Metamfetamin dan sel responsif steroid ovarium di amygdala medial posteriodorsal diperlukan untuk perilaku proaktif metamfetamin yang ditingkatkan | laporan ilmiah

Metamfetamin dan sel responsif steroid ovarium di amygdala medial posteriodorsal diperlukan untuk perilaku proaktif metamfetamin yang ditingkatkan | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Metode perilaku
  • Ilmu saraf sel

Abstrak

Metamfetamin (Meth) adalah stimulan psikomotor yang sangat terkait dengan peningkatan dorongan seksual dan dorongan pada pria dan wanita. Perubahan dalam motivasi seksual ini memiliki dampak yang lebih besar pada wanita karena kemungkinan mereka menghadapi beban yang lebih besar dari kehamilan yang tidak direncanakan, serta peningkatan risiko untuk komorbiditas psikiatrik seperti depresi. Kami sebelumnya telah menetapkan model tikus peningkatan motivasi seksual yang diinduksi oleh Meth. Menggunakan model ini, kami telah mengidentifikasi amygdala medial posteriodorsal (MePD) melalui studi lesi eksitotoksik sebagai inti yang diperlukan dalam motivasi seksual wanita yang difasilitasi oleh Meth. Sementara studi lesi memberi kita wawasan tentang inti kunci yang mungkin menjadi target tindakan Meth, pendekatan seperti itu tidak memberikan wawasan tentang identitas neuron MePD spesifik atau sirkuit saraf yang terlibat dalam peningkatan perilaku proaktif yang diinduksi oleh Meth. Dengan menggunakan metode inaktivasi DAUN02, sebuah teknik yang baru-baru ini didirikan untuk menghilangkan populasi sel yang relevan secara perilaku, kami menyajikan bukti bahwa sel-sel responsif steroid / Meth ovarium dalam MePD diperlukan untuk fasilitasi yang diinduksi oleh Meth untuk perilaku proaktif. Temuan ini membentuk dasar untuk pekerjaan di masa depan yang akan memungkinkan untuk klasifikasi subtipe neuron yang terlibat dalam modulasi perilaku proaktif MePD serta pemahaman yang lebih kuat tentang neurocircuitry motivasi seksual wanita.

pengantar

Metamfetamin (Meth) adalah obat pelecehan psikostimulan kuat yang memiliki kecenderungan tinggi untuk meningkatkan dorongan seksual 1 . Pengguna Meth melaporkan, antara efek lainnya, peningkatan hasrat seksual, gairah, dan perilaku seksual berisiko saat menggunakan obat tersebut 2, 3 . Seperti halnya pria, wanita melaporkan bahwa penggunaan Meth mempertinggi pengalaman seksual mereka dan dikaitkan dengan peningkatan dorongan dan aktivitas seksual 1, 2, 3, 4 . Tidak seperti pria, wanita berada pada posisi yang lebih tidak menguntungkan karena beban psikologis dan sosial ekonomi 5, 6, 7 . Perilaku seksual berisiko tinggi tidak hanya melanggengkan penyakit menular seksual seperti HIV / AIDS, tetapi juga menyebabkan peningkatan kehamilan yang tidak direncanakan 1 . Terlepas dari masalah kesehatan dan sosial ekonomi yang signifikan, mekanisme saraf yang mendasari hubungan obat-seks ini tidak dipahami dengan baik.

Beberapa laboratorium, termasuk laboratorium kami, telah menunjukkan bahwa Meth memfasilitasi motivasi seksual pada tikus betina 8, 9, 10, 11 . Pada tikus betina, komponen motivasi seksual ditandai oleh perilaku proaktif (hop, dart, solicitations, ear goyang) yang diperagakan oleh wanita reseptif untuk merangsang pria untuk bersanggama 12 . Dalam model kami yang mapan, pemberian Meth untuk wanita yang reseptif secara seksual (wanita yang diovariektomi yang diobati dengan estradiol dan progesteron; EB + P) secara nyata meningkatkan perilaku proaktif dibandingkan dengan pengobatan EB + P saja, 8, 9, 10 . Peningkatan yang diinduksi oleh Meth dalam motivasi seksual wanita ini khusus untuk rangsangan yang relevan secara seksual karena wanita yang diobati dengan Meth memperlihatkan peningkatan perilaku proaktif terhadap pria jantan utuh dan pria yang dikastrasi dengan androgen tetapi tidak terhadap pria castrate 13 . Selain itu, pekerjaan kami menunjukkan korelasi neurobiologis yang mendasari peningkatan perilaku proaktif yang diinduksi oleh Meth. Pada wanita yang naif secara seksual, administrasi gabungan dari Meth dan EB + P meningkatkan aktivasi amygdala medial posteriodorsal (MePD) yang diukur dengan sel imunopositif cFos 8 . Lesi eksitotoksik pada MePD menghalangi peningkatan perilaku proaktif yang diinduksi oleh Meth yang menunjukkan bahwa MePD adalah neksus hubungan seks yang berhubungan dengan narkoba 10 yang penting . Sementara studi lesi sangat membantu dalam menentukan peran potensial wilayah otak yang ditargetkan untuk perilaku tertentu atau proses fisiologis, lesi sering tidak tepat dan tidak memungkinkan untuk penargetan spesifik dari tipe sel neuron yang relevan secara fungsional atau ansambel yang diperlukan untuk perilaku output.

