Pemodelan matematika plastisitas fenotipik dan konversi ke keadaan sel induk di bawah hipoksia | laporan ilmiah

Pemodelan matematika plastisitas fenotipik dan konversi ke keadaan sel induk di bawah hipoksia | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Matematika Terapan
  • Heterogenitas tumor

Abstrak

Hipoksia, atau kekurangan oksigen, diketahui berhubungan dengan perkembangan tumor payudara, resistensi terhadap terapi konvensional dan prognosis klinis yang buruk. Transisi epithelial-mesenchymal (EMT) adalah proses yang menganugerahkan kemampuan invasif dan migrasi serta sifat sel punca ke sel karsinoma sehingga mendorong perkembangan metastasis. Dalam karya ini, kami menguji dampak hipoksia pada sifat-sifat terkait sel batang kanker (CSC) EMT, dengan membiakkan sel epitel susu manusia yang telah ditransformasikan di bawah kondisi normoksik dan hipoksia, dan menerapkan pemodelan matematis silico untuk mensimulasikan dampak hipoksia pada akuisisi. atribut CSC dan transisi antara keadaan dibedakan dan seperti batang. Hasil kami menunjukkan bahwa baik heterogenitas dan plastisitas populasi sel yang ditransformasi ditingkatkan oleh paparan hipoksia, yang menghasilkan pergeseran ke arah populasi yang lebih mirip batang dengan peningkatan fitur EMT. Temuan kami semakin diperkuat oleh analisis ekspresi gen yang menunjukkan upregulasi gen terkait EMT, serta gen yang terkait dengan resistensi terapi, dalam sel hipoksia dibandingkan dengan rekan normoksik. Sebagai kesimpulan, kami menunjukkan bahwa pemodelan matematika dapat digunakan untuk mensimulasikan peran hipoksia sebagai kontributor utama plastisitas dan heterogenitas sel epitel mamaria manusia yang telah berubah.

pengantar

Lingkungan mikro tumor telah lama dikenal sebagai faktor kunci pendorong pertumbuhan tumor dan metastasis yang menopang perkembangan kanker payudara 1 . Lingkungan mikro tumor adalah entitas yang dinamis, kompleks dan terus berkembang yang membentuk stroma yang mengelilingi tumor, dan terdiri dari beberapa jenis sel (fibroblas, sel mioepitel, sel endotel, berbagai jenis sel imun infiltrasi) serta matriks ekstraseluler, inflamasi sitokin, faktor pertumbuhan dan tekanan lingkungan. Memang, lingkungan mikro di tepi invasif tumor berbeda secara dramatis dari inti tumor.

Fitur utama dari lingkungan mikro tumor adalah adanya hipoksia 2, yang dihasilkan dari ketidakseimbangan antara pasokan dan permintaan oksigen, yang mengarah pada kekurangan oksigen lokal di beberapa daerah tumor. Secara khusus, dalam tumor padat, hipoksia muncul karena pasokan oksigen yang tidak memadai sehubungan dengan tingginya tingkat proliferasi sel yang dikombinasikan dengan pasokan vaskular yang tidak efisien dan tidak efektif 3 . Sebagian besar tumor - lebih besar dari 1 mm 3 - mengandung daerah hipoksia sebagai akibat dari meningkatnya jarak difusi oksigen dan pembuluh darah tumor yang tidak teratur dan tidak memadai, menambah tekanan biokimiawi dan metabolisme pada sel tumor 3 . Secara keseluruhan, hipoksia cenderung dikaitkan dengan inti tumor, sedangkan oksigen lebih bebas tersedia di tepi pinggiran / invasif.

Hipoksia berdampak pada pertumbuhan tumor dalam berbagai hal, misalnya dengan merangsang rekrutmen tipe sel inflamasi dan sel endotel, meningkatkan angiogenesis, meningkatkan penekanan kekebalan tubuh, memperburuk peradangan dan mendukung pemrograman ulang metabolik 4 . Selain itu, kondisi hipoksia berfungsi untuk memberikan tekanan selektif untuk kelangsungan hidup preferensi sel-sel tumor seperti batang tangguh yang mempromosikan penyebaran metastasis 2, 4 . Dalam hal ini, hipoksia telah terlibat dalam induksi suatu proses, yang dikenal sebagai transisi epitel-mesenkimal (EMT), yang telah terbukti memberikan kemampuan migrasi dan invasif intrinsik serta sifat sel punca ke sel-sel karsinoma, sehingga meningkatkan mereka. potensi metastasis 2, 5, 6 . Setelah menjalani EMT, sel-sel epitel biasanya memperoleh morfologi mesenchymal kurang terdiferensiasi ditandai dengan hilangnya penanda epitel E-cadherin dan polaritas apico-basal, ekspresi gen mesenchymal, akuisisi peningkatan migrasi intrinsik dan kemampuan invasif, dan tingkat proliferasi berkurang. Gambaran ini adalah faktor prognostik yang relevan secara klinis, dan telah terbukti berkorelasi dengan peningkatan metastasis dan resistensi obat 7, 8 .

Banyak bukti menunjukkan bahwa lingkungan mikro tumor memainkan peran kunci dalam induksi EMT, seperti yang diulas dalam Talbot et al . 9 . Sehubungan dengan hipoksia secara khusus, diketahui bahwa hipoksia mendorong serangkaian perubahan ekspresi gen (mempengaruhi sekitar 1-1, 5% genom), dimediasi oleh stabilisasi faktor transkripsi yang diinduksi hipoksia HIF-1α 10 . Lebih lanjut memperkuat hubungan antara hipoksia dan EMT, sejumlah besar gen, diatur oleh hipoksia dan HIF-1α, juga terlibat dalam metastasis 11 . Lebih lanjut, faktor transkripsi penekan E-cadherin TWIST diatur secara positif oleh HIF-1α 12 . Selain itu, pensinyalan Notch meningkatkan EMT, dalam kondisi hipoksia, melalui aktivasi faktor transkripsi SNAIL 13 . Dalam percobaan ini, populasi sel tumor terpapar pada kondisi hipoksia dan diprofilkan untuk perubahan sifat terkait EMT. Dalam 72 jam setelah paparan sel-sel karsinoma epitel terhadap hipoksia, sel-sel tersebut telah mengalami perubahan morfologis yang mendalam menjadi fenotipe fibroblastoid, konsisten dengan terjadinya EMT, dan menunjukkan ciri-ciri EMT termasuk ekspresi SNAIL, ekspresi SNAIL, β-catenin nuklir localization, downregulation E-cadherin, dan peningkatan potensi migrasi dan invasifitas 14 .

