Pencitraan spektroskopi vibrasi skala mikrosekron oleh mikroskop hamburan raman terstimulasi multipleks | cahaya: sains & aplikasi

Pencitraan spektroskopi vibrasi skala mikrosekron oleh mikroskop hamburan raman terstimulasi multipleks | cahaya: sains & aplikasi

Anonim

Subjek

  • Imaging dan sensing
  • Mikroskopi multiphoton
  • Optik nonlinier

Abstrak

Pencitraan spektroskopi vibrasi waktu nyata diperlukan untuk memantau keadaan seluler dan proses seluler dengan cara yang bebas label. Pencitraan spektroskopi Raman dari sistem yang sangat dinamis dihambat oleh akuisisi spektral yang relatif lambat pada milidetik hingga skala kedua. Di sini, kami melaporkan pencitraan spektroskopi vibrasi skala mikro dengan deteksi paralel bebas terkunci dari sinyal hamburan Raman terstimulasi yang distimulasi secara spektral. Menggunakan array penguat homebuilt yang disetel, metode kami memungkinkan akuisisi spektral Raman, dalam jendela yang ditentukan oleh pulsa broadband, pada kecepatan 32 μs dan dengan sensitivitas deteksi terbatas dekat-bunyi tembakan. Digabungkan dengan analisis resolusi kurva multivariat, platform kami memungkinkan pemetaan komposisi tetesan lipid dalam sel hidup tunggal, pengamatan metabolisme retinoid intraseluler, diskriminasi tetesan lemak dari organel kaya protein di elegans Caenorhabditis , deteksi spektral sel tumor yang mengalir cepat dan pemantauan difusi obat melalui jaringan kulit in vivo . Teknik yang dilaporkan membuka peluang baru untuk analisis komposisi kompartemen seluler dalam pengaturan mikroskop dan profil spektral throughput tinggi sel tunggal dalam pengaturan sitometer aliran.

PENGANTAR

Proses raman scattering (SRS) yang distimulasi, pertama kali dilaporkan oleh Woodbury dan Ng 1 pada tahun 1962, baru-baru ini digunakan untuk pencitraan getaran kecepatan tinggi. 2, 3, 4, 5, 6, 7 SRS adalah proses optik nonlinier urutan ketiga, yang melibatkan dua bidang laser, yaitu, bidang pompa di ω p dan bidang Stokes di ω S. Ketika frekuensi pemukulan ( ω p - ω S ) disetel untuk membangkitkan getaran molekul, perbedaan energi antara ω p dan ω S memompa molekul dari keadaan dasar ke keadaan tereksitasi secara getaran. Medan laser memanifestasikan dirinya sebagai penurunan intensitas sinar pompa yang lemah, yang disebut kerugian Raman terstimulasi (SRL), dan peningkatan intensitas sinar Stokes yang sesuai, yang disebut gain Raman terstimulasi. Dalam kasus SRL, untuk mengukur perubahan intensitas laser yang lemah, biasanya pada urutan 0, 01% atau lebih kecil, intensitas sinar Stokes I S dimodulasi dan intensitas sinar pompa Ip direkam oleh fotodioda. Modulasi yang diinduksi kemudian diekstraksi oleh penguat pengunci. Secara teoritis, kedalaman modulasi yang diinduksi oleh SRL, I SRL / Ip, secara linier sebanding dengan penampang Raman σ , konsentrasi molar molekul target N dan intensitas sinar Stokes, yaitu, I SRL / I p ∝ σ NI S . Sampai saat ini, pencitraan SRS cepat sebagian besar telah diterapkan oleh laser pita sempit pita Raman tunggal yang terisolasi. Namun, tanpa kemampuan untuk menyelesaikan tumpang tindih pita Raman yang disumbangkan oleh molekul target dan komponen jaringan latar belakang, SRS satu warna hanya berlaku untuk mempelajari spesies yang diketahui menggunakan pita Raman yang terisolasi.

