Analisis terintegrasi profil ekspresi microrna dan mrna di jaringan adiposa perut pada ayam | laporan ilmiah

Analisis terintegrasi profil ekspresi microrna dan mrna di jaringan adiposa perut pada ayam | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Genomik
  • Penyaringan throughput tinggi

Abstrak

Pertambahan lemak berlebihan adalah masalah penting selama produksi ayam pedaging. Berat lemak perut (AbFW) dan persentase lemak perut (AbFP) adalah indeks fenotipik utama dari sifat-sifat lemak. Penelitian ini menggunakan F2 betina yang berasal dari persilangan antara ayam Beijing-You dan Cobb-Vantress. Kohort dengan fenotipe AbFP dan AbFW yang ekstrim dipilih untuk membangun perpustakaan lemak tinggi dan rendah perut (HAbF dan LAbF, masing-masing) untuk menyelidiki profil ekspresi dengan urutan-RNA dan microRNA (miRNA). Dibandingkan dengan perpustakaan LAbF, 62 miRNA yang diekspresikan secara berbeda (DEM) dan 303 gen yang diekspresikan berbeda (DEG) diidentifikasi pada burung-burung HAbF. Analisis terpadu DEM dan DEG menunjukkan bahwa total 106 DEG diidentifikasi sebagai gen target untuk 62 DEM. Gen-gen ini ditetapkan sebagai gen interseksi, dan 11 gen ini terlibat dalam jalur metabolisme lipid. MiRNA gga-miR-19b-3p mempercepat proliferasi preadiposit, serta diferensiasi adiposit, dengan menurunkan pengaturan ACSL1 . Temuan ini menunjukkan bahwa beberapa kandidat miRNA dan gen yang kuat, penting dalam kaitannya dengan deposisi adiposa perut, diidentifikasi oleh analisis terpadu DEM dan DEG. Temuan ini menambah pemahaman kami saat ini tentang kontrol genetik molekuler yang mendasari akumulasi adiposa perut pada ayam.

pengantar

Seleksi genetik intensif selama beberapa dekade telah menghasilkan peningkatan berat badan, laju pertumbuhan, dan efisiensi konversi pakan pada ayam broiler 1 . Efek yang tidak diinginkan termasuk kelebihan yang menyertai dalam penumpukan lemak, terutama lemak perut. Breed broiler kontemporer mengandung 150 hingga 200 g lemak per kg berat badan, 85% di antaranya tidak penting secara fisiologis dan merupakan inefisiensi dalam produksi daging. Karena alasan ini, pertambahan lemak yang berlebihan merupakan masalah penting dalam produksi ayam pedaging. Berat lemak perut (AbFW) dan persentase lemak perut (AbFP) adalah indeks fenotipik utama dari sifat-sifat lemak. Lemak perut (AbFP) mencerminkan kontrol genetik yang mendasarinya kompleks dan memiliki heritabilitas sedang (h 2 = 0, 62 untuk AbFW, dan 0, 24 untuk AbFP) 2 . Oleh karena itu, layak untuk memodulasi pengendapan AbF dan tujuan ini akan dibantu oleh pemahaman yang lebih baik atas kontrol genetik molekulernya.

MicroRNAs (miRNAs) adalah RNA pengatur kecil endogen, non-coding berukuran 19 hingga 24 nukleotida (nt) yang berikatan dengan situs target pelengkap dalam 3 ′ daerah yang tidak diterjemahkan (UTR) mRNAs, menghasilkan represi translasi dan / atau destabilisasi mRNA 3, 4, 5 . MiRNA matang berasal dari prekursor pri-miRNA yang terdiri dari ratusan atau ribuan nt yang membentuk unit transkripsi monokistronik atau polikistronik 6, 7, 8 . RNA pengatur kecil ini telah terlibat dalam banyak dan berbagai proses biologis, termasuk proliferasi sel, diferensiasi, pengembangan, apoptosis, patogenesis, resistensi penyakit, tumorigenesis, dan lipogenesis 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15 . MiRNA ayam dalam berbagai jaringan telah diidentifikasi baru-baru ini dengan kombinasi metode. Sekuensing Solexa mengidentifikasi mikroRNA di beberapa tempat perkembangan embrio ayam 16, serta miRNA yang diekspresikan secara berbeda dalam indung telur ayam yang matang secara seksual dan belum matang. Metodologi 454 Biologi mengidentifikasi miRNA hati pada hari embrio 15, 18, dan 20, dan pasca-penetasan hari 0, 3, 7, dan 14 18 . Selain itu, 159 miRNA diketahui terdeteksi di Arbor Acres pra-adiposit (dengan pengurutan Solexa), beberapa di antaranya (mis. MiR-222, miR-30d, miR-26a, let7c, let7a, dan miR-30a-5p) sangat diungkapkan 19 . Sebaliknya, hanya 48 miRNA yang dikenal dalam jaringan adiposa ayam telah diidentifikasi dengan mengkloning 14, karena hanya kelimpahan tinggi dan miRNA yang diketahui telah diidentifikasi. MiRNA baru, serta miRNA yang rendah, belum terdeteksi, dan miRNA yang berpotensi penting bisa diabaikan. Sangat penting untuk mengidentifikasi miRNA sepenuhnya dalam lemak perut dengan pengurutan dalam, dan untuk membuat transkriptom dari jaringan adiposa perut ayam. Suatu analisis waktu terhadap ekspresi gen dalam lemak perut ayam jantan dari garis-garis lemak dan ramping selama perkembangan remaja (usia 1 hingga 11 minggu) telah dilakukan dengan menggunakan microarray Del-Mar 14K Chicken Integrated Systems 20 . Penelitian ini dilakukan untuk menggunakan analisis terintegrasi dari miRNAs yang diekspresikan secara diferensial (DEM) dan gen yang diekspresikan secara berbeda (DEG), yang belum pernah dilaporkan sebelumnya, untuk mendapatkan pandangan komprehensif untuk mengungkap fungsinya dalam metabolisme lipid dan jalur regulasi terkait.