Hipotesis sel induk kanker (CSC) mendalilkan keberadaan subpopulasi sel kanker dengan kapasitas tinggi untuk pembaruan diri dan kemampuan untuk meregenerasi heterogenitas tumor orangtua, dibandingkan dengan rekan non-CSC yang dibedakan 15 . Sebaliknya, penelitian terbaru menunjukkan bahwa plastisitas juga merupakan properti intrinsik dari sel-sel kanker yang berbeda, di mana CD44 dari CD24 hi non-CSCs dapat secara spontan berdiferensiasi menjadi CD44 hi CD24 dari CSC dalam kondisi tertentu 16, 17 . Memang, telah dihipotesiskan bahwa interkonversi dinamis antara non-CSC dan CSC secara signifikan dapat meningkatkan potensi tumorigenik dan metastasis kanker payudara manusia 17 . Pertumbuhan metastasis dihipotesiskan membutuhkan keberadaan setidaknya satu CSC 2 yang telah mencapai lokasi yang jauh berdasarkan sifat EMT / mesenkimalnya. Namun, lesi metastasis biasanya menampilkan morfologi epitel yang mirip dengan tumor primer. Paradoks yang jelas ini dapat dijelaskan oleh sifat transien EMT dan adanya proses sebaliknya, disebut transisi mesenchymal-epithelial (MET), yang diaktifkan oleh sinyal yang berasal dari lingkungan mikro dari lokasi yang jauh. MET mengembalikan kapasitas proliferasi sel-sel tumor, yang disimpan di tempat yang jauh, sehingga mendorong perkembangan lesi mikro-metastasis 18, 19, 20, 21 . Interkonversi EMT / MET yang dinamis ini semakin menegaskan pentingnya plastisitas seluler dalam perkembangan tumor.

Dediferensiasi sel yang berdiferensiasi telah dilaporkan terjadi pada daerah hipoksia pada frekuensi yang lebih tinggi dibandingkan dengan daerah normoksik dalam tumor yang sama 2 . Secara eksperimental, itu juga telah menunjukkan bahwa kondisi hipoksik mendorong dedifferensiasi pada karsinoma payudara duktal in situ (ditandai dengan peningkatan rasio nukleoplasma, kehilangan polaritas, penurunan regulasi ERα dan peningkatan regulasi penanda sel batang payudara epitel CK19), menunjukkan akuisisi Atribut seluler yang mengingatkan pada keadaan “seperti batang” 22 . Konsisten dengan pengamatan ini, telah dilaporkan bahwa fraksi sel yang sangat tumourigenik lebih disukai terletak di dalam daerah hipoksik neuroblastoma 23 . Lebih lanjut, upregulasi penanda permukaan sel CSC CD133 juga telah dilaporkan di daerah hipoksia medulloblastomas 24 .

Kami baru-baru ini mengidentifikasi ganglioside GD2, permukaan glikosphingolipid sel, sebagai penanda CSC payudara 25 . Kami juga menunjukkan bahwa sel-sel GD2 (+) mengekspresikan penanda mesenchymal dan menunjukkan peningkatan efisiensi pembentukan mamosfer dan kapasitas pemicu tumor, relatif terhadap rekan-rekan GD2 (-). Selain itu, sel GD2 (+) tumpang tindih dengan subpopulasi CD44 hi / CD24, yang dikenal diperkaya untuk CSC payudara 25 . Juga, GD3S - enzim yang mengkatalisis pembentukan GD3, prekursor langsung GD2 - sangat penting untuk menghasilkan CSC melalui EMT 26 . Temuan ini semakin memperkuat hubungan antara akuisisi atribut CSC dan terjadinya EMT.

Perkembangan heterogenitas fenotipik dan fungsional, diamati di dalam tumor, diperkirakan didorong oleh tekanan seleksi yang dipaksakan oleh kondisi lingkungan mikro yang terus berubah. Secara eksperimental, telah diamati bahwa peristiwa yang bertanggung jawab untuk memicu perubahan fenotipik ini adalah mereka yang membutuhkan adaptasi metabolik yang signifikan bagi sel untuk bertahan hidup, seperti hipoksia dan stres oksidatif. Seperti disinggung sebelumnya, telah dihipotesiskan bahwa hipoksia menginduksi fenotip sel induk dalam sel kanker non-batang 29 . Juga telah diperlihatkan bahwa paparan hipoksia yang berkepanjangan dapat mengakibatkan perubahan fenotipik dalam populasi non-batang menuju populasi yang diperkaya untuk sel kanker dengan sifat yang lebih agresif, dalam hal kemampuan pembaruan diri dan fitur EMT, pada dasarnya "pemrograman ulang" sel-sel non-batang menjadi keadaan seperti batang 6 .

Implikasi klinis hipoksia untuk terapi kanker juga sangat penting, paling jelas dalam konteks radiasi dan kemoterapi. Telah ditetapkan bahwa resistensi terhadap radiasi diberikan oleh hipoksia, dan mekanisme dimana hal ini dicapai dipahami dengan baik 30 . Dengan demikian, radioresistensi muncul di daerah hipoksia karena radikal bebas yang diturunkan oksigen relatif lebih sedikit, yang dihasilkan oleh radiasi pengion, yang kompromi efek sitotoksik dari radioterapi. Dalam kasus kemoterapi, hipoksia juga telah terbukti menimbulkan penurunan keseluruhan kemanjuran agen kemoterapi di vivo 3, tetapi mekanisme yang mendasarinya kurang dipahami.