Baru-baru ini, Bruce Hope dan rekannya telah memelopori teknik yang memungkinkan untuk menentukan apakah ansambel neuron spesifik diperlukan untuk perilaku tertentu. Dengan menggunakan tikus Sprague Dawley yang mengekspresikan transgen cFos-lacZ, 'teknik inaktivasi DAUN02' mengeksploitasi ekspresi β-galaktosidase (β-gal) di bawah promotor cFos untuk menghilangkan neuron yang diaktifkan oleh stimulus atau keadaan spesifik sementara tetangga yang berdekatan tidak neuron yang diaktifkan tetap utuh. Prodrug DAUN02 dikonversi oleh β-gal menjadi daunorubisin di dalam neuron yang mengekspresikan β-gal yang dihasilkan dari aktivasi promotor cFos. Daunorubicin bersifat toksik pada sel yang mengekspresikan β-gal yang menghasilkan apoptosis 16, 17, 18 dan dengan demikian merupakan lesi spesifik sel. Karena ekspresi β-gal hanya diinduksi dalam neuron dengan aktivasi yang kuat dari promotor cFos dan bukan pada neuron yang diaktifkan dengan negatif atau lemah 14, 19, metode ini merupakan pendekatan yang kuat untuk menguji apakah aktivasi kelompok neuronal atau ensemble tertentu diperlukan untuk perilaku yang terkait 14, 15, 19 .

Dalam penelitian ini, kami telah mengadaptasi model ini untuk menguji apakah sel responsif Meth / EB + P (yang diukur dengan ekspresi cFos) dalam MePD diperlukan untuk peningkatan terkait dalam perilaku proaktif. Dalam penelitian ini, tujuan kami adalah 1) untuk menetapkan bahwa tikus transgenik cFos-lacZ menunjukkan aktivasi neuron MePD yang diinduksi oleh Meth serta peningkatan perilaku proaktif dan 2) untuk menunjukkan bahwa neuron MePD yang responsif terhadap Meth / EB + P merupakan perilaku yang relevan secara perilaku. ensemble neuron yang diperlukan untuk peningkatan metil dalam perilaku proaktif dengan secara khusus menghapus neuron ini dengan inaktivasi DAUN02. Setelah ditetapkan, penelitian di masa depan akan bekerja untuk menjelaskan jenis sel dan sirkuit yang terkait dengan modulasi perilaku.

Bahan dan metode

Binatang

cFos-lacZ transgenik Sprague Dawley rat 20 (275-300 g; n = 45) pasangan pengembangbiakan diperoleh oleh Friedbert Weiss, Ph.D. (The Scripps Research Institute (TSRI)) dan dibesarkan di rumah dan ditempatkan di Fasilitas Hewan Laboratorium dari Fasilitas Ilmu Kesehatan di University of Maryland, School of Medicine di bawah terbalik 12 jam: 12 jam gelap: siklus cahaya (lampu off pada 0900 h) dengan makanan dan air tersedia ad libitum. Anak anjing transgenik dan tipe littermate mereka yang liar di-genotipe untuk memverifikasi ekspresi protein fusi c-Fos-β-galaktosidase dengan mengambil pukulan telinga atau segmen ekor dari anak anjing pada saat penyapihan. DNA diisolasi dari sampel menggunakan presipitasi isopropanol. Secara singkat, jaringan diinkubasi semalaman dalam buffer lisis proteinase K pada suhu 55 ° C, DNA diendapkan dengan isopropanol dari larutan dan ditambahkan ke larutan etanol 70% dan dibuat pelet. DNA kemudian diperkuat menggunakan OneTaq kit (New England Biolabs) menggunakan 400 μg DNA, 10 mikromolar maju dan mundur primer (IDT, Iowa). Urutan primer adalah LacZf2538: 5′-GTT GCA GTG CAC GGC AGA TAC ACT TGC TGA-3 ′ dan LacZR2926: 5′-GCC ACT GGT GTG GGC CAT AAT TCA ATT CGC -3 ′. Sampel dijalankan pada gel agarosa 2% menggunakan buffer tris-asetat (TAE) dan etidium bromida. Pita LacZ divisualisasikan di bawah sinar UV pada 388 bp.

Semua hewan dikelompokkan dalam kelompok sampai penempatan kanula ketika mereka ditempatkan dalam kondisi kandang tunggal. Semua hewan diovariektomi secara bilateral dengan anestesi isofluran dan diberi waktu pemulihan 7-10 hari setelah pembedahan. Semua prosedur telah disetujui oleh University of Maryland, Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Baltimore dan sesuai dengan National Institutes of Health Guide untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium. Semua upaya dilakukan untuk meminimalkan penderitaan hewan dan mengurangi jumlah hewan yang digunakan.

Steroid ovarium dan Pengobatan Meth

Semua hewan diperlakukan dengan estradiol, progesteron, dan baik saline atau Meth mengikuti prosedur perawatan yang digunakan dalam penelitian kami sebelumnya 8, 9, 10 (Gbr. 1). Paradigma pengobatan kami adalah sebagai berikut: Empat puluh delapan jam sebelum dimulainya pengujian eksperimental, hewan diberikan 5 μg 17-β-estradiol benzoat (EB; Sigma Aldrich, St. Louis, MO) dalam minyak wijen subkutan (SC) diikuti 10 μg EB atau 0, 1 mL 24 jam kemudian. Empat jam sebelum pengujian eksperimental, tikus disuntik dengan progesteron (P, 500 ug, SC; Sigma-Aldrich). Selama tiga hari tikus priming hormon menerima suntikan Meth harian (5 mg / kg / hari, IP; Sigma-Aldrich) atau saline. Dosis dan protokol pemberian Meth ini sebelumnya diperlihatkan untuk memfasilitasi motivasi dan perilaku seksual wanita tanpa menyebabkan peningkatan stereotip atau pergerakan umum pada titik waktu pengujian eksperimental 8, 9 .