Penelitian ini menggunakan betina F2 yang berasal dari persilangan antara breed lokal China yang tumbuh lambat (Beijing-You) dan garis broiler komersial yang tumbuh cepat (Cobb-Vantress). Kelompok burung dengan fenotipe AbFP dan AbFW yang ekstrim dipilih untuk menyelidiki profil ekspresi mRNA dan miRNA dengan sekuensing RNA dan sekuensing miRNA. Fokusnya di sini adalah pada analisis mendalam gen-gen kritis, miRNA, dan jalur menggunakan profil ekspresi miRNA dan mRNA terkait dengan deposisi lemak perut.

Hasil

profil ekspresi miRNA dan penyaringan miRNA yang diekspresikan secara berbeda

Ada total 6.526.815 dan 7.784.759 bacaan mentah di kisaran 16-32 nt di dua perpustakaan (HAbF dan LAbF), di mana 3.503.932 (53, 7% dari bacaan mentah) dan 1.637.052 (32, 5% dari bacaan mentah), masing-masing, dapat dipetakan dan dapat diselaraskan dengan miRNA unik. Distribusi ukuran bacaan tidak berbeda secara signifikan di kedua perpustakaan, dan mayoritas bacaan memiliki panjang 21-24 nt (Gambar S1).

Bacaan yang bisa dipetakan diselaraskan dengan prekursor dan sekuens matang yang dipilih dalam database miRBase dan selanjutnya dipetakan ke genom ayam. Seperti yang dijelaskan dalam Tabel 1, bacaan yang dapat dipetakan membentuk tiga kelompok: Kelompok 1, 2, dan 3. Pembacaan yang tidak dapat dipetakan terkait dengan Rfam / Repbase, basis data mRNA, dan genom ayam untuk memprediksi struktur jepit rambut miRNA novel (Grup 4) dan RNA lainnya ( misalnya, rRNA, tRNA, mRNA, dll.). Enam ratus lima urutan unik diidentifikasi berdasarkan urutan miRNA dewasa di miRBase (rilis 19.0), termasuk 230 miRNA ayam yang diketahui, dan 33 miRNA dipetakan ke genom ayam dalam kelompok 1b dan 2a. Delapan puluh tiga miRNA yang berpotensi baru diidentifikasi dan didefinisikan sebagai PC-3p atau PC-5p (Tabel S1).

Tabel ukuran penuh

Profil ekspresi miRNA dari kelompok HAbF dan LAbF dibandingkan, dan miRNAs (DEM) yang diekspresikan secara berbeda diidentifikasi ( P ≤ 0, 05 dengan uji eksak Fisher dan uji chi-square, dan perubahan lipat ≥1, 5 atau ≤0, 67) berdasarkan RPM ≥ 5 di salah satu dari dua kelompok. Dibandingkan dengan perpustakaan LAbF, 62 miRNA diekspresikan secara berbeda-beda (32 diregulasi ke atas dan 30 diregulasi ke bawah), sebagaimana dirinci dalam Tabel S2.

Menggunakan burung Beijing-You yang terdiri dari HAbF atau LAbF ekstrem, PCR waktu-nyata kuantitatif (qPCR) digunakan untuk memverifikasi 20 DEM yang diidentifikasi dengan pengurutan dalam. Sebelas di antaranya (miR-204, miR-19a-3p, miR-19b-3p, miR-30d, miR-26a, miR-122-5p, miR-103-3p, miR-27b-3p, miR-92- 3p, miR-142-3p, dan miR-17-5p) telah terlibat, secara langsung atau tidak langsung, dalam pengendapan lemak; 9 menunjukkan perubahan lipat tinggi (miR-3535, miR-144-3p, miR-30e-5p, miR-301b-3p, miR-215-5p, miR-200a-3p, miR-133a-3p, miR- 133c-3p, dan miR-146b-5p). Dengan pengecualian miR-204, miR-215-5p, miR-142-3p, dan miR-103-3p, terdapat konsistensi antara pengujian qPCR dan analisis pengurutan mendalam dalam hal arah regulasi dan signifikansi statistik ( Gambar 1). Dari catatan khusus, ada regulasi naik 12 kali lipat (lima kali lipat dalam urutan) miR-19b-3p, dan regulasi delapan kali lipat bawah (enam kali lipat dalam urutan dalam) miR-122-5p antara Ayam HAbF dan LAbF ( P <0, 05).