Dengan demikian, telah ada upaya besar dalam mengembangkan teknik pencitraan spektroskopi vibrasi berkecepatan tinggi berdasarkan penyetelan spektral laser pita sempit atau eksitasi laser pita lebar (Gambar 1a dan 1b). Hyperspectral SRS 8, 9, 10 atau hamburan anti-Stokes Raman coherent (CARS) 11, 12, 13 mikroskop telah ditunjukkan oleh pemindaian spektral laser pita sempit dan koleksi gambar pada serangkaian pergeseran Raman. Namun demikian, pendekatan ini tidak berlaku untuk organel yang sangat dinamis dalam sel hidup atau benda yang mengalir cepat. Mikroskop multipleks CARS telah dikembangkan oleh deteksi paralel dari sinyal yang tersebar secara spektral menggunakan array perangkat coupled charge yang sensitif, 14, 15 dengan pixel dwell time sesingkat 3, 5 milidetik (ms). 16 Teknik CARS multipleks paling canggih ini telah diterapkan untuk melakukan histologi kimia jaringan biologis tetap. 16 Pencitraan SRS multi-warna telah ditunjukkan dengan menggunakan tiga amplifier lock-in independen. 17 Dengan skema seperti itu, akuisisi spektrum Raman yang lengkap sulit dilakukan. Deteksi paralel sinyal SRS telah ditunjukkan baru-baru ini dengan menggunakan CMOS (semikonduktor oksida logam komplementer) 18 atau penguat multi-saluran, 19 keduanya memiliki sensitivitas deteksi sedang dengan kedalaman modulasi 10 I4 d I / I. Khususnya, frekuensi modulasi maksimum amplifier penguncian multi-saluran saat ini adalah kurang dari 100 kHz. Pada frekuensi modulasi seperti itu, noise laser 1 / f cukup besar, yang membatasi sensitivitas deteksi serta kecepatan pencitraan mikroskop SRS.

Image

Pencitraan spektroskopi SRL berdasarkan deteksi paralel bebas terkunci. ( a ) Dengan ω p - ω disetel ke getaran molekul pada frekuensi frequency, intensitas sinar pompa sedikit menurun oleh SRL dan intensitas sinar Stokes sedikit meningkat oleh SRG. Spektrum SRL dapat dihasilkan dengan memindai pita sempit ω p dengan pita sempit tetap. ( B ) Spektrum SRL dapat dihasilkan dengan eksitasi narrowband dan broadband. ( c ) Deteksi paralel dari sinyal-sinyal SRL yang tersebar secara spektral dengan menggunakan array TAMP. Balok pompa tersebar pada array fotodioda. Bagian AC dari 16 saluran dikirim ke array TAMP. Output dari array TAMP dikirim ke ADC. Bagian DC dikirim langsung ke ADC untuk kalibrasi sinyal AC. ( d ) Gambar digital dari tahap pertama array TAMP. Dimensi saluran tunggal adalah 1, 2 ″ × 1 ″ × 0, 25 ″. AC, arus bolak-balik; ADC, konverter analog-ke-digital; DC, arus searah; SRG, merangsang gain Raman; SRL, merangsang hilangnya Raman; TAMP, amplifier yang disetel.

Gambar ukuran penuh

Di sini, untuk mengatasi keterbatasan yang disebutkan di atas, kami mendemonstrasikan pencitraan spektroskopi SRL dengan deteksi paralel bebas terkunci (Gambar 1b dan Gambar Tambahan. S1). Baru-baru ini kami menunjukkan bahwa sinyal SRS pada frekuensi modulasi laser MHz dapat diekstraksi dan diperkuat oleh sirkuit resonansi, dan kemudian diperbaiki untuk digitasi. 21 Karena sirkuit resonansi pada dasarnya adalah sebuah chip sekecil seperempat, sebuah array dapat dirakit untuk memungkinkan akuisisi paralel dari beberapa sinyal. Kami memanfaatkan kekompakan dari tuned amplifier kami (TAMP) dan membangun array TAMP 16-channel (Gambar 1c dan 1d dan Gambar Tambahan S2), yang memungkinkan deteksi paralel dari sinyal-sinyal SRL yang tersebar secara spektral sekecil 10 −6 d I / I kedalaman modulasi dengan 32 µs pixel dwell time.