Dalam karya ini, kami mempelajari efek hipoksia pada sel-sel epitel manusia (HMLER) transformasi-manusia melalui percobaan in vitro dan dalam pemodelan matematika silico . Efek hipoksia dianalisis melalui lima metode in vitro primer, termasuk morfologi sel, ekspresi gen yang berhubungan dengan metabolisme dan EMT, fraksinasi CSC yang dimediasi GD2, pertumbuhan sel, dan pengujian mamosfer sebagai indikator pembaruan diri / plastisitas CSC. Kami juga menunjukkan bahwa hasil eksperimen dapat diprediksi secara teoritis melalui pemodelan matematika berbasis persamaan diferensial biasa dan simulasi stokastik.

Metode

Analisis statistik tandatangan ekspresi gen tumpang tindih

Metode yang digunakan dalam pekerjaan ini untuk analisis tanda tangan ekspresi gen yang diperoleh adalah seperti yang dijelaskan dalam Zarkoob et al . 31 . Tanda tangan gen diperoleh dengan membandingkan intensitas sinyal normal yang diamati, untuk setiap probe yang diuji pada microarray, dengan intensitas sinyal normal yang diamati dari populasi sel normal. Probe, yang menunjukkan sinyal dua atau lebih kali lebih tinggi dari populasi sel normal, diambil sebagai tanda gen yang diregulasi untuk populasi sel tersebut. Demikian juga, untuk probe tersebut, yang menunjukkan sinyal dua kali atau lebih rendah dari populasi sel normal, diambil sebagai tanda tangan dari gen yang diturunkan regulasi. Dalam menentukan signifikansi statistik apakah dua set tanda tangan probe tumpang tindih, daftar pertama kali dibandingkan melalui matriks kebingungan, yang menunjukkan tingkat tumpang tindih antara daftar, dan pelengkap daftar (yaitu semua probe yang diukur, tetapi secara eksklusif dalam satu daftar atau yang lain, atau tidak keduanya). Dari matriks kebingungan ini, oleh Fisher Two-Sided Exact Test, nilai-p untuk tingkat signifikansi statistik dari tumpang tindih ditentukan.

Pemodelan matematika

Kami menerapkan model dua kompartemen (Gbr. 1), yang terdiri dari dua subpopulasi seluler yang berbeda secara fenotip dari sel biomarker-positif dan negatif - yaitu CSC dan non-CSC - masing-masing dengan kemampuan untuk mereplikasi diri, mati, dan kemampuan. untuk transisi ke fenotipe lainnya. Penjelasan singkat tentang parameter model disajikan pada Gambar. 1. Rincian model matematika disajikan dalam Informasi Tambahan. Perilaku deterministik untuk masing-masing subpopulasi dimodelkan menggunakan sistem persamaan diferensial biasa, dan perilaku stokastik dijelaskan oleh persamaan Master yang sesuai. Persamaan diselesaikan secara numerik, dan simulasi stokastik dilakukan menggunakan algoritma Gillespie yang terkenal 32 . Parameter model diestimasi menggunakan data eksperimental untuk fraksi CSC (GD2 +) dan efisiensi pembentukan mamosfer di kedua kondisi normoksik dan hipoksia.

Image

Merah menunjukkan sel-sel mirip CSC, dan biru menunjukkan sel-sel non-CSC. Sel-sel ini dapat bertransisi antara kedua tipe, baik tipe yang dapat mereplikasi diri sendiri, atau mungkin gagal untuk mereplikasi / menjalani apoptosis (gambar hitam). Parameter, yang menggambarkan masing-masing tingkat transisi urutan pertama ini, seperti yang ditunjukkan pada gambar.

Gambar ukuran penuh

Parameter cocok menggunakan pencarian brute-force komputasi melalui ruang parameter atas semua kombinasi parameter yang mungkin, dalam ruang jaringan tetap. Set parameter yang memberikan solusi terdekat dengan model dalam toleransi yang diberikan diambil sebagai set parameter mungkin. Parameter tersebut, disajikan dalam karya ini, mewakili rata-rata dari parameter yang diberikan atas semua set tersebut. Untuk kelengkapan, kami juga menyajikan standar deviasi dari nilai-nilai ini di atas ruang solusi yang ditentukan. Model ini dapat cocok dengan data eksperimental, dan menangkap pertumbuhan sel kanker pada batas jumlah sel rendah dan tinggi serta dinamika pertumbuhan sel.

Implementasi stokastik dari model matematika, menggunakan reaksi seluler yang dijelaskan pada Gambar. 1 (yaitu model dua kompartemen), disimulasikan melalui algoritma Gillespie. Menggunakan ini dengan kondisi awal sel biomarker negatif, model disimulasikan lebih dari 100 berjalan. Untuk masing-masing lintasan ini, jika jumlah total sel pada waktu akhir simulasi melebihi 20, lintasan dianggap positif untuk mamosfer. Proporsi total mammosphere yang terbentuk dengan cara ini mewakili laju pembentukan mammosphere in silico , sebagaimana disimulasikan oleh model stokastik.

Budaya sel

Sel-sel HMLER ditanam seperti yang dijelaskan sebelumnya 5 dan dalam kondisi hipoksia (1% O 2 ; 5% CO 2 ) menggunakan ruang hipoksia (milik laboratorium Gordon Mills, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA). Pembentukan mammosphere diuji dengan menaburkan 3000 sel (per sumur) dari 96-well plate attachment ultra-rendah (Costar) dalam media pembentukan mammosphere 33 . Media segar ditambahkan setiap dua hari. Mammospheres, lebih besar dari 60 mikrometer, dihitung setelah 10 hari kultur. Penyortiran sel FACS, menurut ekspresi GD2, dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya 25 .