Image

profil ekspresi mRNA dan skrining gen yang diekspresikan secara diferensial

Isi mRNA yang dapat diidentifikasi dalam transkriptome adiposa dari kolam HAbF dan LAbF dari burung F2 dinilai dengan pengurutan dalam (untuk perincian kontrol kualitas, lihat Tabel S3 dan Gambar S2). Dari sekitar 5.790 transkrip yang terdeteksi, 430 gen yang diekspresikan berbeda (DEG) diidentifikasi ( P ≤ 0, 05, perubahan lipat ≥2 atau ≤0, 5) berdasarkan FPKM ≥ 10 di salah satu dari dua kelompok. Dari DEG, 303 diketahui gen ayam (189 diregulasi ke atas dan 114 diregulasi ke bawah dalam HAbF). 60 transkrip tambahan adalah gen yang tidak diketahui, dan 67 transkrip diidentifikasi sebagai transkrip novel (Tabel S4).

Temuan sequencing mendalam diverifikasi oleh qPCR independen RNA yang diisolasi dari burung dengan fenotipe AbF ekstrem. Ekspresi 10 gen ( CYP71A1 , APOA5 , APOA1 , PTGES , PRKAR2B , CTBP1 , SOCS3 , SCP2 , AKR1D1 , dan PLTP ) memiliki perubahan lipatan tinggi dengan pengurutan dalam dan / atau diketahui memiliki hubungan langsung atau tidak langsung dengan lemak perut. menunjukkan konsistensi antara pengujian qPCR dan analisis urutan dalam hal arah regulasi dan signifikansi statistik (Gbr. 2).

Image

Analisis terintegrasi DEM dan DEG

Seperti dijelaskan di atas, DEG diidentifikasi berdasarkan P ≤ 0, 05 dan nilai lipat ≥2, 0 atau ≤0, 5, sedangkan DEM dipilih menggunakan RPM ≥ 5 dan lipat-ubah ≥1, 5 atau ≤0, 67. Dalam penelitian ini, gen target miRNA diprediksi berdasarkan urutan ayam menggunakan TargetScan 21, 22, 23, 24 ( //www.targetscan.org ) dan miRanda (//cbio.mskcc.org/miRNA2003/ miranda.html) algoritma. Sebanyak 6.121 gen target untuk 62 DEM diidentifikasi. Di antaranya, 106 gen ditemukan menjadi DEG oleh analisis sekuensing mRNA dan ditetapkan sebagai "gen interseksi" (Tabel S5).

Dari 86 gen persimpangan yang terkait dengan 31 miRNA yang diatur naik, ekspresi 71 gen meningkat, sementara ekspresi 15 gen menurun pada burung HAbF dibandingkan dengan burung LAbF. Mayoritas (83/100) gen yang terkait dengan 31 miRNA yang diatur turun menunjukkan peningkatan kelimpahan pada unggas HAbF, tetapi transkrip dari 17 gen diatur ke bawah.

Analisis jalur dan GO untuk gen persimpangan

Istilah GO yang diperkaya secara signifikan berdasarkan pada persimpangan 106 termasuk organisasi fibril kolagen, jalur pensinyalan yang dimediasi-integrin, proses katabolik protein tergantung-ubiquitin, transpor protein intraseluler, transpor nukleopoplasma, morfogenesis sel, regulasi negatif jalur pensinyalan reseptor Wnt kanonik dan regulasi negatif dari proses biologis proliferasi sel (Gbr. 3). Jalur yang diperkaya secara signifikan (Tabel 2) termasuk metabolisme asam lemak, Biosintesis adhesi fokal asam lemak tak jenuh, peroksisom proliferator-activated receptor (PPAR) pensinyalan, peroxisome, dan interaksi reseptor ECM. Beberapa gen berperan dalam banyak jalur. Misalnya, asam lemak desaturase 2 ( FADS2) dan stearoyl-CoA desaturase ( SCD ) terlibat dalam biosintesis asam lemak tak jenuh, serta dalam metabolisme asam lemak dan pensinyalan PPAR, sementara peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase ( PECR ) dan anggota keluarga rantai panjang asil-CoA synthetase 1 ( ACSL1 ) berpartisipasi dalam biosintesis asam lemak tak jenuh, metabolisme asam lemak, peroksisom, dan jalur metabolisme.

Image

Gambar ukuran penuh

Tabel ukuran penuh

Perubahan dalam kelimpahan relatif 11 gen persimpangan (Tabel 3) yang terlibat dalam jalur metabolisme lipid yang diperkaya secara signifikan diperiksa secara independen oleh qPCR pada ayam dengan fenotipe HAbF dan LAbF. Dengan pengecualian caveolin 2 ( CAV2 ), 10 gen yang tersisa menunjukkan konsistensi antara tes qPCR dan analisis sequencing yang mendalam dalam hal arah regulasi dan signifikansi statistik (Gbr. 4).