HASIL DAN DISKUSI

Membedakan molekul target dari pelarut massal

Skema deteksi spektral kami mampu mengekstraksi sinyal molekul target dari pelarut dalam mikroskop SRL. Kemampuan ini ditunjukkan melalui pencitraan spektroskopi SRL dari larutan DMSO encer. Menggunakan spektrum DMSO dan spektrum air sebagai input untuk fitting kuadrat terkecil, larutan DMSO 1, 6% berhasil didekomposisi menjadi dua peta konsentrasi air dan DMSO (Gambar 2a-2d). Sinyal SRL dari pelarut air didominasi oleh DMSO. Namun demikian, kuadrat terkecil dari gambar mampu mengekstraksi sinyal SRL dari 1, 6% DMSO (d I / I = 5 × 10 −6 ) dari pelarut dan mereproduksi konsentrasi nyata DMSO (Gambar 2e).

Image

Membedakan molekul target dari pelarut dengan pencitraan spektroskopi SRL dan paling tidak kotak kuadrat. ( a ) SRL dan spektrum Raman dari DMSO murni. ( B ) SRL dan spektrum Raman air murni. ( c ) Spektrum SRL dari solusi DMSO 1, 6%, yang merupakan kombinasi linier DMSO dan spektrum SRL air. ( d ) Sinyal SRL dari larutan DMSO 1, 6% diurai menjadi peta kimia DMSO dan air. ( E ) Hubungan linier antara konsentrasi DMSO nyata dan konsentrasi DMSO dipasang berdasarkan pas kuadrat terkecil. Pixel dwell time adalah 32 μs. Skala bar = 10 μm. DMSO, dimethyl sulfoxide; SRL, merangsang hilangnya Raman.

Gambar ukuran penuh

Analisis komposisi tetesan lipid dalam sel hidup tunggal

Platform pencitraan kami mampu menyelesaikan konten dari kompartemen seluler yang dinamis seperti lipid droplet (LD) 25 yang komposisinya terbukti sangat terkait dengan agresivitas sel kanker. 26 CARS dan SRS satu warna telah digunakan untuk mempelajari pertumbuhan dan dinamika LD dalam sel hidup. 27 Multiplex CARS mikroskop lebih lanjut memungkinkan analisis spektral LDs individu dalam sel 3T3-L1 dengan waktu tinggal 20 ms pixel. 14 Di sini, dengan merekam spektrum SRL dalam 32 μs, kami mendemonstrasikan analisis komposisi LDs dalam sel PC3 hidup, garis sel kanker prostat agresif yang diketahui menumpuk lipid. 28 Kami pertama kali memeriksa apakah skema deteksi paralel kami kuat untuk dinamika intraseluler. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar Tambahan. S4 dan Film Tambahan 1, meskipun perdagangan LD intraseluler, spektrum SRL berurutan dari dua LD, satu diam dan satu bergerak, tidak menunjukkan distorsi spektral. Untuk menunjukkan keuntungan dari metode multiplex kami, kami mengeksplorasi potensi distorsi spektroskopi pada frame-by-frame hyperspectral SRS microscopy. Secara singkat, kami memperoleh 16 set gambar SRS spektroskopi dan membangun satu set gambar hyperspectral dengan memilih satu saluran spektral dari masing-masing dari 16 gambar spektroskopi. Karena setiap gambar spektroskopi mengambil 3 detik, waktu akuisisi spektral adalah 48 detik dalam mode hiperspektral frame-by-frame. Distorsi spektral tetesan lipid terlihat jelas, seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan. S5.