Microarray

Tiga ratus nanogram Total RNA diamplifikasi dan dimurnikan menggunakan Kit Amplifikasi RNA Illumina TotalPrep (Ambion, Cat # IL1791) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, untai pertama cDNA disintesis dengan menginkubasi RNA dengan T7 oligo (dT) primer dan membalikkan campuran transcriptase pada 42 ° C selama 2 jam. Campuran induk RNase H dan DNA polimerase segera ditambahkan ke campuran reaksi setelah transkripsi terbalik, dan diinkubasi selama 2 jam pada 16 ° C untuk mensintesis cDNA untai kedua. RNA, primer, enzim dan garam yang akan menghambat transkripsi in vitro dikeluarkan melalui kartrid filter cDNA (bagian dari kit amplifikasi). Transkripsi in vitro dilakukan dan cRNA yang terbiotinilasi disintesis dengan amplifikasi 14 jam dengan campuran dNTP yang mengandung biotin-dUTP dan T7 RNA polimerase. Amplifikasi cRNA selanjutnya dimurnikan dan konsentrasi diukur dengan NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, DE). Sebuah alikuot dari 750 nanogram produk yang diamplifikasi dimasukkan ke dalam array Illumina Sentrix Beadchip hum HT-12.v4, hibridisasi pada 58 ° C dalam Oven Hibridisasi Illumina (Illumina, Cat # 198361) selama 17 jam, dicuci dan diinkubasi dengan streptavidin- Cy3 untuk mendeteksi cRNA berlabel biotin pada array. Array dikeringkan dan dipindai dengan BeadArray Reader (Illumina, CA). Data dianalisis menggunakan perangkat lunak GenomeStudio (Illumina, CA). Clustering dan analisis jalur dilakukan dengan GenomeStudio dan Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, Inc.) masing-masing.

Hasil

Untuk mengetahui perubahan yang diinduksi hipoksia dalam ekspresi gen terkait-EMT dan sifat-sifat CSC, kami membiakkan sel epitel mamaria manusia manusia yang telah diabadikan yang diubah-ubah (HMLER) di bawah normoksik (20% O2, 5% CO 2 ) (selanjutnya disebut HR-N ) atau kondisi hipoksia (1% O 2, 5% CO 2 ). Awalnya, kami berusaha untuk menetapkan rentang waktu perubahan morfologi dan ekspresi gen, terkait dengan induksi EMT setelah paparan hipoksia. Sementara kami berharap untuk mengamati transisi cepat ke fenotipe mesenkim dalam 24 jam 12, kami mengamati bahwa paparan hipoksia hingga enam hari (selanjutnya disebut HR-H6) tidak cukup untuk mengubah pola pertumbuhan epitel 'seperti batu bulat' seperti batu bulat. dari sel HMLER bulat ke morfologi memanjang, berbentuk spindel yang terkait dengan sel mesenkimal dan sel yang telah mengalami EMT. Agak luar biasa, tambahan 2 hari kultur dalam kondisi hipoksia - yaitu setelah total 8 hari terpapar hipoksia (selanjutnya disebut HR-H8) - cukup untuk mempromosikan perolehan morfologi seluler yang memanjang, seperti gelendong (Gbr. 2A), konsisten dengan konversi fenotipik sel HMLER epitel ke rekan mesenkimal melalui proses EMT. Menariknya, analisis profil ekspresi gen sel HMLER pada titik waktu yang berbeda ini, setelah paparan hipoksia (HR-H6 dan HR-H8), menguatkan perbedaan mendalam yang terlihat dalam morfologi sel antara 2 titik waktu ini (HR-H6 vs Hr-H8) ). Sementara 6 hari paparan hipoksia (HR-H6) cukup untuk memperoleh ekspresi dari gen yang diinduksi hipoksia miR-210, VEGF, GLUT1, dan PGK1 34, 35, ekspresi gen terkait EMT yang diketahui FOXC2, SNAI1 dan WNT5A 36 tidak diinduksi sampai hari 8 timepoint (HR-H8; Gbr. 2B). Khususnya, tingkat pertumbuhan sel sel HMLER, dikultur di bawah kondisi hipoksia, juga sangat berbeda antara 6 dan 8 hari paparan hipoksia. Meskipun tumpang tindih awal dalam tingkat pertumbuhan sel antara kondisi normoksik dan hipoksia (hari 0-4), pada hari ke 6 (HR-H6) tingkat pertumbuhan ditekan dibandingkan dengan rekan normoksik (HR-N), dan pada hari ke 8 (HR) -H8), ada penurunan jumlah total sel yang nyata. Berdasarkan temuan ini, kami memilih untuk menyelidiki seberapa lama paparan sel HMLER pada kondisi pertumbuhan hipoksia mengubah sifat EMT dan CSC dan, khususnya, kami bertujuan untuk memahami perbedaan antara sel HMLER yang terpapar hipoksia selama 6 hari (HR-H6) dan 8 hari (HR-H8).

Image

( a ) Gambar representatif sel HMLER yang tumbuh dalam kondisi normoksik atau dalam kondisi hipoksik (1% O 2 ) selama 6 atau 8 hari. ( B ) RT-PCR untuk gen yang ditunjukkan dilakukan dengan menggunakan RNA diekstraksi dari sel HMLER yang terpapar dengan kondisi yang ditunjukkan. Ekspresi gen diukur relatif terhadap GAPDH dan dinormalisasi menjadi normoksia. ( c ) Laju pertumbuhan sel HMLER dipantau dengan menghitung sel hidup, berdasarkan pengecualian tripan biru, pada titik waktu yang ditunjukkan selama paparan normoksia atau hipoksia. Pada 8 hari, sel yang diobati dengan hipoksia dipindahkan ke kondisi normoksik.

