemasangan yang digunakan untuk setiap IL ditunjukkan pada Tabel 1. Pemasangan logaritmik digunakan untuk semua IL, kecuali untuk GND dan TMG isostearate yang digunakan pemasangan sigmoidal.

Image

Grafik menunjukkan sifat surfaktan yang berbeda dari masing-masing IL. Data tegangan permukaan yang diperoleh menggunakan metode drop pendant (lihat 'Metode' untuk deskripsi lebih rinci) diplot sebagai fungsi dari konsentrasi IL. CMC yang tepat ditentukan oleh pemasangan logaritmik (lihat Hasil dan Diskusi untuk deskripsi lebih rinci).

Gambar ukuran penuh

Di antara isostearate, nilai CMC rata-rata berada dalam urutan yang sama besarnya, yaitu 0, 3 - 0, 7 mM, menunjukkan bahwa keberadaan kation tidak sangat mempengaruhi CMC mereka. CMC untuk decanoate, 90 ± 3 mM untuk Na dan 23 ± 4 mM untuk Ch decanoate sangat berbeda. CMC untuk Na decanoate sejalan dengan nilai yang diterima secara luas ~ 100 mM 48 . Menariknya CMC untuk Ch decanoate agak lebih rendah dari nilai 75 mM yang ditentukan dalam penelitian sebelumnya 7 . Untuk neodecanoate, nilai rata-rata terutama lebih tinggi - kira-kira antara 100 dan 450 mM. Kation ini tampaknya mempengaruhi CMCs semua ILS dalam penelitian ini. Namun, efeknya tergantung IL.

Mempertimbangkan efek potensial agregasi pada toksisitas, secara teori nilai EC 50 yang ditentukan untuk isostearate dapat dipengaruhi oleh agregasi IL. Agregasi IL tidak selalu terjadi pada konsentrasi yang ditentukan secara tajam (yaitu tepatnya pada CMC) dan, karenanya, komponen IL mulai agregat sebelum CMC tercapai. Agregasi pra-CMC ini mengurangi jumlah monomer bebas (berpotensi toksik) dalam larutan dan karenanya dapat mengurangi toksisitas IL. Karena isostearate memiliki CMC mendekati nilai EC 50 mereka, agregasi tersebut dapat menjelaskan mengapa toksisitas isostearat yang tampak tidak setinggi yang disarankan oleh panjang rantai anion, misalnya bila dibandingkan dengan decanoate. Namun, ada break point yang terdeteksi pada plot CMC isostearate (lihat Gambar 4 untuk plot Ch decanoate). Hal ini menunjukkan bahwa untuk isostearate, agregasi terjadi secara cepat sangat dekat dengan CMC yaitu tidak terjadi agregasi di bawah CMC. Oleh karena itu, efek praktis agregasi pra-CMC untuk isostearat tidak besar. Karena CMCs dari decanoate dan neodecanoate jauh lebih tinggi dari nilai EC 50 mereka, agregasi mereka tidak mempengaruhi penentuan toksisitas mereka. Dampak CMC pada hasil DSC dibahas secara lebih rinci di bawah ini.

Efek CMC pada interaksi ionik cair-liposom

Dalam percobaan DSC, agregasi ILS dapat mempengaruhi interaksi antara ILS dan liposom. Dengan Ch, GND dan TMG isostearate, konsentrasi efektif sangat dekat dengan nilai CMC mereka (Tabel 1). Untuk Ch, GND dan TMG isostearate, endoterm diamati pada konsentrasi tepat di bawah CMC (pada 0, 1 mM untuk Ch, GND dan pada 0, 2 mM untuk TMG isostearate, lihat Gambar. 3A). Namun, endoterm hampir tidak terlihat pada konsentrasi 0, 5 mM dan pada konsentrasi 1 mM tidak ada puncak yang terlihat. Lebih lanjut, tidak ada endoterm yang teramati untuk 2 mM Ch, GND dan TMG isostearate (thermogram tidak ditampilkan). Data ini menunjukkan bahwa agregasi tidak berdampak pada interaksi IL-liposome. Setidaknya ada dua penjelasan yang mungkin untuk pengamatan ini.