Tabel ukuran penuh

Image

Pembangunan jaringan yang dimediasi miRNA-mRNA

Untuk lebih memahami fungsi gen persimpangan pada konten adiposa perut, perhatian khusus diberikan pada interaksi antara 11 gen persimpangan yang terlibat dalam jalur yang diperkaya secara signifikan dan 34 DEM yang sesuai (Tabel 4). Empat gen ini, ACSL1 , FADS2 , SCD , dan PECR , sangat menarik karena mereka memainkan peran dalam banyak jalur. Untuk lebih memvisualisasikan dan memahami interaksi antara mereka dan DEM yang sesuai, jaringan miRNA-mRNA dibangun (Gbr. 5).

Tabel ukuran penuh

Image

Merah menunjukkan regulasi naik dan hijau menunjukkan regulasi turun; putih menunjukkan jalur. FADS2 : asam lemak desaturase 2; SCD : desaturase stearoyl-CoA; PECR: peroxisomal trans-2-enoyl-CoA reductase; ACSL1 : anggota keluarga rantai panjang asil-CoA synthetase 1; gga: Gallus gallus ; xtr: Xenopus (Silurana) tropicalis .

Gambar ukuran penuh

Efek gga-miR-19b-3p pada proliferasi preadiposit dan diferensiasi adiposit

Untuk mengeksplorasi lebih lanjut signifikansi biologis dari gga-miR-19b-3p, kami mengamati efek dari ekspresi berlebih gga-miR-19b-3p terhadap proliferasi preadiposit dan diferensiasi adiposit pada ayam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, ekspresi gga-miR-19b-3p, dibandingkan dengan kontrol negatif, secara signifikan meningkat setelah transfeksi dengan mimik gga-miR-19b-3p ( p <0, 001). Ketika preadipocytes dikultur dengan mimik gga-miR-19b-3p 50 nm, jumlah sel meningkat dari 24 menjadi 72 jam dibandingkan dengan kontrol negatif. Pada 48 jam, efek mimik gga-miR-19b-3p signifikan ( p <0, 05, Gambar 7A). Diferensiasi adiposit meningkat secara signifikan pada 24, 48, dan 72 jam setelah transfeksi dengan 50 nM mimik gga-miR-19b-3p dibandingkan dengan kontrol negatif ( p <0, 01 atau p <0, 001, Gambar 7B). Hasil pewarnaan Minyak Merah menunjukkan bahwa tetesan lipid dalam sel yang diobati dengan 50 nM mimik gga-miR-19b-3p sedikit lebih besar dan lebih banyak daripada kontrol negatif (Gambar 7C).

Image

Image

( A ) jumlah preadiposit diidentifikasi menggunakan kit CCK-8 (n = 8), * P <0, 05 vs kelompok kontrol. ( B ) Diferensiasi adiposit diidentifikasi dengan pewarnaan Minyak Merah (n = 3), *** P <0, 01 dan *** P <0, 001 vs kontrol. ( C ) Perubahan morfologis dan deposisi lipid yang diinduksi oleh 50 nM mimik gga-19b-3p dalam preadiposit selama diferensiasi in vitro (mikroskop terbalik, 400 ×). tetesan lipid, diwarnai dengan Minyak Red O, terakumulasi karena semakin banyak lokula dalam sel yang terpapar 50 nM gga-19b-3p mimic bila dibandingkan dengan mereka yang tidak diobati dengan mimik gga-19b-3p.

ACSL1 adalah target endogen miR-19b-3p

Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5, ACSL1 diatur ke bawah, sedangkan gga-miR-19b-3p diatur ke atas, pada burung dengan AbF tinggi. Dari analisis menggunakan algoritma TargetScan dan miRanda, transkrip ACSL1 dapat menjadi target miR-19b-3p. Ini dieksplorasi melalui ko-transfeksi vektor reporter luciferase yang mengandung tipe liar atau mutan 3 ′ UTR dari ACSL1 (Gambar 8A) dan mimik miR-19b-3p, atau mimik kontrol negatif, dalam sel 293T. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8B, aktivitas luciferase dari reporter ACSL1 tipe liar yang ditransfeksi dengan mimik miR-19b-3p berkurang secara signifikan dibandingkan dengan yang ditransfeksi dengan mimik kontrol negatif atau pada reporter mutan yang ditransfeksi dengan meniru miR-19b-3p. Dibandingkan dengan kontrol negatif, tingkat mRNA ACSL1 menurun secara signifikan pada adiposit ayam pada 72 jam setelah transfeksi dengan mimik miR-19b-3p (Gambar 8C); karena antibodi anti-ACSL1 yang cocok untuk ayam kurang, perubahan tingkat protein ACSL1 tidak diukur. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa gga-miR-19b-3p mempercepat proliferasi preadiposit, serta diferensiasi adiposit, dengan menurunkan pengaturan ACSL1 .