Gambar ukuran penuh

Ekspresi gen global yang diinduksi hipoksia

Untuk menilai dampak paparan hipoksik pada ekspresi gen global, kami mengekstraksi RNA dan melakukan analisis ekspresi gen microarray. Selain sel HR-N, HR-H6 dan HR-H8, kami juga mengukur ekspresi gen dari sel HMLER yang ditransduksi dengan vektor ekspresi SNAI1 yang mengkodekan siput aktivator EMT (HR-SN). Uji eksak dua sisi Fisher dilakukan pada tanda tangan gen untuk menentukan tingkat signifikansi statistik dari gen yang tumpang tindih hadir dalam beberapa tanda tangan, seperti yang dijelaskan dalam Zarkoob et al . (2013) dan bagian Metode. Khususnya, sejumlah perbandingan memang menunjukkan signifikansi statistik. Seperti yang diharapkan, ditunjukkan bahwa gen yang diregulasi dalam HR-H6 dan HR-H8 menunjukkan tumpang tindih yang signifikan secara statistik, dan jauh lebih signifikan daripada yang bisa disebabkan oleh kebetulan saja (Gambar 3A).

Image

( a ) Ingenuity Pathway Analisis hasil microarray yang membandingkan sel-sel yang diberi perlakuan normoksia dan hipoksia menunjukkan pengayaan signifikan untuk kategori biologis sel yang terkait dengan EMT (pergerakan sel dan morfologi sel) atau dengan proliferasi (pertumbuhan dan proliferasi sel dan siklus sel). ( B - D ) Analisis GSEA dari hasil microarray yang membandingkan sel-sel yang diberi perlakuan normoksia dan hipoksia dilakukan menggunakan set jalur kanonikal curated c2cp. Hasilnya menunjukkan pengayaan yang signifikan untuk ekspresi lebih tinggi dari gen target HIF1α yang diketahui dalam sel yang diobati dengan hipoksia (ditunjukkan oleh kepadatan garis vertikal hitam yang lebih besar di sisi kanan grafik). ( B ), ekspresi yang lebih tinggi dari gen terkait glikolisis dalam sel yang diobati hipoksia (ditunjukkan serupa) ( c ), dan ekspresi yang lebih rendah dari gen transpor elektron pernapasan dalam sel yang diobati hipoksia (ditunjukkan oleh kepadatan garis hitam hitam yang lebih besar di sebelah kiri). sisi grafik) ( d ), dibandingkan dengan rekan normoxic. ( e ) Grafik yang menggambarkan perubahan lipatan dalam ekspresi gen, sebagaimana dicatat oleh analisis microarray untuk probe yang ditunjukkan, membandingkan sel-sel HMLER yang tumbuh di bawah kondisi normoksik dan di bawah kondisi hipoksia setelah 6 hari, serta sel-sel HR-SN yang mengekspresikan penginduksi EMT faktor transkripsi Siput, * p <0, 05, ** p <0, 01, *** p <0, 001, **** p <0, 0001.

Gambar ukuran penuh

Sejalan dengan temuan kami di atas, di mana sel-sel HR-H6 tidak mengekspresikan gen yang terkait EMT, tingkat tumpang tindih antara tanda tangan gen yang diregulasi untuk HR-H6 dan HR-SN tidak memenuhi kriteria untuk signifikansi statistik. Namun, perbandingan analog antara HR-H8 dan sel HR-SN memang signifikan secara statistik (p <0, 05, Two-Sided Fisher Exact Test), menunjukkan bahwa ada tingkat kesamaan yang lebih besar antara tanda tangan gen yang diregulasi dari sel HR-H8. dan sel HR-SN yang tidak terlihat pada titik waktu sebelumnya (HR-H6). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa gen diregulasi selama respon hipoksik sel HMLER, pada 6 hari pasca-hipoksia induksi (HR-H6), pada kenyataannya, berbeda dari gen yang mendukung fenotip mesenchymal yang terbentuk dari sel-sel HR-SN . Mengingat bahwa gen yang diregulasi dari sel-sel HR-H8 menunjukkan tumpang tindih yang signifikan dengan sel-sel HR-SN, ini, pada gilirannya, menunjukkan bahwa proses dinamis dari EMT yang diinduksi hipoksia terungkap antara hari 6 dan 8 paparan pasca-hipoksia dalam model HMLER . Selain itu, data kami menunjukkan bahwa respons hipoksia per se dimulai sebelum hari ke 6 dan mendahului aktivasi program EMT dan penetapan keunggulan EMT. Selain itu, perlu dicatat bahwa ketika membandingkan tanda tangan gen untuk gen downregulated antara HR-H6 dan HR-SN dan juga antara HR-H8 dan HR-SN, kedua perbandingan secara statistik signifikan (Gambar 3A).

Dari catatan, efek lain dari hipoksia pada ekspresi gen, diamati dalam model ini, mewakili perbedaan gen yang diketahui terkait dengan respons terapeutik. Memang, diketahui bahwa faktor-faktor lingkungan mikro mempengaruhi kemanjuran rejimen terapi konvensional, dan bahwa sel-sel yang telah menjalani EMT dan CSC resisten terhadap terapi standar seperti radiasi dan kemoterapi. Downregulasi gen BRCA1 (kanker payudara 1, onset dini - ekson 4, varian transkripsi 1b, delta 11b, delta 14-17) telah terbukti berkorelasi dengan ketidakpekaan terhadap agen kemoterapi, doxorubicin 37 . Seperti ditunjukkan dalam Tabel Tambahan S1, ekspresi BRCA1 diturunkan regulasi setelah terpapar hipoksia dan EMT yang diinduksi oleh siput. Selain itu, kami mencatat upregulasi Twist1, dalam HR-H8 dan sel HR-SN dibandingkan dengan sel HR-N, yang telah terbukti meningkatkan resistensi terhadap obat antikanker yang mengganggu mikrotubulus, seperti taxanes 38 . Selain itu, dalam semua populasi sel hipoksia, kami mengamati peningkatan kadar MUC1 (Mucin 1), sebuah gen yang mengkode oncoprotein yang secara berlebihan diekspresikan dalam karsinoma payudara manusia dan menghambat kematian sel yang diinduksi radiasi dan hipoksia 39, 40 . Baumann et al . 41 telah menunjukkan bahwa penghambatan varian EGFR dapat berkorelasi dengan radioresisten, dan, oleh karena itu, kami mengamati downregulasi varian EGFR dalam sel hipoksia setelah 8 hari. Perubahan lipatan dalam ekspresi masing-masing gen yang disebutkan di atas (relatif terhadap sel HR-N) disajikan dalam Informasi Tambahan (Tabel Tambahan S1). Secara bersama-sama, perubahan gen ini menunjukkan potensi molekul di mana radioresisten dan chemoresistance dapat terjadi pada populasi sel yang terpapar hipoksia (dan berkorelasi dengan perubahan serupa pada sel HR-SN).