i) Salah satu mekanisme yang memungkinkan untuk perilaku tersebut disajikan sebagai berikut; Ketika konsentrasi IL dalam campuran IL dan liposom DPPC berada di bawah CMC, monomer IL aktif permukaan bebas meresap ke dalam bilayer DPPC dan kemungkinan besar tetap di sana. Ketika konsentrasi IL dan fosfolipid berada dalam urutan yang sama besarnya (seperti dengan isostearat), suatu keadaan tercapai di mana semua monomer IL dimasukkan ke dalam bilayer dan tidak ada yang bebas dalam larutan. Atau, bilayer jenuh dengan ILS, monomer berhenti meresap ke dalam bilayer, dan konsentrasi monomer tertentu tetap dalam larutan. Ini sangat mungkin terjadi ketika konsentrasi IL jauh melebihi konsentrasi lipid. Sebaliknya, di atas CMC terdapat koeksistensi IL monomer dan agregat IL. Pada dan di atas CMC konsentrasi monomer sama dengan CMC dan semua monomer di atas konsentrasi ini termasuk dalam agregat. Mirip dengan uraian di atas, monomer bebas masih dapat meresap ke dalam liposom. Karena konsentrasi monomer IL bebas dalam larutan menurun, agregat IL secara bertahap hancur menjadi monomer bebas karena keseimbangan dinamis yang ada antara monomer bebas dan agregat. Proses disintegrasi agregat ini terjadi sampai konsentrasi monomer lagi sama dengan CMC, atau ketika tidak ada agregat IL yang tersisa. Oleh karena itu, dengan mekanisme ini, dampak nyata ILS agregat dapat serupa dengan monomer bebas.

ii) Penjelasan lain yang mungkin adalah pengaruh suhu pada CMC. CMC surfaktan anionik diketahui meningkat agak sebagai fungsi suhu 49 . Oleh karena itu, efek serupa juga dapat disebabkan oleh peningkatan CMC selama pemindaian pemanasan. Pertama, ketika CMC terlampaui pada suhu yang lebih rendah (misalnya pada suhu kamar), ILS membentuk agregat. Ketika suhu dinaikkan selama pemindaian pemanasan, agregat hancur menjadi monomer karena kenaikan CMC yang berakibat. Oleh karena itu, lebih banyak monomer bebas tersedia untuk berinteraksi dengan liposom DPPC.

Untuk Na isostearate tidak ada endoterm yang diamati pada konsentrasi 0, 01 mM. Karena konsentrasi ini jauh lebih rendah daripada CMC, molekul IL yang didispersikan secara tunggal berinteraksi dengan liposom. Hilangnya endoterm disebabkan oleh pembentukan fase IL-lipid fluida baru atau oleh pecahnya membran.

Kisaran konsentrasi IL selama percobaan DSC jelas di bawah CMCs untuk decanoate dan neodecanoate, kecuali untuk Na decanoate, yang digunakan sebagai referensi untuk ILs. Oleh karena itu, tidak termasuk Na decanoate, data jelas menunjukkan bahwa molekul IL terdispersi secara tunggal berinteraksi dengan liposom. Karena CMC Na decanoate adalah ~ 90 mM, agregat hadir pada konsentrasi 100 mM dan 500 mM. Mekanisme interaksi mungkin didasarkan pada disintegrasi agregat yang sama seperti yang dijelaskan di atas untuk isostearate. Termogram diukur untuk sodium decanoate murni 250 mM dan tidak ada transisi yang diamati. Ini menunjukkan bahwa endotermik sebenarnya hasil dari transisi yang terjadi di vesikula decanoate / DPPC.

Ringkasan

Tujuh ILS yang berbasis ChD, GND, dan TMG dengan anion rantai panjang diselidiki. Toksisitas didefinisikan terutama oleh anion rantai panjang - semakin lama rantai, semakin toksik senyawa tersebut. Percabangan anion mengurangi toksisitas ILS. Kation tidak memiliki dampak yang signifikan terhadap toksisitas decananoate dan isostearate, tetapi neodecanoate GND dan TMG secara mengejutkan agak kurang toksik daripada setara Ch mereka.