Image

( A ) Urutan nukleotida dari situs pengikatan gga-miR-19b-3p tipe-liar dan bermutasi yang terletak di wilayah 3 ′ yang tidak diterjemahkan (UTR) dari ACSL1 . ( B ) Uji aktivitas Luciferase dari tipe liar (Wt) atau mutan (Mu) 3 ′ UTR dari ACSL1 menggunakan sistem reporter luciferase ganda dalam garis sel 293T setelah ko-transfeksi bersama dengan gga-19b-3p atau kontrol negatif (NC) ) meniru. Data berasal dari lima transfectants. ( C ) Perubahan dalam ekspresi mRNA ACSL1 setelah transfeksi mimik gga-miR-19b-3p (*** P <0, 001). Data berasal dari tranfectate rangkap tiga.

Gambar ukuran penuh

Diskusi

miRNA dan lemak perut pada ayam

Dalam penelitian ini, miRNA diidentifikasi dengan pengurutan dalam pada perpustakaan HAbF dan LAbF dari populasi sumber daya F2 yang mencakup semua 48 miRNA yang dikenal dalam jaringan adiposa perut ayam yang diidentifikasi dengan mengkloning 14 . Namun, banyak kandidat penting miRNA terkait dengan mekanisme lipid (misalnya, gga-miR-301b-3p, gga-miR-130b-3p, gga-miR-30a-5p, gga-miR-142, gga-miR-146b, gga -miR-103, gga -miR-26a, dll.) terlewatkan dengan kloning. Penelitian ini menunjukkan bahwa lebih banyak kandidat miRNA yang terkait dengan lemak perut diidentifikasi menggunakan teknologi pengurutan dalam.

Di antara miRNA yang dikuantifikasi di sini, miR-30d dan miR-26a diatur turun pada burung F2 dengan konten AbF yang lebih tinggi, dan hasil ini dikonfirmasi oleh qPCR pada burung dengan fenotipik ekstrem AbF. Pekerjaan sebelumnya menunjukkan bahwa miR-30d dan miR26a sangat diekspresikan dalam preadiposit ayam 19 dan bahwa miR-30d mempengaruhi transkripsi insulin 25 . Secara bersama-sama, temuan ini menunjukkan bahwa miR-30d dan miR-26a cenderung memainkan peran pengaturan penting dalam mekanisme lipid pada ayam.

Perubahan dalam empat DEM terkait lipid yang diidentifikasi dengan pengurutan dalam (gga-miR-122-5p, miR-103-3p, miR-27b-3p, dan miR-146b-5p) dikonfirmasi oleh qPCR. Sebagai contoh, regulasi regulasi gga-miR-122-5p yang luas (enam hingga delapan kali lipat) ditunjukkan oleh pengurutan dalam dan qPCR. Pada tikus, miR-122 terlibat dalam metabolisme kolesterol dan lipid, serta dalam replikasi virus hepatitis C 26, 27 . DEM miR-103 diatur ke atas, dan mengatur homeostasis glukosa dan sensitivitas insulin pada tikus obesitas 28 dan mengatur banyak gen penanda dan trigliserida dalam sel 3T3-L1 29 . DEM miR-27 memiliki peran penghambatan berkenaan dengan adipogenesis dalam sel 30 tikus dan adiposa yang diturunkan sel induk manusia (hMADS), dan ekspresi berlebih dari miR-27 secara spesifik menghambat pembentukan adiposit pada tikus 31 . miR-146b telah dikaitkan dengan diferensiasi sel 3T3-L1 29 . Meskipun karakterisasi fungsional rinci dari keempat miRNA dalam ayam AbF masih kurang, temuan ini, dikombinasikan dengan penelitian sebelumnya, menunjukkan bahwa miRNA ini mungkin memainkan peran kunci dalam pengaturan jaringan ini pada ayam.

Cluster miR17-92 terdiri dari tujuh miRNA (miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b, dan miR-92-1), dan telah ditunjukkan untuk mempercepat diferensiasi adiposit dengan mengatur secara negatif penekan-tumor Rb2 / p130 32 . Patut dicatat bahwa beberapa miRNA ini (gga-miR-17-5p, gga-miR-19a, gga-miR-19b dan gga-miR-20a) adalah DEMs di sini (perubahan lipat 1.85 menjadi 7.23) dan diregulasi ke atas di AbF dari burung dengan konten AbF tinggi. Dari jumlah tersebut, ada perbedaan yang mencolok (10 kali lebih besar pada burung dengan AbF tinggi) dalam ekspresi gga-miR-19b-3p, seperti yang dikuantifikasi oleh qPCR, dan fungsi miRNA ini di AbF sekarang sedang dipelajari lebih lanjut.