Image

Hewan adalah OVX dan diizinkan satu minggu untuk pulih. Hari 7–9 pasca operasi, hewan menerima injeksi saline atau Meth dan EB + P.

Gambar ukuran penuh

Analisis statistik

Semua hasil dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM. ANOVA satu arah atau dua arah yang diikuti oleh tes post hoc Tukey digunakan dan diindikasikan sesuai kebutuhan. Uji t siswa digunakan untuk perbandingan dua kelompok. Ambang Signifikansi ditetapkan pada p ≤ 0, 05. Semua tes statistik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism (versi 6, San Diego, CA USA).

Beta-Galactosidase dan imunoreaktivitas Fos di MePD setelah pengobatan steroid Meth dan ovarium pada tikus betina transgenik cFos-lacZ

Penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa pada tikus Sprague Dawley tipe liar, ekspresi Fos paling tinggi setelah pemberian Meth dan EB + P pada saat perilaku (4 jam pasca perawatan). Untuk memverifikasi bahwa tikus transgenik cFos-lacZ menunjukkan respons yang sama, ekspresi protein cFos dan proksi-nya, β-gal diperiksa. Empat jam setelah Meth dan injeksi hormon terakhir (lihat Gambar. 1), hewan diperfusi secara transcardial dengan anestesi ketamin / xylazine (98 mg / kg dan 18, 5 mg / kg, masing-masing; IP) dengan salin 0, 9% yang mengandung natrium nitrat, diikuti oleh 4% paraformaldehyde dalam 0, 5 M kPBS. Setelah perfusi, otak diekstraksi, post-fix, cryoprotected, beku, dan diproses untuk imunohistokimia. Secara singkat, kohort yang mengandung bagian dari semua kelompok perlakuan dibilas dalam kPBS, diblokir dalam 0, 5% Triton-X, 5% serum kambing normal, dan 1% hidrogen peroksida dalam kPBS selama 1 jam. Bagian diinkubasi semalam pada suhu 4 ° C dengan antibodi monoklonal tikus yang ditargetkan ke beta-galactosidase (G8021 Clone GAL-13 Sigma, St. Louis, MO) pada pengenceran 1: 30000 atau 48 jam pada suhu 4 ° C dengan kelinci poliklonal antibodi yang ditargetkan ke cFos (Kucing No. 18-0172 Calbiochem Invitrogen, Carlsbad, CA) pada pengenceran 1: 40.000 dalam Triton 0, 05% dan serum kambing normal 1% dalam kPBS. Bagian kemudian dicuci dan diinkubasi dalam antibodi sekunder (kambing anti-tikus atau kambing anti-kelinci, masing-masing; Laboratorium Vektor, Burlingame, CA) dalam 0, 5% Triton dalam kPBS selama satu jam, diikuti oleh kompleks avidin-biotin. Bagian dikembangkan di DAB (3-3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, 04001-5 Polysciences, Inc., Warrington, PA). Bagian dipasang secara seri pada slide kaca berlapis 2% dan penutupnya tergelincir. Jumlah sel β-gal- dan cFos-immunoreactive dihitung dengan bantuan perangkat lunak Neurolucida (MicroBrightField, Colchester, VT) menggunakan metode standar laboratorium sesuai dengan parameter yang ditetapkan sebelumnya untuk MePD 8, 9 . Secara singkat, kontur terstandarisasi digunakan untuk membatasi MePD. Tiga bagian otak (seri) yang dipisahkan oleh 140 μm digunakan. Jika tiga bagian dari daerah otak yang sesuai tidak dapat diperoleh, hewan tersebut dikeluarkan dari analisis wilayah tersebut. Kedua sisi inti bilateral ini dimasukkan dalam analisis, menghasilkan enam kontur penghitungan. Dari enam kontur ini, rata-rata jumlah sel β-gal atau cFos-positif per bagian untuk masing-masing daerah diturunkan. Kedua β-gal dan cFos dievaluasi pada setiap hewan untuk menentukan apakah tingkat ekspresi mengikuti pola yang sama dan untuk membuat perbandingan yang lebih langsung dengan ekspresi cFos dari penelitian sebelumnya. Slide dicocokkan secara anatomis dan dikodekan secara numerik sehingga penyelidik yang melakukan analisis tidak mengetahui kelompok eksperimen.