Percobaan DSC digunakan untuk menyelidiki efek potensial dari ILS permukaan-aktif pada liposom DPPC. Liposom ini digunakan sebagai bilayers lipid biomimetik dan Tm membran diikuti sebagai fungsi dari konsentrasi IL. Panjang rantai anion sangat menentukan sejauh mana ILS mempengaruhi liposom, serta toksisitas. Isostearat mempengaruhi liposom pada konsentrasi <1, 0 mM, Ch decanoate pada konsentrasi 0, 5-5 mM, dan neodecanoate pada konsentrasi ≫ 1 mM. Kehadiran kation Ch, GND atau TMG jelas berdampak pada perilaku semua anion, jika dibandingkan dengan garam Na dari masing-masing anion. Tidak ada perbedaan besar antara Ch, GND dan TMG isostearate, sedangkan, efek yang berbeda yang diinduksi oleh kation diamati untuk decanoate dan neodecanoate. Namun, tidak ada tren yang diamati untuk efek kation, apalagi, perilaku itu tergantung IL.

Berdasarkan penelitian ini, DSC adalah alat yang valid untuk menyelidiki interaksi antara ILS permukaan-aktif dan lapisan lipid biomimetik. Menurut penelitian ini, prediksi tentatif toksisitas ILS yang sebanding (serupa) dapat dilakukan. Namun, konsentrasi IL toksik tidak dapat diperkirakan. Mempertimbangkan dinding sel bakteri atau membran biologis lainnya dan liposom DPPC biomimetik yang digunakan dalam penelitian ini, dua lapisan lipid yang sangat berbeda diselidiki. DPPC membentuk lapisan ganda yang sangat terorganisir di bawah Tmnya, sedangkan dinding sel bakteri, serta lapisan ganda lipid biologis lainnya, terutama merupakan campuran fase cair dari beberapa spesies dan protein lipid yang berbeda. Oleh karena itu, lapisan lipid fluida lebih rentan untuk permeasi pengotor permukaan-aktif daripada bilayers DPPC terkondensasi. Namun, bakteri mungkin memiliki mekanisme perlindungan terhadap racun, dan juga mekanisme toksisitasnya mungkin sangat kompleks. Oleh karena itu, tidak dapat diharapkan bahwa konsentrasi EC 50 akan cocok dengan konsentrasi efektif yang digunakan dalam percobaan DSC.

Juga, analisis hasil DSC tergantung pada apa yang dianggap sebagai konsentrasi toksik dalam membran model. Proporsi pengotor yang sangat kecil yang menembus ke dalam membran organisme model mungkin beracun. Sebaliknya, proporsi yang sama dari lipid dalam membran biomimetik mungkin tidak memiliki efek yang cukup besar pada perilaku transisi fase. Dalam penelitian ini tujuannya adalah untuk menyelidiki efek skala besar seperti pecahnya liposom. Oleh karena itu, konsentrasi efektif ILS tinggi dibandingkan dengan nilai EC 50, terutama untuk rantai pendek decanoate dan neodecanoate.

Akibatnya, perlu diingat bahwa meskipun toksisitas ILS dalam penelitian ini bergantung pada sifat aktif permukaannya, kerusakan yang ditimbulkannya dengan merembes ke dalam organisme model yang berlapis-lapis mungkin tidak bersifat struktural pada intinya. Selain itu, ILS dapat mengganggu fungsi jalur pensinyalan sel yang bergantung pada membran vital dengan mengganggu organisasi lipid dan protein dalam bilayer.

Metode

Bahan kimia dan reagen untuk studi toksisitas dan interaksi

DPPC dibeli dari Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Kloroform tingkat HPLC diperoleh dari WVR internasional (Leuven, Belgia). Bakteri dan bahan kimia untuk menjalankan uji Microtox mana dibeli bentuk Modern Water (New Castle, DE, USA). Air ultra murni yang digunakan dalam percobaan pertama kali disuling dan kemudian disaring, dan dideionisasi menggunakan perangkat Milli-Q.