Karena cholesteryl ester (CE) dan triglyceride (TG) adalah dua spesies utama dalam LDs, sinyal SRL yang direkam berisi kontribusi dari CE dan TG. Di wilayah 2800 hingga 3000 cm -1, spektrum Raman CE dan TG benar-benar tumpang tindih (Gambar 3a), dan akibatnya, SRS satu warna tidak dapat memberikan informasi komposisi. Skema multipleks kami mengatasi kesulitan ini dengan dekomposisi multivariat dari spektrum yang direkam pada setiap piksel. Untuk analisis kuantitatif, kami mengumpulkan spektra SRL dari emulsi yang terdiri dari cholesteryl oleate dan glyceryl trioleate pada berbagai rasio molar (Gambar 3b) dan menggunakan kuadrat terkecil untuk mengukur persentase CE. Database kalibrasi dibangun untuk memetakan C CE / ( C CE + C TG ), di mana C CE dan C TG adalah konsentrasi pas CE dan TG, masing-masing, dengan persentase molar CE dalam campuran (Gambar 3c). Berdasarkan database ini, kuantifikasi persentase CE dalam tetesan lipid sel PC3 hidup dilakukan, di mana ambang batas digunakan untuk menganalisis secara selektif sinyal dari LDs. Gambar 3d menunjukkan hasil pemasangan kuadrat terkecil yang sesuai dengan rasio C CE / ( C CE + C TG ) dalam sel PC3, menunjukkan lebih dari 75% CE disimpan dalam LDs. Sebagai kontrol, kami memperlakukan sel-sel PC3 dengan avasimibe, inhibitor kuat esterifikasi kolesterol, dan menemukan persentase CE turun menjadi rata-rata kurang dari 25% (Gambar 3e). Untuk mengkonfirmasi persentase CE lebih lanjut, kami juga melakukan analisis spektral Raman spontan dari masing-masing LDs dari sel yang sama menggunakan protokol yang dilaporkan. 28 Persentase CE dipastikan masing-masing adalah ∼ 70% dan ∼ 25% untuk sel-sel PC3 yang diobati secara normal dan avasimibe (Tambahan Gambar. S6). Bersama-sama, data ini menunjukkan kemampuan platform kami untuk kuantifikasi konten kimia bebas label dari organel yang sangat dinamis dalam sel hidup.

Image

Analisis komposisi tetesan lipid dalam sel kanker hidup. ( a ) Spektrum Raman spontan asam TG dan CE. ( B ) Spektrum emulsi SRL terdiri dari TG dan CE pada rasio molar 100: 0, 75:25, 50:50, 25:75 dan 0: 100. ( c ) Database kalibrasi persentase CE dengan fitting kuadrat terkecil. Spektrum campuran adalah kombinasi linear dari spektra TG dan CE yang dikalikan masing-masing dengan koefisien C CE dan C TG . ( d ) Gambar SRL dari satu sel PC3 hidup pada 2874 cm −1 dan peta persentase CE yang sesuai. Untuk fokus pada analisis tetesan lipid, sinyal latar belakang disaring oleh ambang. ( e ) Gambar SRL dari sel PC3 yang diobati dengan avasimibe pada 2874 cm- 1 dan peta persentase CE yang sesuai. Pixel dwell time adalah 32 μs. Skala bar = 10 μm. CE, cholesteryl ester; SRL, merangsang hilangnya Raman; TG, trigliserida.

Gambar ukuran penuh

Memantau konversi metabolisme intraseluler

Metabolisme biasanya diselidiki oleh analisis in vitro sel atau jaringan homogenat. Platform kami membuka kemungkinan untuk memantau konversi metabolisme dalam sel hidup dengan mengidentifikasi metabolit dalam berbagai bentuk. Kami menggunakan metabolisme retinoid sebagai test bed. Retinoid memiliki fungsi penting seperti proliferasi dan diferensiasi sel. 29 Pemahaman terperinci tentang metabolisme retinoid dalam sel kanker hidup akan membuka cara baru untuk mengembangkan pengobatan kanker baru. Di dalam sel, ditetapkan bahwa retinol dehydrogenase mengoksidasi semua-trans retinol menjadi retinaldehyde, yang selanjutnya dimetabolisme menjadi all-trans retinoic acid. 30 Semua-trans retinol dan asam retinoat menunjukkan puncak Raman masing-masing pada 1580 dan 1605 cm -1, yang berbeda dari asil C = C Raman pita tetesan lipid pada 1650 cm -1 di wilayah sidik jari (Gambar 4a). Dengan demikian, dengan secara bersamaan merekam puncak Raman pada 1580 dan 1605 cm- 1, teknik kami dapat memantau metabolisme retinoid di dalam sel hidup. Untuk demonstrasi, kami merawat sel kanker pankreas (MIA PACA-2) dengan 100 μM all-trans retinol selama 24 jam dan melakukan pencitraan spektroskopi sel SRL. Dengan analisis MCR, 23 spektra output menunjukkan tiga puncak Raman yang berbeda pada 1580, 1605 dan 1650 cm- 1 (Gambar 4b), masing-masing sesuai dengan semua-trans retinol, asam retinoat dan lipid. Dalam peta konsentrasi yang sesuai, sel-sel kanker yang dirawat menunjukkan sinyal dari semua-trans retinol dan asam retinoat (Gambar 4c), sedangkan sel-sel kontrol hanya menunjukkan sinyal Raman dari tetesan lipid (Gambar 4d). Data ini secara kolektif menunjukkan potensi pemantauan konversi metabolik dalam sel hidup dengan mikroskop SRS multipleks.