Analisis ontologi gen

Tanda tangan gen yang diturunkan hipoksia diprofilkan untuk dikaitkan dengan dataset yang ada melalui Analisis Jalur Ingenuity (QIAGEN), klasifikasi ontologi gen (DAVID) 42 dan analisis pengayaan set gen (GSEA) 43 . Analisis jalur kecerdikan mengungkapkan bahwa jalur yang paling diperkaya dalam sel HMLER hipoksia setelah 8 hari (HR-H8) sangat penting untuk kanker (mis. Pertumbuhan Sel dan Proliferasi, Kematian Sel dan Kelangsungan Hidup) dan untuk EMT (Gerakan Seluler, Morfologi Sel) ( Gambar 3B). Analisis ini menunjukkan bahwa mekanisme molekuler yang mendasari perubahan, diamati dalam tanda tangan ekspresi gen sel yang terpapar hipoksia untuk jangka waktu yang lama (HR-H8), kemungkinan karena interaksi antara jalur molekul yang disebutkan di atas, menghasilkan gen aktivasi atau pembungkaman dan perubahan fenotip serta atribut perilaku baru.

Kami selanjutnya menggunakan GSEA untuk mengidentifikasi jalur fungsional dan dataset yang diubah oleh paparan hipoksia (Gambar 3B – D) dengan membandingkan perubahan dalam ekspresi gen, ditemukan dalam analisis microarray kami, dengan set gen kurasi untuk jalur kanonik (c2cp) yang dikelola oleh Broad Institut 43 ; daftar gen disajikan pada Gambar Tambahan. S1. Yang penting, kami mengamati peningkatan ekspresi gen target HIF1α dalam sel HR-H6 bila dibandingkan dengan sel HR-N (Gambar 3B). Yang mengejutkan, ada juga pergeseran dari ekspresi gen yang terkait dengan siklus asam tricarboxylic (TCA) dan rantai transpor elektron (juga dikenal sebagai rantai pernapasan) dalam sel yang diberi perlakuan normoksia menuju pengayaan gen yang mengkode enzim glikolitik dalam hipoksia. sel yang dirawat, hubungan yang sudah mapan (Gbr. 3C, D) 44, 45 . Data ini menunjukkan bahwa sel HMLER hipoksik menjalani pemrograman ulang metabolik untuk menekan keterlibatan siklus TCA dan fosforilasi oksidatif / transpor elektron, dan menunjukkan perubahan menuju glikolisis anaerob, untuk generasi ATP, untuk memenuhi kebutuhan energi mereka dan mempertahankan metabolisme pro-pertumbuhan program.

Selain itu, analisis microarray kami mendukung peningkatan gen terkait CSC setelah paparan hipoksia. Pertama, kami menentukan bahwa TWIST1, sebuah gen yang dikenal untuk mempromosikan fenotip CSC pada kanker payudara 12, 46, diregulasi dalam sel HR-H8, dibandingkan dengan sel HR-N dan HR-H6 (Gbr. 3E). Ini menunjukkan bahwa upregulasi ekspresi Twist, yang berimplikasi pada transisi plastis ke kondisi yang lebih mirip batang, terjadi setelah paparan hipoksia yang berkepanjangan dan tidak harus dalam set awal gen yang diregulasi. Temuan ini mengarahkan kita untuk memprediksi peningkatan proporsi CSCs dalam lingkungan mikro hipoksik dari hari ke 6. Selain itu, CYBA (sitokrom b-245, alpha polipeptida), GPX4 (Glutathione peroxidase 4), dan IDH1 (Isocitrate dehydrogenase 1) ) adalah gen, yang, dalam penelitian sebelumnya, ditemukan meningkat pada populasi yang diperkaya CSC payudara 47, dan terlibat dalam metabolisme spesies oksigen reaktif (ROS). Konsisten dengan temuan ini, hasil kami menunjukkan peningkatan regulasi gen tersebut dalam kondisi hipoksia (Gambar 3E). Dalam pengaturan fisiologis, temuan ini konsisten dengan gagasan bahwa hipoksia merupakan predisposisi cedera reperfusi, melalui generasi ROS, stres oksidatif dan peradangan seperti yang telah ditunjukkan untuk kanker payudara 48 . Sementara, data kami berasal dari eksperimen in vitro , namun kami mengamati bahwa CYBA dan IDH1 meningkat secara sementara dalam sel-sel HR-H6 tetapi menurun ke tingkat yang sedikit lebih tinggi di atas normoksia dalam sel-sel HR-H8, sementara GPX4 meningkat secara terus menerus, hingga 8 hari dari hipoksia. Selain itu, kami mencatat bahwa gen-gen ini tidak secara signifikan diekspresikan secara berbeda dalam sel HR-SN, dibandingkan dengan rekan-rekan kontrol, lagi-lagi menunjukkan bahwa perubahan dalam metabolisme ROS adalah perubahan yang diberikan secara unik oleh hipoksia, tidak dimanifestasikan dalam EMT yang bukan hipoksia / siput yang diinduksi.