Meth-induced peningkatan perilaku proaktif pada tikus betina transgenik cFos-lacZ

Penelitian kami sebelumnya secara konsisten menunjukkan bahwa Meth meningkatkan perilaku proaktif rata-rata 2, 5 kali lipat pada tikus Er + P yang diobati Sprague Dawley tikus 8, 9, 10 . Paradigma perilaku yang telah mapan ini diterapkan pada tikus transgenik Lac Z + untuk memverifikasi respons perilaku yang serupa dibandingkan dengan tipe liar. Tes perilaku dilakukan di bawah red light redup pada fase gelap siklus cahaya antara 1300 dan 1600 jam, sekitar 4 jam setelah injeksi Meth terakhir (Gbr. 1). Pada hari pengujian perilaku, dua laki-laki Sprague Dawley yang naif secara seksual masing-masing ditempatkan sendirian di ruang observasi Plexiglas berukuran 50 cm × 38 cm × 25 cm dan dibiarkan beraklimasi selama 5 menit. Seorang wanita eksperimental kemudian ditempatkan dengan masing-masing laki-laki. Setiap tes perilaku direkam oleh kamera video dan diselesaikan ketika 15 menit telah berlalu. Di antara tes perilaku, pria diizinkan 5 menit untuk beristirahat sebelum pertemuan berikutnya, dan setiap wanita terpapar kedua pria. Laki-laki naif dipilih untuk tes ini karena kurang semangat mendorong pengurangan perilaku penolakan terlihat. Selama tes, simpatisan tetap berada di lokasi yang konsisten sekitar 0, 5 m dari ruang observasi selama semua percobaan.

Eksperimen yang buta terhadap kelompok perlakuan menilai perilaku seksual proaktif seperti yang dijelaskan sebelumnya 8, 9, 10 . Dalam tikus itu, "pacaran" yang diprakarsai wanita secara klasik disebut perilaku proaktif. Perilaku ini terdiri dari hop, dart, postur ajakan, dan goyangan telinga untuk mendapatkan perhatian pria. Secara singkat, jumlah perilaku proaktif, perilaku reseptif (skor lordosis, hasil bagi), perilaku penolakan dari perempuan, dan tunggangan laki-laki yang terjadi dalam 15 menit dihitung. Untuk mengontrol perbedaan perilaku pria, perilaku wanita dirata-rata antara dua sesi 15 menit. Pemasangan jantan dibandingkan antara hewan individu (jantan vs jantan) serta antara kelompok perlakuan betina.

DAUN02 Inaktivasi sel aktif Meth dan EB + P dalam MePD

Paradigma DAUN02 terjadi selama sekitar tiga minggu, dimulai dengan operasi awal. Paradigma ini kemudian dipecah menjadi tiga fase utama seperti yang dijelaskan di bawah ini.

Operasi stereotoksik menargetkan amygdala medial posteriodorsal

Hewan ditempatkan di alat stereotaxic (Instrumen Kopf, Tujunga, CA) di bawah anestesi isoflurane; sayatan dibuat untuk mengekspos tengkorak. Kanula pemandu 25-gauge kronis (Plastics One, Roanoke, VA) ditanam secara bilateral ke MePD (posterior 3, 0 mm, lateral lateral ± 3, 55 mm, dan ventral 7, 0 mm dari Bregma) dan ditempelkan ke tengkorak menggunakan akrilik gigi dan sekrup tulang. Stylet dummy ditempatkan di kanula pemandu agar tidak terhalang. Hewan-hewan itu OVX pada saat ini dan diberi waktu seminggu untuk pulih sebelum Fase Lesi DAUN02.

Fase Lesi

Hewan diperlakukan seperti yang dijelaskan pada Gambar. 2. Semua hewan menerima infus DAUN02 (HY-13061, MedChemExpress, Princeton, NJ, USA) atau kendaraan 10 menit sebelum injeksi progesteron dan Meth. Selama infus mikro, stylet dummy dilepas dan diganti oleh 33 gauge microneedles yang memproyeksikan 1, 3 mm di bawah kanula pemandu dan dipasang melalui tabung polietilen ke jarum suntik Hamilton 25 μl Hamilton (seri 700, Hamilton, Reno, NV). Laju aliran fluida dikontrol oleh pompa BASi Bee yang terpasang pada pengontrol Bee Hive (Bioanalytical Systems, Inc., West Lafayette, IN). Lesi bilateral yang menargetkan sel beta-galactosidase dari MePD diproduksi dengan injeksi 0, 5 μl DAUN02 (4, 0 μg / μl dalam 5% DMSO PBS). Infus terjadi selama 5 menit dan microneedles tetap di tempatnya selama 5 menit tambahan untuk memastikan difusi menjauh dari ujung jarum. Lesi kontrol dilakukan dengan menggunakan metode yang sama, tetapi menggunakan injeksi kendaraan.

Image

Hari 7–9 pasca operasi, hewan menerima injeksi Meth dan EB + P. Pada saat pemberian progesteron pada hari ke 9, kendaraan DAUN02 atau DMSO diinfuskan. Ada periode untuk memungkinkan lesi terjadi dan DAUN02 dibersihkan dari wilayah tersebut. Minggu berikutnya, hewan menerima hormon putaran kedua dan Meth dan memiliki perilaku yang dievaluasi empat jam setelah progesteron. Putaran ketiga EB + P dan Meth kemudian diadvistrasi untuk mengevaluasi cFos-ir empat jam setelah EB + P dan Meth setelah infus DAUN02 tunggal tiga minggu sebelumnya.

Gambar ukuran penuh

Studi percontohan awal menanamkan DAUN02 selama tiga hari pertama paparan Meth. Optimalisasi penelitian menyebabkan pengurangan protokol ini menjadi injeksi tunggal pada hari ke 9 (Gbr. 2). Tiga hewan yang diinfuskan dibandingkan dengan hewan yang dirawat secara tunggal dan tidak ada perbedaan statistik yang ditemukan; oleh karena itu, kelompok-kelompok itu runtuh. Semua hewan diberi 5-7 hari untuk DAUN02 untuk lesi sel dan dimetabolisme secara memadai sebelum memasuki fase berikutnya.