Image

Memantau konversi metabolisme intraseluler. ( a ) Spektrum Raman spontan dari asam retinoat, all-trans retinol dan trigliserida. ( b ) Spektrum keluaran MCR dari semua sel kanker yang diobati dengan transin retinol. Puncak Raman pada 1580 dan 1605 cm- 1 menunjukkan adanya semua-trans retinol dan asam retinoat dalam sel kanker. Puncak 1650 cm −1 dihasilkan dari ikatan asil C = C dalam tetesan lipid. ( c ) Gambar transmisi dan peta konsentrasi MCR dari semua sel kanker yang diobati trans-transinol. ( d ) Gambar transmisi dan peta konsentrasi MCR dari kelompok kontrol. Gambar spektroskopi SRL rata-rata 10 kali, yang menghasilkan 320 µs pixel dwell time. Skala bar = 10 μm. MCR, resolusi kurva multivariat; SRL, merangsang hilangnya Raman.

Gambar ukuran penuh

Diskriminasi tetesan lemak dari organel kaya protein pada C. elegans hidup

Penyimpanan lemak dalam C. elegans adalah parameter kunci untuk studi penuaan dan penyakit lainnya. 31 Mikroskopi CARS 32, 33 atau SRS 6, 34 warna tunggal telah digunakan untuk memvisualisasikan simpanan lemak di dalam C. elegans menggunakan getaran peregangan C – H. Namun, CARS satu warna atau mikroskop SRS tidak dapat membedakan tetesan lemak yang diperkaya dalam kelompok CH 2 dari organel kaya protein yang berlimpah dalam kelompok CH 3 . Di sini, kami mengatasi kesulitan ini dengan pencitraan SRL spektroskopi C. elegans di wilayah getaran lentur C – H, di mana CH 2- kaya lemak dan protein CH- 3 berlimpah menunjukkan spektrum Raman yang khas di jendela 1320–1500 cm −1 ( Gambar Tambahan. S7). Dalam C. elegans , kami mengidentifikasi dua jenis kompartemen, keduanya memiliki tingkat sinyal Raman yang sama tetapi menunjukkan profil spektral yang berbeda (Gambar Tambahan. S8a-S8c). Dengan analisis MCR, sinyal-sinyal ini didekomposisi menjadi tetesan lemak dan organel kaya protein (Gambar Tambahan. S8d-S8f) dengan membandingkan profil spektral mereka dengan trigliserida dan albumin yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan. S7. Tetesan lemak menunjukkan puncak Raman pada 1438 cm- 1, yang merupakan fitur getaran lentur CH 2, sedangkan organel yang kaya protein menunjukkan puncak Raman pada 1448 cm- 1, yang merupakan karakteristik getaran lentur CH 3 . Data ini secara kolektif menunjukkan kemampuan teknik kami untuk menyelesaikan organel intraseluler yang berbeda menggunakan getaran sidik jari molekul intrinsik.