Hipoksia meningkatkan sifat CSC

Kami baru-baru ini menggambarkan ganglioside GD2 sebagai penanda permukaan sel khusus CSC payudara baru 25 . Untuk menentukan pengaruh kadar oksigen dalam lingkungan mikro terhadap persentase sel GD2 (+), kami FACS-mengisolasi populasi GD2 (-) murni, dan kemudian diuji untuk konversi GD2 (-) ke GD2 (+) sel-sel dalam kondisi normoksik dan hipoksia. Untuk keperluan pemodelan dan interpretasi hasil eksperimen, nilai awal untuk jumlah sel GD2 (+) dalam biakan diambil sebagai nol. Hasil percobaan menunjukkan bahwa proporsi sel GD2 (+) tumbuh ke nilai kesetimbangan, yang merupakan nilai kecil tetapi tidak nol, dan waktu yang diperlukan untuk mencapai kondisi mapan ini lebih dari 8 hari dalam kondisi normoksik (Gambar 4A). ).

Image

( a ) Proporsi sel-sel HMLER GD2 (+) yang muncul secara spontan dari sel-sel HMLER GD2 (-), dengan waktu yang lama dalam kultur dalam kondisi normoksik. ( B ) Proporsi sel-sel HMLER GD2 (+), dihasilkan dari sel-sel HMLER GD2, - selama paparan hipoksia dalam kultur.

Gambar ukuran penuh

Sebagai perbandingan, perubahan proporsi sel GD2 (+), sebagai fungsi waktu, juga diperoleh dalam kondisi hipoksia (1% O2), seperti yang diilustrasikan pada Gambar. 4B. Dalam hal ini, proporsi sel GD2 (+) meningkat hingga nilai kesetimbangan lebih besar daripada sel normoksik. Dalam kondisi normoksik, fraksi sel GD2 (+) meningkat menuju nilai kondisi tunak, selama seluruh periode waktu yang diteliti (data representatif disajikan dalam Gambar Tambahan. S2). Sebaliknya, di bawah kondisi hipoksia, sel-sel memodifikasi perilaku mereka antara hari 3 dan 6, sehingga, dalam interval waktu ini, ada peningkatan proporsi sel GD2 (+), tidak terlihat sebelum hari 3 (Gambar 4B) . Ini konsisten dengan gagasan bahwa selama paparan kondisi hipoksia, setelah titik waktu kritis tertentu, ada saklar deterministik yang meningkatkan plastisitas sel HMLER, mendahului dedifferensiasi dan EMT.

Pengujian kedua, yang digunakan untuk memperkirakan frekuensi sel punca dalam suatu populasi, mengukur proporsi sel yang membentuk bola di bawah kondisi kultur sel lampiran rendah 33 . Namun, dalam percobaan ini, hipoksia secara drastis mengurangi pertumbuhan sel (Gbr. 2C), mengacaukan pengukuran peningkatan yang diharapkan dalam pembentukan mamosfer karena meningkatnya proporsi sel GD2 (+), yang disebabkan oleh paparan hipoksia. Untuk menghindari batasan ini, kami mengembalikan sel yang dikulturkan 2D yang diberi hipoksia ke lingkungan normoksik selama uji pembentukan mammosphere. Dalam kondisi ini, sel yang diobati dengan hipoksia membentuk mammosphere (Gambar 5A) pada tingkat yang secara signifikan lebih besar daripada sel yang terus dipertahankan dalam kondisi normoksik, konsisten dengan peningkatan proporsi sel GD2 (+) pada populasi yang diobati dengan hipoksia (Gambar 5B) .

Image

( a ) Gambar representatif mammosphere, dibentuk oleh sel HMLER yang terpapar hipoksia selama 8 hari, dan kemudian dilapisi untuk pembentukan mammosphere dalam kondisi normoksik, pada 1, 2, 4, dan 9 hari setelah pelapisan. ( B ) efisiensi pembentukan mammosphere dari sel HMLER terkena normoxia atau hipoksia dan selanjutnya dikenakan uji pembentukan mammosphere di bawah normoxia.

Gambar ukuran penuh

Pemodelan matematika menunjukkan peningkatan plastisitas yang diinduksi hipoksia

Model matematika digunakan untuk membandingkan heterogenitas dan plastisitas sel kanker di bawah kondisi lingkungan mikro normoksik dan hipoksik. Parameter model diekstraksi dengan membandingkan hasil pemodelan untuk fraksi CSC (menggunakan persamaan deterministik) dan analisis pembentukan mammosphere (menggunakan simulasi stokastik) dengan data eksperimen yang sesuai, seperti yang dijelaskan pada bagian Metode. Perbandingan ini mengungkapkan bahwa satu-satunya parameter, yang secara signifikan bervariasi ketika lingkungan mikro berubah dari normoksia menjadi hipoksia, adalah tingkat dedifferensiasi, yaitu laju konversi non-CSC ke CSC, yang mewakili peningkatan plastisitas sel yang diamati setelah paparan. hingga hipoksia (Gbr. 6). Tampaknya tingkat plastisitas meningkat dengan mengurangi konsentrasi oksigen (yaitu dengan menginduksi lingkungan mikro hipoksik). Namun, perolehan plastisitas tidak berjalan secara seragam. Bahkan, untuk kondisi hipoksia, yang paling cocok untuk model matematika diperoleh dengan mengasumsikan bahwa tingkat dediferensiasi berbeda untuk interval waktu awal dan akhir (kira-kira, sebelum dan sesudah hari 3). Ini berarti bahwa paparan hipoksia pada awalnya mengurangi plastisitas sel tumor (bandingkan pemulihan sel GD2 (+) dalam normoksia vs hipoksia dalam 3 hari), tetapi secara signifikan meningkatkannya pada titik waktu kemudian. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, tingkat dediferensiasi kira-kira sepuluh kali lebih besar pada waktu kemudian (setelah hari 3), dibandingkan dengan nilai yang sesuai pada waktu sebelumnya (sebelum hari 3).

Image

( a ) Tingkat dediferensiasi sel HMLER dalam kondisi normoksik dan hipoksia, berdasarkan pada model komputasi kami. ( B ) Tingkat dediferensiasi, seperti yang dijelaskan oleh set parameter yang diperoleh untuk data eksperimen, cocok untuk interval waktu awal (sebelum hari 3) dan akhir (setelah hari 3), setelah paparan hipoksia, menggunakan model komputasi.