Gen titik-temu dan kandungan lemak perut

Studi ini mengidentifikasi 106 gen persimpangan, 11 di antaranya terlibat dalam jalur metabolisme lipid dan peran yang jelas dikenal untuk ACSL1 , FADS2 , ABCD3 dan SCD . Long-chain acyl CoA synthetase (ACSL) mengaktifkan pemecahan asam lemak rantai panjang menjadi thioester asil-CoA 33 . ACSL1 adalah isoform utama, dan gennya sangat diekspresikan dalam adiposa, hati, dan otot pada tikus 34, 35 . Selain itu, itu mempengaruhi lipolisis 36 dan tingkat oksidasi β 37 dalam adiposit 3T3-L1. FADS2 desaturase membatasi laju dalam sintesis asam lemak tak jenuh ganda rantai panjang (PUFA). Pada tikus hamil, perubahan progesteron dan estradiol dapat meningkatkan sintesis LC PUFA dengan meningkatkan ekspresi FADS2 38 dan regulasi epigenetik berkontribusi pada regulasi jangka pendek dan jangka panjang sintesis PUFA 39 ; single nucleotide polymorphisms (SNPs) FADS2 mempengaruhi kandungan asam lemak esensial dalam otot, serta berat badan, dalam populasi sumber daya F2 dari ayam Gushi yang dilintasi dengan ayam broiler Adak 40 . SCD mempengaruhi sintesis lipid, oksidasi lipid, termogenesis, dan sensitivitas insulin dalam hati, otot, dan jaringan adiposa pada tikus 41, dan mungkin memainkan peran potensial dalam kontrol berat badan dan energi homeostasis pada ayam 42 . ABCD3 berperan dalam oksidasi asam dikarboksilat, serta buffer asam lemak pada manusia 43, dan terlibat dalam regulasi transportasi asam lemak menjadi peroksisom pada tikus 44 .

Di antara gen persimpangan lainnya, laminin, alfa 2 ( LAMA2 ) dan alfa 11 integrin ( ITGA11 ) dan PECR , sementara dikenal dalam konteks lain 45, 46, tidak memiliki hubungan yang jelas dengan lemak.

Tidak ada penelitian sebelumnya yang mengaitkan ACSL1 , FADS2 dan ABCD3 dengan metabolisme lipid, khususnya pada ayam. Dengan alasan bahwa mereka menunjukkan ekspresi diferensial yang signifikan di sini, studi lebih lanjut dari gen-gen ini tampaknya diperlukan. Gen tambahan yang diidentifikasi di sini termasuk CHAD , AKT1 , dan LAMA2 . Jika atau bagaimana mereka memengaruhi metabolisme lipid atau akumulasi lemak tidak jelas; dengan demikian, gen-gen ini membutuhkan penelitian lebih lanjut pada ayam AbF.

Dalam penelitian ini, beberapa DEM yang relevan dengan 11 gen persimpangan mungkin merupakan kandidat kuat untuk mengatur AbF karena miR-133c-3p, miR-133a-3p, miR-200a-3p, dan miR-146b-5p ditunjukkan oleh independen qPCR diekspresikan secara berbeda pada unggas dengan konten AbF yang sangat tinggi dan sangat rendah. Beberapa DEM diidentifikasi dengan pengurutan dalam (miR-19a-3p, miR-19b-3p, miR-30d, miR-26a, miR-30a-5p, miR-122-5p, miR-103, miR-125b, dan miR-17-5p) diketahui mempengaruhi metabolisme lipid mamalia. Untuk menunjukkan penerapan pendekatan yang digunakan dalam penelitian ini, salah satu DEM, gga-miR-19b-3p, secara signifikan meningkatkan proliferasi preadiposit, serta diferensiasi adiposit, setelah transfeksi dengan 50 nM dari gga-miR-19b -3p meniru, dibandingkan dengan kontrol negatif. Selain itu, ini ditunjukkan di sini oleh uji reporter luciferase untuk dengan jelas mengatur ekspresi ACSL1 . Ketika adiposit diobati dengan mimik gga-miR-19b-3p 50 nm, ekspresi mRNA ACSL1 berkurang secara signifikan dibandingkan dengan kontrol negatif. Hasil ini menunjukkan bahwa gga-miR-19b-3p berkontribusi terhadap peningkatan akumulasi AbF dengan menurunkan pengaturan ACSL1 pada ayam. Hasil yang diperoleh di sini akan memandu studi fungsional dan komprehensif DEM dan gen persimpangan dalam mengatur jumlah AbF yang terakumulasi dalam ayam yang sedang tumbuh.

Kesimpulannya, perbedaan ditunjukkan dalam transkriptom dan miRNA dari AbF ayam dengan konten AbF tinggi dan rendah. Secara khusus, analisis terpadu DEM dan DEG menunjukkan bahwa sembilan miRNA (gga-miR-19a-3p, miR-19b-3p, miR-17-5p, miR-30d, miR-26a, miR-103-3p, miR- 27b-3p, miR-142-3p, dan miR-92-3p) dan tiga gen ( ACSL1 , FADS2 dan ABCD3 ) adalah kandidat kuat miRNA dan gen yang terlibat dalam mengatur akumulasi AbF pada ayam. MiRNA yang berpotensi baru (gga-miR-3535, miR-30e-5p, miR-301b-3p, miR-215-5p, miR-200a-3p, miR-133a-3p, miR-133c-3p, dan miR-146b -5p) dan gen ( LAMA2, RAP1B, PECR, AKT1, ITGALL dan CHAD ) yang terkait dengan jaringan adiposa perut juga diidentifikasi.