Fase Perilaku

Semua hewan diperlakukan dengan Meth dan EB + P seperti yang dijelaskan pada Gambar. 2 dan diuji untuk perilaku seksual seperti yang dijelaskan di atas empat jam setelah menerima pengobatan Meth dan P gabungan.

Fase Konfirmasi

Penempatan Kanula

Hewan-hewan tersebut diperfusi secara transcardially dengan anestesi ketamin / xylazine (60 mg / kg, IP) dengan saline 0, 9% yang mengandung natrium nitrat, diikuti oleh paraformaldehyde 4% dalam 0, 5MkPBS. Otak disimpan semalam dalam larutan paraformaldehyde 4% dan kemudian cryoprotected dalam sukrosa 30% dalam kPBS. Setelah cryoprotection, otak dibekukan di atas es kering dan disimpan pada suhu −80 ° C hingga diproses untuk pewarnaan Nissl. Otak dibelah (35 μm) dalam bidang koronal dalam cryostat dan disimpan dalam larutan cryoprotectant (etilena glikol / glukosa dalam buffer natrium fosfat) sampai diproses. Bagian dibilas dalam kPBS dan dipasang secara serial pada slide kaca berlapis 2%. Mereka direhidrasi dalam dH2O, diwarnai dalam larutan Cresyl Violet 0, 5% yang mengandung 1 M natrium asetat, dan 1 M asam asetat dan ditutup-tutupi. Penempatan dianggap tepat ketika jalur kanula terletak di dalam bagian yang sesuai dengan pelat 54-60 dalam atlas otak standar 21 dan jatuh dorsolateral ke saluran optik.

Konfirmasi pengurangan cFos

Otak yang dikumpulkan untuk verifikasi penempatan kanula juga menjalani imunohistokimia cFos. Secara singkat, selama fase konfirmasi seperti yang terlihat pada Gambar. 2, hewan mundur dengan Meth dan hormon dan dikumpulkan empat jam setelah pengobatan progesteron pada hari ke 23. cFos IHC diselesaikan seperti yang dijelaskan di atas untuk menentukan apakah lebih sedikit sel yang mengekspresikan cFos, selama waktu tersebut. perilaku, setelah infus DAUN02.

Hasil

Pemberian Meth meningkatkan imunoreaktivitas Fos- dan Beta Galaktosidase dalam MePD tikus transgenik cFos-lacZ prima hormon

Mirip dengan data kami sebelumnya yang diterbitkan pada perempuan tipe liar Sprague-Dawley, jumlah sel cFos-imunoreaktif (-ir) meningkat di MePD setelah pemberian Meth pada perempuan transgenik cFos-lacZ (Gambar 3a). Ini dikuantifikasi pada Gambar. 3b, yang menunjukkan peningkatan sekitar 2 kali lipat dalam Fos-ir setelah pemberian Meth / EB + P, dibandingkan dengan kontrol yang diberi perlakuan saline / EB + P (t (4) = 2, 28, p <0, 05 ). Demikian pula, jumlah sel β-gal-ir di MePD tikus cFos-lacZ meningkat setelah pemberian Meth ke betina prima secara hormonal (Gbr. 3c). Ini dikuantifikasi menjadi peningkatan 3 kali lipat setelah pemberian Meth / EB + P (t (4) = 2, 09, p = 0, 05; Gambar. 3d); Namun, jumlah sel β-gal -ir dalam MePD terutama lebih sedikit dari sel Fos-ir pada kedua kelompok perlakuan.

Image

Tikus transgenik OVX cFos-lacZ dewasa diprioritaskan dengan EB + P dan menerima baik saline atau Meth (5 mg / kg). Empat jam setelah injeksi terakhir, jaringan dikumpulkan untuk jumlah sel. ( a ) Photomicrographs mewakili Fos-ir di MePD. Panah mengidentifikasi cFos-ir yang sangat diekspresikan dan panah menunjukkan cFos-ir yang berekspresi rendah. Kedua jenis ekspresi dimasukkan dalam kuantifikasi. ( B ) Kuantifikasi cFos-ir di MePD. Uji t mengungkapkan perbedaan yang signifikan antara kelompok (t (4) = 2, 29, * p <0, 05, n = 3). ( c ) Photomicrographs mewakili β-Gal-ir di MePD. ( d ) Kuantifikasi β-Gal-ir di MePD. Sebuah uji-t menunjukkan tren yang kuat untuk peningkatan dengan kehadiran Meth (t (4) = 2, 09, # p = 0, 05, n = 3). OT = saluran optik.

Gambar ukuran penuh

Pemberian meth meningkatkan perilaku proaktif pada tikus transgenik cFos-lacZ prima secara hormon

Meth secara signifikan meningkatkan perilaku proaktif pada tipe liar yang prima secara hormonal dan tikus transgenik cFos-lacZ dibandingkan dengan mereka yang diobati dengan EB + P saja. ANOVA dua arah dengan obat dan strain genetik sebagai faktor mengungkapkan efek utama yang signifikan dari Meth (F (1, 12) = 61, 99, p <0, 0001; Gambar. 4a). Tes post hoc A Tukey menunjukkan bahwa Meth meningkatkan perilaku proaktif pada WT (p <0, 005) dan tikus transgenik cFos-lacZ (p <0, 0005) dibandingkan dengan kontrol saline masing-masing. ANOVA dua arah juga mengungkapkan efek utama yang signifikan dari regangan (F (1, 12) = 5, 75, p <0, 05; Gambar 4a). Tes post hoc Tukey menunjukkan bahwa perbedaan antara strain yang dihasilkan dari masing-masing kontrol salin berbeda secara signifikan dari kelompok yang diobati dengan Meth strain lainnya (p <0, 01, p <0, 0001). Tidak ada efek obat atau strain untuk kedua lordosis quotient (F (1, 13) = 1, 46, F (1, 13) = 1, 46, Gambar 4b) atau skor lordosis (F (1, 14) = 0, 001, F ( 1, 14) = 2.91, Gbr. 4c).