Sintesis cairan ionik

Semua ILS disiapkan dengan pencampuran sederhana dari reagen dengan ada atau tidak adanya pelarut, yaitu basa dengan asam masing-masing dalam rasio molar 1: 1. Beberapa pereaksi membutuhkan suhu tinggi atau pelarut; yaitu, NaOH (pelet) dan asam decanoat (padatan) di pra-larut dalam metanol. Kristal guanidinium karbonat diperlukan reaksi dalam metanol pada 50 ° C. Metanol dihilangkan setelah sintesis asam-basa dengan penguapan putar hingga ~ 10 mbars. Penguapan rotari juga digunakan untuk menghilangkan air, jika ada. Asam Neodecanoic (Versatic ™ acid 10) disediakan oleh Hexion Speciality Chemicals (Beveren, Belgia). Asam isostearat adalah merek Pristorine ™ 3501 (Croda International Plc, Snaith, East Yorkshire, UK), yang berasal dari di / trimerisasi dan hidrogenasi kadar asam lemak minyak tinggi. Karakterisasi-penugasan kelompok fungsional dilakukan oleh 1 H dan 13 C NMR (600 MHz) dalam D 2 O atau DMSO-d 6 . Titrasi Karl-Fischer digunakan untuk memantau kadar air hingga di bawah 1% berat. Semua struktur terbuat dari kaca, cair atau padat pada suhu kamar. Data Differential scanning calorimetry (DSC) dan termogravimetric analysis (TGA) akan disajikan dalam publikasi lebih lanjut.

Empat prosedur digunakan untuk mensintesis berbagai kelas kation cairan ion (choline, guanidnium, 1, 1, 3, 3-tetramethylguanidinium atau sodium):

Choline isostearate (contoh): Asam isostearic (317 g) ditambahkan dalam satu bagian ke dalam larutan komersial choline hydroxide (45% berat dalam metanol, 300 mL, 281 g) dalam labu Erlenmeyer 1 L. Solusinya dicampur pada suhu kamar, di mana eksoterm ringan diamati. Pencampuran dilanjutkan selama 30 menit lebih lanjut. Produk ini kemudian diuapkan dalam batch untuk menghilangkan metanol. Gel lembut dibentuk yang dibiarkan di dalam labu agar dingin semalaman. Fraksi kering digabungkan dan dibotolkan pada hari berikutnya untuk memberikan hasil kuantitatif. Analisis NMR hanya menunjukkan jejak pengotor (Informasi Tambahan).

Guanidinium isostearate (contoh): Asam isostearic (370 g) ditambahkan dalam satu bagian ke dalam larutan guanidinium karbonat (117 g) dalam metanol (217 g), dalam labu Erlenmeyer 1 L. Ini dicampur selama 45 menit pada 50 ° C sampai solusi yang jelas diperoleh. Produk dikeringkan dengan penguapan berputar dalam batch. Gel lembut dibentuk yang dibiarkan di dalam labu agar dingin semalaman. Fraksi kering digabungkan dan dibotolkan pada hari berikutnya untuk memberikan hasil kuantitatif. Analisis NMR hanya menunjukkan jejak pengotor (Informasi Tambahan).

1, 1, 3, 3-Tetramethylguanidinium isostearate (contoh): TMG (145 g) ditambahkan selama beberapa menit menjadi asam isostearat (355 g) dalam labu 1 L Erlenmeyer. Eksoterm ringan diamati. Campuran dibiarkan dingin untuk menghasilkan gel lembut dalam hasil kuantitatif. Analisis NMR hanya menunjukkan jejak pengotor (Informasi Tambahan).

Na isostearat (contoh): Pelet Na hidroksida hancur (1, 22 g) ditambahkan selama beberapa menit menjadi asam isostearat (8, 65 g) dalam metanol (12, 5 g) dalam labu Erlenmeyer 100 mL. Eksoterm ringan diamati. Campuran dibiarkan dingin untuk menghasilkan gel lembut dalam hasil kuantitatif. Analisis NMR hanya menunjukkan jejak pengotor (Informasi Tambahan).

Persiapan liposom

Solusi stok DPPC disiapkan dengan melarutkan DPPC dalam kloroform. Jumlah larutan stok yang diperlukan ditransfer ke tabung reaksi gelas dan kloroform diuapkan di bawah aliran udara untuk membentuk film tipis DPPC pada dinding tabung. Film lipid yang dikeringkan dengan udara diadakan di bawah desikator vakum setidaknya selama 2 jam untuk menghilangkan sisa pelarut. Lipid didispersikan ke dalam air untuk memperoleh stok liposom 4, 0 mM. Dispersi diinkubasi dalam penangas air ultrasonication selama 30 menit pada 60 ° C memfasilitasi pembentukan liposom multilamellar.