Bahan dan metode

Pernyataan etika

Metode penelitian ini dilakukan sesuai dengan Pedoman Hewan Eksperimental yang didirikan oleh Kementerian Sains dan Teknologi (Beijing, Cina). Semua protokol eksperimental disetujui oleh Departemen Penelitian Sains (yang bertanggung jawab atas kesejahteraan hewan) dari Institut Ilmu Hewan, Akademi Ilmu Pengetahuan Pertanian Cina (CAAS) (Beijing, Cina).

Hewan percobaan

Populasi sumber daya ayam CAAS F2 digunakan. Populasi, sudah dijelaskan secara rinci 47, berasal dari persilangan antara keturunan lokal Cina yang tumbuh lambat (Beijing-You) dan garis broiler komersial yang tumbuh cepat (Cobb-Vantress, Inc.).

Ayam-ayam dibesarkan di kandang tangga di bawah kondisi lingkungan dan gizi yang direkomendasikan di peternakan konservasi Institut Ilmu Hewan (IAS), CAAS.

Ayam ditimbang dan dibunuh dengan cara memukau dan dijauhkan pada usia 93 hari, 12 jam setelah pakan ditahan. Sampel jaringan lemak perut dibekukan dalam nitrogen cair, kemudian disimpan pada suhu -80 ° C. Selama diseksi, AbFW diukur dan AbFP, relatif terhadap berat isi yang dikeluarkan, dihitung. Berdasarkan nilai-nilai ini untuk 183 wanita, dua kelompok fenotipik, masing-masing terdiri dari enam burung dengan AbF tinggi (HAbF) atau AbF rendah (LAbF). Nilai ambang batas untuk kelompok HAbF adalah AbFW ≥ 66, 64 g dan AbFP ≥ 6, 49%, dan mereka untuk kelompok LAbF adalah AbFW ≤ 34, 50g dan AbFP ≤ 1, 84%, yang mewakili cara + standar deviasi (SD) untuk populasi yang diteliti. Data individu untuk dua kohort diberikan pada Tabel 5.

Tabel ukuran penuh

Ekstraksi RNA

RNA total diisolasi dari jaringan lemak perut menggunakan kit yang tersedia secara komersial sesuai dengan protokol pabrikan (DP419, Tiangen, Beijing, Cina), Trizol berasal dari Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Konsentrasi dan kemurnian RNA ditentukan oleh A 260 dan A 260: 280 (A 260: 280 ≥ 1, 8 dan ≤2.0) menggunakan spektrofotometer NanoDrop ND-1000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA). Integritas RNA (RIN ≥ 7 dan 28S / 18S ≥ 0, 7) dinilai pada sistem Agilent 2100 Bioanalyzer Lab-on-chip (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Sampel RNA disimpan pada suhu -80 ° C sampai digunakan.

Konstruksi dan pengurutan perpustakaan RNA kecil

Dua kumpulan RNA total yang sama, masing-masing dari enam ekor ayam (500 ng per sampel), dihasilkan dari burung HAbF dan LAbF (Tabel 5). Dua perpustakaan RNA kecil disiapkan sesuai dengan instruksi Illumina dan diurutkan (Illumina GAIIx, Illumina, San Diego, CA, USA). Bacaan sequencing mentah, diperoleh dengan perangkat lunak Illumina's Pipeline v1.5, disaring untuk mendapatkan urutan yang bisa dipetakan menggunakan ACGT101-4.2 (LC Sciences, Hangzhou, Cina) berdasarkan data mamalia di miRBase 19.0. Bacaan yang dimodifikasi per juta bacaan (RPM) digunakan untuk mengukur bacaan yang dinormalisasi.

sekuensing mRNA

Kelompok dari burung yang sama (4 μg / sampel) digunakan untuk sekuensing mRNA (Ilmu LC), dan data mentah diperoleh dengan menggunakan CASAVA v1.8 + (Illumina). Urutan diselaraskan dengan genom ayam menggunakan TopHat. Segmen urutan disambungkan, dijelaskan, dan ekspresi transkrip dihitung dengan manset. Fragmen per kilobase ekson per juta bacaan yang dipetakan (FPKM) digunakan untuk mengukur ekspresi gen dan database Ensemble digunakan sebagai referensi.

Analisis bioinformatik

Basis data ensemble ayam ( Gallus gallus ), targetScan, dan algoritma miRanda digunakan untuk memprediksi target potensial dari semua miRNA yang diekspresikan secara berbeda. Klasifikasi jalur dan GO dianalisis menggunakan Kobas2.0 (//kobas.cbi.pku.edu.cn/help.do) dan pengujian hipotesis. Jalur signifikan adalah persimpangan antara Kobas2.0 dan metode pengujian hipotesis. P ≤ 0, 05 dianggap signifikan. Persyaratan jalur dan GO dengan kurang dari tiga gen ayam yang diketahui dibuang. Jaringan interaksi miRNA-mRNA dibangun menggunakan perangkat lunak Cytoscape.