Image

Efek Meth pada perilaku proaktif ( a ) dan lordosis ( b, c ) pada tikus betina prima hormon: perbandingan antara tipe liar dan tikus cFos-lacZ. OVX WT Sprague-Dawley dan tikus transgenik cFos-lacZ dewasa dipreparasi dengan EB + P dan menerima saline atau Meth (5 mg / kg). Tes perilaku dilakukan empat jam setelah injeksi akhir. ANOVA dua arah menunjukkan ada efek utama Meth (F (1, 12) = 61, 99, p <0, 0001, n = 3–5; a ) dan Strain (F (1, 12) = 5, 75, p <0, 05, n = 3–5; a ) tentang perilaku proaktif. Uji perbandingan ganda post-hoc Tukey mengungkapkan bahwa hewan yang diberi perlakuan salin berbeda secara signifikan dari masing-masing kelompok yang diberi perlakuan Meth (WT: ** p <0, 005, LacZ: *** P <0, 0005) dan hewan yang diberi saline dan hormon secara signifikan berbeda dari kelompok yang diobati dengan Meth strain lain (p <0, 01, b p <0, 0001), tetapi masing-masing pasangan yang diberi perlakuan salin atau met-diperlakukan tidak berbeda satu sama lain. Tidak ada efek obat atau strain untuk kedua lordosis quotient (F (1, 13) = 1, 46, F (1, 13) = 1, 46, b ) atau skor lordosis (F (1, 14) = 0, 001, F (1, 14) = 2.91, c ).

Gambar ukuran penuh

Induksi meth sel-sel cFos-ir dalam MePD menurun setelah pemberian DAUN02 tunggal

Setelah infus DAUN02 dan pengujian perilaku, jaringan dievaluasi untuk penempatan kanula (Gbr. 5a) dan jumlah sel positif cFos (Gbr. 5b dan c) empat jam setelah pemberian akhir Meth dan EB + P. Setiap hewan yang memiliki penempatan kanula di luar MePD (seperti yang ditunjukkan dalam warna abu-abu pada Gambar. 5a) tidak dimasukkan dalam analisis. Demikian pula, jaringan dievaluasi menggunakan pewarnaan Cresyl Violet Nissl untuk menentukan bahwa MePD masih utuh (Gambar Tambahan). Uji t seorang siswa mengungkapkan bahwa infus DAUN02 menghasilkan penurunan yang signifikan dalam sel cFos-ir di MePD dibandingkan dengan infus Kendaraan (t (15) = 2.163, p <0, 05; Gambar 5c).

Image

( a ) Rekonstruksi skematis dari penempatan kanula di MePD (ujung kanula ditandai dengan warna hitam, setiap lingkaran hitam di luar nukleus sebagaimana didefinisikan dalam warna abu-abu dianggap sebagai "kehilangan"). Bagian koroner melalui amygdala medial, diadaptasi dari Paxinos dan Watson 21 . Hewan dengan penempatan kanula di luar MePD tidak dimasukkan dalam analisis perilaku. ( B ) Photomicrographs mewakili cFos di MePD setelah pemberian Meth dan hormon setelah DAUN02 atau infus kendaraan. ( c ) Uji-t seorang siswa menunjukkan DAUN02 secara signifikan mengurangi sel-sel Fos-ir di MePD dibandingkan dengan kohort yang diobati dengan kendaraan (t (15) = 2, 163, * p <0, 05, n = 9). OT = saluran optik.

Gambar ukuran penuh

DAUN02-inaktivasi sel Meth / EB + P-responsif cFos + mengurangi efek Meth pada proceptivity

ANOVA satu arah mengungkapkan bahwa infus DAUN02 langsung ke dalam MePD tikus transgenik cFos-lacZ yang diobati dengan Meth dan EB + P mengurangi peningkatan yang difasilitasi oleh Meth dalam proceptivity (F (2, 25) = 1, 176, p <0, 05; Gbr. 6a; ). Beberapa uji perbandingan Tukey menunjukkan bahwa tikus yang dirawat DAUN02 menunjukkan perilaku proaktif yang jauh lebih sedikit, sekitar 1, 5 kali lebih sedikit, dibandingkan dengan kontrol yang diinfeksi Kendaraan (p <0, 05; Gambar 6a). Selain itu, perilaku proaktif pada hewan yang diinfus DAUN02 yang menempatkan kanula secara tidak tepat (yaitu tidak menargetkan MePD) tidak berbeda secara signifikan dari kontrol yang diinfusikan kendaraan tetapi menunjukkan perilaku yang lebih proaktif secara signifikan daripada kohort yang ditargetkan dengan benar (p <0, 05, Gambar. 6a ). Perbedaan yang signifikan tidak dicatat dalam hasil lordosis atau skor lordosis (t (14) = 1, 34, p = 0, 20, Gambar. 6b; t (14) = 1, 25, p = 0, 23, Gambar. 6c).