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Dalam penelitian ini, kami menggunakan kombinasi uji CSC, analisis ekspresi gen, dan pemodelan matematika untuk mempelajari plastisitas fenotipik yang mendasari konversi dari fenotip sel-sel yang dibedakan menjadi fenotip di bawah kondisi normoksik dan hipoksik.

Hasil utama dari karya ini menggambarkan adaptasi dari sel epitel mammae manusia yang berubah menjadi pertumbuhan dalam kondisi hipoksia. Dengan demikian, kami menunjukkan bahwa sel-sel hipoksia menjalani adaptasi bifasik yang melibatkan perubahan ekspresi gen serta perubahan fenotipik. Tidak seperti sel HR-H8 yang terpapar hipoksia selama 8 hari, sel HR-H6 tidak menunjukkan korelasi statistik yang kuat dengan sel yang telah mengalami EMT yang digerakkan oleh siput. Hal ini menunjukkan terjadinya perubahan penting, antara hari ke 6 dan 8 dari jadwal waktu hipoksia, yang berujung pada perolehan fenotipe mirip EMT. Lebih khusus, untuk gen-gen yang harus diregulasi ke bawah untuk memungkinkan sel menjalani transisi seperti EMT, represi terjadi sebagian besar dalam 6 hari pertama, melalui mekanisme yang sama seperti dalam sel HR-SN. Namun, proses analog untuk gen yang harus diregulasi untuk mencapai keadaan seperti EMT berbeda dalam arti bahwa respons hipoksik yang diinduksi mungkin melibatkan jalur aktivasi gen yang terpisah atau tertunda untuk mencapai keadaan mesenkimal. Pada hari kedelapan paparan hipoksia, tanda ekspresi gen yang diregulasi dari sel HR-H8 lebih kuat sesuai dengan tanda gen yang diregulasi dari sel HR-SN, menunjukkan bahwa, pada titik ini, proses mirip EMT yang lebih lengkap sedang berlangsung.

Untuk menganalisis lebih lanjut perbedaan antara mekanisme yang mengatur transisi fenotipik ini sebagai respons terhadap timecourse hipoksia, analisis fungsional set gen dilakukan. Ini menunjukkan bahwa, seperti yang diharapkan, pendorong utama fenotip hipoksia adalah faktor transkripsi terkait HIF1α dan TNF1α. Selain itu, GSEA mengungkapkan perubahan dari ekspresi gen siklus TCA ke ekspresi gen yang terlibat dalam jalur glikolitik, dalam sel hipoksia pada hari ke 6, menunjukkan bahwa pemrograman ulang metabolik ini terjadi dalam waktu 6 hari selama transisi dari fenotipe hipoksik normoksik menjadi stabil. .

Aspek kedua dari penelitian ini menganalisis perubahan dalam ekspresi permukaan sel GD2, sebuah glycosphingolipid dan yang diklaim sebagai biomarker CSC, dalam sel HMLER yang terpapar hipoksia. Dengan demikian, kami membuat profil dinamika temporal transisi dari populasi GD2 (-) ke populasi GD2 (+), mungkin terdiri dari proporsi CSC yang lebih tinggi di bawah rezim hipoksia. Selain itu, uji formasi mammosphere digunakan untuk mengukur proporsi CSCs melalui uji langsung pembaruan diri dan pertumbuhan mereka di bawah kondisi perlekatan sangat rendah. Hasil yang sesuai harus ditafsirkan akuntansi untuk variasi stokastik dalam perilaku karena sejumlah kecil sel pembentuk mamosfer yang terlibat (sel HMLER memiliki kemampuan yang lebih rendah untuk menghasilkan mammosphere dibandingkan dengan misalnya sel HMLER-Twist atau HMLER-Snail). Dua percobaan ini, dengan hasil yang direkonsiliasi melalui pemodelan matematika penghitungan untuk perilaku yang diamati secara deterministik dan stokastik dalam model dua kompartemen, menunjukkan bahwa transisi dari normoksia ke hipoksia menginduksi perubahan yang pasti dalam proporsi CSC, dengan proporsi yang lebih tinggi dari CSC yang muncul. setelah hipoksia. Selain itu, analisis parametrik kuantitatif dari model matematika mengungkapkan bahwa sifat fenotip yang berbeda antara normoksia dan hipoksia ini disebabkan oleh tingkat dedifferensiasi yang lebih tinggi antara non-CSCs ke CSCs.

Yang penting, penelitian ini menyoroti fakta bahwa fenotip tumor, dalam hal proporsi subtipe non-CSC / CSC (atau dibedakan vs terdiferensiasi) dari sel yang terdiri dari lesi, akan sangat tergantung pada parameter lingkungan mikro di sekitarnya. sel-sel tumor dan variabilitas parameter ini dalam tumor secara keseluruhan (misalnya inti tumor vs margin tumor). Yaitu, kami telah menunjukkan, untuk garis sel yang dipelajari secara khusus, bahwa kondisi oksigen secara signifikan mempengaruhi ekspresi gen dan akibatnya mengubah tingkat plastisitas seluler. Misalnya, pemasangan model selama induksi hipoksia mengharuskan penggunaan set parameter yang berbeda untuk titik waktu awal dan akhir paparan hipoksia, yang mewakili perubahan deterministik dalam perilaku. Dengan demikian, sebagai tambahan pada hasil Gupta et al . 49, kami mencatat bahwa transisi ke fenotipe tumor keadaan tunak hanya dapat dilihat sebagai transisi stokastik dalam lingkungan mikro yang sangat stabil, yang tidak mungkin terjadi pada lesi in vivo yang berkembang, di mana faktor biologis menyebabkan variabilitas mikro lingkungan yang besar.

informasi tambahan

Cara mengutip artikel ini : Dhawan, A. et al . Pemodelan matematika plastisitas fenotipik dan konversi ke keadaan sel induk di bawah hipoksia. Sci. Rep . 6, 18074; doi: 10.1038 / srep18074 (2016).

Informasi tambahan

Dokumen Word

  1. 1.

    Informasi tambahan

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.