Uji toksisitas Vibrio fischeri

Toksisitas ILS ditentukan dengan mengukur nilai EC 50 mereka menggunakan bakteri V. fischeri dan Microtox luminometer / alat termostat (Modern Water, USA). Respons yang diukur dalam uji ini adalah peluruhan bioluminesensi yang dihasilkan oleh bakteri. Singkatnya, bioluminesensi diukur sebelum pemaparan pada senyawa yang berpotensi toksik untuk menentukan pendaran awal. Akibatnya, bakteri terpapar pada minimum empat konsentrasi toksik yang berbeda dalam 2% (b / v) larutan NaCl dan pembusukan dalam bioluminesensi dicatat. Berdasarkan peluruhan tergantung konsentrasi, nilai EC 50 didefinisikan. Toksisitas didefinisikan pada interval waktu 5 dan 15 menit. Two independent measurements were performed for each IL as duplicates.

Kalorimetri pemindaian diferensial

DSC was utilised in observing the changes induced by the ILs in the organisation of the lipid bilayers. DPPC was used because the T m of the bilayer is well recognised – approximately 41.3 °C 43 . Typically, when surface-active compounds permeate into the lipid layer, the transition temperature starts to shift with an increasing proportion of the compound in the lipid layer 47 . There are two additional transitions observed for DPPC aqueous solutions; the subtransition at 21 °C and the pretransition at 36 °C. However, the subtransition at 21 °C is visible only if the lipid is incubated below the transition temperature for several days. The transition at 36 °C is highly dependent on the heating rate and therefore may have somewhat differing values depending on the experimental setup 43 .

DSC experiments were performed using a VP-DSC MicroCalorimeter (MicroCal LLC, MA, USA). Aqueous stocks of DPPC liposome dispersion and IL solution were mixed resulting in a lipid concentration of 0.4 mM with varying concentration of IL. The samples were degassed under vacuum in order to avoid bubble formation during the sample loading and the heating/cooling scans. The mixtures were exposed to a heating scan starting from 15 °C and ending at 50 °C and subsequent cooling scan from 50 °C to 15 °C. The heating/cooling scans were repeated three times for each sample. The temperature was allowed to stabilise for 30 min before each heating scan. The temperature ramp was 60 °C/hour. The reference during the measurement was ultrapure water.

Critical micelle concentrations

Surfactants dissolve in aqueous solutions as monomers to certain concentration threshold, after which they start to build up into differing aggregates. This concentration threshold is called critical micellar concentration (CMC). However, for many surfactants the CMC is moreover a concentration range, not a specific concentration point, and the width of this CMC region depends greatly on the structure of the compound. In its simplest form the surfactants, such as fatty acids, form micelles, as the term critical micellar concentration suggests. Other surfactants such as phospholipids, however, form for instance liposomes, regardless, the term CMC is used. CMC and the form of the aggregates are dependent on the surfactant structure.

The optical pendant drop method using a contact angle meter (CAM 200, KSV Instruments, Espoo, Finland) was used for determining the CMCs. In short, a series of differing IL concentrations in water solution was investigated. A pendant-drop of a constant height was formed and the surface tension of the drop was determined based on the drop curvature by using a fitting method according to Young-Laplace equation. The surface tension was plotted as a function of the IL concentration.

The surface tension of the drop decreases as a function of increasing surfactant concentration because the singly dispersed IL molecules diffuse and orientate at the air-water interface and therefore reduce the surface tension. When the concentration reaches the CMC, additional molecules above this concentration form aggregates instead of diffusing to the surface of the drop. Therefore no change in surface tension is observed.

The CMCs were determined based on the intersection point of two trend lines fitted based on the data. The surface tension was either plotted as a function of IL concentration or logarithm of the concentration and either sigmoidal or logarithmic fit, respectively, was used. The choice of method was dependent on which method provided the best fit.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Informasi tambahan

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.