Image

Setelah inaktivasi DAUN02, hewan dipupuk hormon dan diobati dengan Meth (5 mg / kg) selama tiga hari. Tes perilaku diselesaikan empat jam setelah perawatan akhir. ( a ) ANOVA satu arah mengungkapkan DAUN02 secara signifikan mengurangi perilaku seks proaktif pada hewan Meth dan hormon yang diobati (F (2, 25) = 4, 381, p <0, 05, n = 7-11). Perbandingan post-hoc Tukey mengungkapkan bahwa baik yang dirawat dengan kendaraan (n = 11), dan hewan dengan penempatan kanula yang tidak tepat (miss, n = 7) menunjukkan jumlah perilaku proaktif yang jauh lebih besar daripada hewan yang memiliki DAUN02 yang dimasukkan ke dalam MePD (n = 10) ) (* p <0, 05). Garis putus-putus menunjukkan EB + P-only mean perilaku dasar dari Gambar. 4a untuk perbandingan. ( b ), ( c ) Perilaku Seks Reseptif setelah infus DAUN02 tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok untuk Lordosis Quotient atau Skor Lordosis.

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Sementara survei terbaru menunjukkan penurunan nasional dalam penggunaan Meth, wanita dari berbagai latar belakang sosial ekonomi dan ras menunjukkan tren peningkatan dalam penggunaan 22, 23, 24 . Penyalahgunaan meth pada wanita dikaitkan dengan perilaku seksual berisiko tinggi yang meningkatkan kekhawatiran kesehatan yang signifikan atas peningkatan tingkat penyakit menular seksual seperti HIV / AIDS dan kehamilan yang tidak direncanakan di antara wanita yang kecanduan Meth 1.25 . Studi pelaporan diri sangat mengaitkan penggunaan Meth dengan dorongan seksual yang meningkat, keinginan dan aktivitas seksual pada wanita 1, 2, 3, 4 . Sementara isyarat sosial yang spesifik untuk interaksi manusia sebagian dapat berkontribusi pada peningkatan dorongan dan perilaku seksual, semakin banyak bukti dari penelitian pada hewan menunjukkan korelasi neurobiologis yang mengarah pada perubahan perilaku seks setelah paparan Meth. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menetapkan tikus transgenik Fos-lacZ dan metode inaktivasi DAUN02 14, 20 sebagai sistem model untuk mempelajari mekanisme yang lebih baik di mana Meth mengaktifkan neurocircuitry yang mendasari motivasi seksual. Hasil dari penelitian ini menunjukkan (1) tikus transgenik Fos-lacZ yang mengekspresikan β-gal di bawah promotor cFos menunjukkan respons perilaku neuroanatomikal dan seksual fungsional serupa terhadap Meth seperti yang sebelumnya dilaporkan pada Sprague Dawleys 8 dan (2) yang ditargetkan pada tipe liar. penghapusan sel-sel responsif EB + P / Meth (yaitu orang-orang yang Fos-ir) di MePD dilemahkan peningkatan Meth-terfasilitasi dalam perilaku proaktif.

Yang lain dan kami telah melaporkan bahwa Meth meningkatkan perilaku seks proaktif (atau soliter) pada tikus betina 8, 9 . Pada wanita yang naif secara seksual, pemberian kombinasi hormon Meth dan ovarium meningkatkan aktivasi neuron dari neuron MePD (yang diukur dengan cFos) di atas satu saja 8 . Selain itu, peningkatan ini terjadi pada saat perempuan akan menerima secara seksual menunjukkan bahwa sel-sel yang teraktivasi mungkin memediasi peningkatan perilaku proaktif. Memang, lesi eksitotoksik dari MePD menghilangkan peningkatan proceptivity yang diinduksi oleh Meth menunjukkan peran untuk MePD dalam memediasi efek Meth pada proceptivity 10 . Hasil dari penelitian saat ini menyediakan sekarang menyediakan lebih banyak bukti diskrit bahwa populasi neuron MePD yang diaktivasi oleh pemberian Meth dan hormon ovarium memainkan peran penting dalam memediasi peningkatan yang dipicu oleh Meth dalam peningkatan proceptivity. Dengan demikian, neuron-neuron MePD yang responsif terhadap Meth / EB + P ini dapat mewakili ansambel neuron diskrit yang bertanggung jawab atas modulasi prokeptivitas di hadapan Meth.

Dalam serangkaian laporan, Hope dan rekan baru-baru ini menetapkan bahwa tikus c-Fos-LacZ dalam kombinasi dengan teknik inaktivasi DAUN02 adalah model yang cocok untuk secara selektif menghilangkan ansambel neuron spesifik dan menguji peran kausalnya dalam keluaran perilaku spesifik 14, 16, 17, 18, 19 . Lesi DAUN02 ideal untuk menentukan peran sel-sel spesifik, karena mereka tidak menyebabkan gangguan global pada parenkim 14 . Sebaliknya, hanya sel-sel yang mengekspresikan tingkat tinggi Fos (dan dengan demikian β-Gal) dihilangkan melalui apoptosis 18 . Mirip dengan apa yang ditemukan orang lain di daerah lain, pada hewan yang secara seksual naif, kami mengamati lebih sedikit sel β-Gal-ir daripada sel Fos-ir di dalam MePD. Sementara ada potensi bahwa ini disebabkan oleh transmisi transgen yang tidak lengkap (mungkin pada hewan heterozigot), telah ditunjukkan bahwa ekspresi β-gal hanya diinduksi dalam neuron dengan ekspresi Fos 14, 19 yang kuat . Anehnya, lebih sedikit sel cFos-ir yang diamati dalam kontrol yang ditangani kendaraan untuk fase inaktivasi DAUN02 (Gbr. 5c; kelompok kendaraan) dibandingkan dengan kohort naif seksual yang diobati dengan Meth dan EB + P (Gbr. 3b). Pengurangan sel c-Fos-ir dalam kontrol kendaraan DAUN02 ini mungkin karena paparan Meth berulang. Di daerah otak lain, pemberian Meth kronis atau berulang mengurangi jumlah sel Fos-ir 26, 27 . Dalam percobaan DAUN02, hewan menerima sembilan suntikan Meth dibandingkan dengan tiga yang diterima oleh hewan yang naif secara seksual.