PCR real-time kuantitatif mRNA dan miRNA

Kelimpahan transkrip relatif dari 21 gen yang diatur secara berbeda, diidentifikasi dengan sekuensing mRNA, secara independen divalidasi menggunakan Quantifast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Düsseldorf, Jerman). Konsentrasi akhir setiap primer adalah 10 μmol / μL. Primer yang digunakan dijelaskan pada Tabel S6.

Untuk meningkatkan kekuatan tes ini, sampel AbF dari burung yang berbeda digunakan, lagi-lagi terdiri dari enam individu HAbF dan enam individu LAbF; mereka adalah ayam Beijing-You pada usia 93 hari, sebagaimana dijelaskan lebih lanjut dalam Tabel 6.

Tabel ukuran penuh

PCR waktu nyata kuantitatif paralel (qPCR) digunakan untuk mengukur miRNA yang relevan, juga menggunakan metodologi Qiagen (Kit RT RT miScript II dan Kit PCR miScript SYBR Green) dengan primer forward spesifik miRNA (Tabel S7 dan universal reverse disediakan ). U6 dipilih sebagai kontrol internal untuk mengoreksi variasi analitis. Konsentrasi masing-masing primer adalah 10 μmol / μL. Perbedaan antara kedua kelompok dianalisis menggunakan Student's t-test untuk sampel independen di SAS 8.0 untuk Windows (SAS Inst. Cary, NC, USA).

Konstruksi Vektor

3 ′ UTR ACSL1 yang mengandung situs pengikatan miR-19b-3p diamplifikasi dari DNA genom ayam oleh PCR dengan primer ditunjukkan pada Tabel S6. Produk PCR dikloning ke psiCHECK-2 (Promega, Madison, WI, USA) menggunakan situs pembatasan NotI dan XhoI. Vektor target mutan, yang memiliki substitusi 7 bp di situs yang mengikat (TTTGCAC → AAACGTG) diperoleh dari Perusahaan Ribo (Guangzhou, Cina).

Uji reporter Luciferase

Eksperimen reporter Luciferase dilakukan dalam sel 293T ginjal embrionik manusia. Sel-sel diunggulkan dalam 96-well plate pada kepadatan 5 × 10 4 sel / well dan dikultur dalam kondisi rutin dengan 10% serum bovine janin. Ketika sel mencapai pertemuan 60% hingga 70%, pmirGLO-3 ′ UTR (100 ng) ditransfusikan bersama dengan 50 nM dari kontrol negatif atau mimik gga-miR-19b-3p (keduanya dari Ribo) menggunakan 0, 25 μL dari FugeneHD (Promega) sesuai dengan instruksi pabrik. Aktivitas luciferase relatif diukur 48 jam setelah transfeksi oleh Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega).

Uji proliferasi dan diferensiasi sel

Preadiposit yang diisolasi dari jaringan adiposa perut dari ayam Beijing-You betina berumur 2 hingga 4 minggu, mengikuti metode yang dipublikasikan 48, 49, diunggulkan dalam enam lubang sumur. Setelah sel mencapai pertemuan 70%, diferensiasi diinduksi dengan MDI (IBMX, 0, 5 mmol / L, DEX, 1 μmol / L, dan insulin, 1 mg / L). Setelah 24 jam, sel-sel ditransfeksi dengan mimik gga-miR-19b-3p (50 nM) atau kontrol negatif (50 nM) menggunakan 6 μL FugeneHD. Selanjutnya, sel difiksasi dengan formaldehida 10% pada 24, 48, dan 72 jam, dicuci dengan saline fosfat-buffered (PBS), diwarnai dengan Oil Red O (0, 3% dalam 60% isopropanol), diikuti oleh pencucian yang luas, dan pewarnaan tetesan trigliserida divisualisasikan dan difoto. Transfeksi dilakukan dalam rangkap tiga. Sel-sel dari kelompok yang sama dalam lempeng enam sumur ditransfeksi dengan mimik gga-miR-19b-3p dipanen dan total RNA diekstraksi untuk mengidentifikasi ekspresi diferensial mRNA ACSL1. Efek dari overekspresi gga-miR-19b-3p pada proliferasi preadipocy dinilai menggunakan Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Teknologi Molekul Dojindo, Kumamoto, Jepang) pada 24, 48, dan 72 jam.

informasi tambahan

Cara mengutip artikel ini : Huang, HY et al. Analisis terpadu profil ekspresi microRNA dan mRNA di jaringan adiposa perut pada ayam. Sci. Rep. 5, 16132; doi: 10.1038 / srep16132 (2015).

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Informasi tambahan

File Excel

  1. 1.

    Tabel Tambahan S1

  2. 2.

    Tabel Tambahan S2

  3. 3.

    Tabel Tambahan S4

  4. 4.

    Tabel Tambahan S5

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.