Namun demikian, jumlah sel MePD responsif Meth / EB + P (yang diukur dengan cFos-ir) secara signifikan berkurang pada hewan yang diobati dengan DAUN02 dibandingkan dengan kontrol kendaraan yang diobati dengan Meth / EB + P. Selain itu, pengurangan cFos-ir ini Sel-sel dikaitkan dengan pelemahan peningkatan yang diinduksi Meth dalam proceptivity menunjukkan bahwa ensemble sel MePD responsif terhadap kombinasi Meth dan steroid ovarium diperlukan untuk peningkatan perilaku. Dalam dukungan lebih lanjut untuk spesifisitas lesi yang ditargetkan sel, hewan yang menerima DAUN02, tetapi yang memiliki penempatan kanula yang tidak tepat di luar MePD (yaitu "meleset") menunjukkan tingkat perilaku proaktif yang serupa dengan kontrol yang dirawat oleh kendaraan. Meskipun kami tidak mengamati peningkatan yang diinduksi oleh Meth dalam respons lordosis, ini tidak mengejutkan karena pengobatan kombinasi EB + P menghasilkan hasil bagi lordosis dan skor maksimal. Taken together these findings support the hypothesis that Meth's effects on proceptivity are dependent on a discrete population of neurons within the MePD, and that this ensemble is relevant specifically to the behavioral effects of Meth on proceptivity alone.

Of note, while some cFos-ir cells in the DAUN02 treated cohort remained, they were not sufficient to allow Meth-induced increases in proceptivity. These remaining cFos-ir cells may have escaped the cell-specific removal due to a DAUN02 induced inactivation that did not lead to cell death 18 . Nervertheless, the marked reduction in cFos-ir cells suggests that DAUN02 was effective in removing a signicant portion of the targeted cells. Alternatively, as repeated Meth exposure results in sensitization of the neural substrate 28, 29, 30, MePD neurons that might have been low-responders to the Meth/hormone treatment during the lesion phase and thus not targeted may have become sensitized over the two subsequent rounds of exposure resulting in detectable levels of cFos following the third exposure.

Previous studies implicate the MePD as a key site for the modulation and enhancement of female sexual motivation 11, 31, 32, 33, 34, 35, 36 . The MePD processes and integrates sexually relevant signals such as chemosensory 37 and somatosensory signals 38, 39, 40, 41, 42, suggesting that the MePD may act as a nexus in the expression of motivated sexual behaviors. Lesions of the MeA lead to a decrease in lordotic responses 33, proceptive behaviors 32, 34, and conditioned place preference 35, whereas stimulation of the MeA increases receptive behaviors such as lordosis 33, 34 . Our previous 8, 9, 10 and current findings that a specific ensemble of MePD neurons responsive to Meth and ovarian steroids are necessary for the enhancement of proceptive behaviors, but not for the display of EB + P only sexual behaviors suggests that an activation of the MePD is necessary in the enhancement of sexual motivation. Our findings are in agreement with those of Afonso et al ., who have identified a naturally occurring variant in Long–Evans rats in which females exhibit “super-solicitational” behaviors 32, 43 . These super- solicitational rats have a 2.5-fold increase in Fos-positive cells in the MePD compared to normal rats 32, and MePD lesions abolish the expression of the solicitation behaviors 32 . The mechanisms mediating the increase in the activation of the MePD neurons in the Long-Evans variant are not clear. However, in our model of Meth-facilitated proceptive behaviors, signaling via the dopamine D1 receptor and progesterone receptor in the MePD are both required for the Meth-induced increase in female sexual behaviors 10 . Future work using the cFos-lacZ rats will examine whether the dopamine and progesterone signaling component requires separate MePD cell populations.

In summary, our current findings in a rodent model suggest that Meth enhances female sexual motivation via enhanced activation of a discrete neuronal population in the MePD. Taken together with our previous work, these findings suggest that this specific neuronal ensemble may mediate dopamine and progesterone signaling, both of which are necessary for the Meth-induced facilitation of proceptive behaviors. Moreover, the discovery that Meth-induced increases in proceptivity requires a specific neuronal ensemble, which is highly responsive to Meth and ovarian steroids, sets the foundation for a better understanding of the neurobiology that links sexual motivation and Meth use. Such an understanding may ultimately lead to the development of more effective therapeutic strategies to reduce high-risk sexual behaviors.

informasi tambahan

How to cite this article : Williams, KM and Mong, JA Methamphetamine and Ovarian Steroid Responsive Cells in the Posteriodorsal Medial Amygdala are Required for Methamphetamine-enhanced Proceptive Behaviors. Sci. Rep. 7, 39817; doi: 10.1038/srep39817 (2017).

Catatan penerbit: Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Gambar Tambahan

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.