Berikut difusi obat melalui jaringan kulit tikus in vivo

Kami selanjutnya menunjukkan kemampuan platform kami untuk memantau pemberian obat pada hewan hidup. Secara konvensional, pemberian obat topikal dianalisis dengan teknik stripping atau microdialysis. 35 Metode pengupasan pita melibatkan pengangkatan lapisan mikroskopis stratum corneum dan analisis kimia konsekuen dari konsentrasi molekul obat. Dalam teknik mikrodialisis, sebuah probe ditanamkan secara superfisial ke dalam dermis atau subdermis, dan konsentrasi obat dapat dianalisis melalui difusi pasif. Namun, teknik ini invasif dan memakan waktu. Visualisasi real-time difusi obat ke dalam jaringan biologis in vivo memberikan cara non-invasif untuk menilai efisiensi pemberian obat. Mikroskopi SRS satu warna telah digunakan untuk memantau obat yang dideuterasi menggunakan pita vibrasi regangan C-D yang terisolasi. 36 Di sini, kami menunjukkan dalam pemetaan in vivo molekul alami, yang tumpang tindih secara spektral dengan sinyal jaringan, dengan teknik multipleks kami. Kami menerapkan solusi DMSO 100% pada telinga tikus in vivo yang utuh dan memonitor penetrasi DMSO ke jaringan adiposa yang terletak ∼ 50 µm di bawah permukaan kulit. Setiap enam detik, satu citra spektral SRL diperoleh pada kecepatan 3 detik per bingkai 200 × 200 piksel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5a-5d, meskipun spektrum Raman DMSO dan lipid tumpang tindih di wilayah ini dari 2800 hingga 3100 cm- 1, pencitraan spektroskopi SRL, diikuti oleh analisis MCR, memungkinkan kami untuk mendapatkan peta konsentrasi lipid dan DMSO dari waktu ke waktu. . DMSO dalam jumlah sangat kecil menembus ke dalam jaringan adiposa dalam 40 detik pertama. Namun, distribusi DMSO ekstraseluler diamati selama 20 detik berikutnya. Mengikuti dinamika cepat ini merupakan tantangan yang signifikan terhadap teknologi CARS atau SRS frame-by-frame saat ini. Sebaliknya, deteksi paralel pada skala mikrodetik menghilangkan kemungkinan distorsi spektral yang disebabkan oleh dinamika difusi cepat dan gerakan hewan.

Image

Berikut difusi obat melalui jaringan kulit tikus in vivo . ( a ) Peta konsentrasi MCR yang telah lewat waktu dari molekul DMSO. ( B ) peta konsentrasi lipid MCR murtad. ( c dan d ) spektra keluaran MCR dan masing-masing spektrum Raman yang sesuai dari DMSO dan lipid. Pixel dwell time adalah 32 μs. Skala bar = 20 μm. DMSO, dimethyl sulfoxide; MCR, resolusi kurva multivariat.

Gambar ukuran penuh

Analisis spektral throughput tinggi dari mikrosfer yang mengalir cepat dan sel kanker

Flow cytometry adalah teknologi biofisik standar emas yang banyak digunakan dalam penghitungan sel, penyortiran sel, dan analisis sel tunggal kuantitatif. 37, 38 Dengan waktu diam 32 μs, platform kami berpotensi memungkinkan analisis spektral throughput tinggi dari 30.000 objek yang mengalir dalam satu detik. Sebagai bukti konsep, kami melakukan analisis spektral dari campuran mikrosfer mengalir dan poli (metil metakrilat). Mikrosfer yang tersuspensi dalam air dimuat oleh pompa jarum suntik pada kecepatan aliran 1, 0 mm s -1 ke dalam tabung gelas berdiameter 300 μm. Pemindaian laser satu dimensi dilakukan untuk menutupi jendela 50 µm dengan 100 piksel, yang sesuai dengan kecepatan garis 3, 0 ms −1 . Gambar 6a dan Film Tambahan 2 menunjukkan mikrosfer yang terdeteksi dalam waktu akuisisi 300 ms. Profil spektral rata-rata dari posisi 32-37 μm menunjukkan dua spesies berbeda dalam rentang waktu 30-66 ms (Gambar 6b). Analisis MCR selanjutnya memungkinkan kami untuk mendiskriminasi setiap mikrosfer yang dipindai berdasarkan profil spektral (Gambar 6c dan 6d dan Film Tambahan 3). Penting untuk dicatat bahwa spektra output MCR dari kedua mikrosfer statis (Gambar 6d) yang mengalir (Gambar Tambahan. S9) sangat mereproduksi spektrum Raman spontan mereka, memberikan bukti bahwa teknik kami bebas dari artefak gerak. Untuk menunjukkan bahwa sampel biologis yang mengalir cepat juga dapat dianalisis dengan set-up kami, kami memompa sel PC3 dengan kecepatan 0, 5 mm s -1 (Gambar 6e dan Film Tambahan 4). Spektrum rata-rata SRL yang telah lewat waktu dari posisi 25-30 µm dikumpulkan dalam rentang waktu 27-63 ms, dan menunjukkan tiga profil spektral yang berbeda, yang dapat digunakan untuk lipid, protein, dan air (Gambar 6f). Secara kolektif, data ini menunjukkan kemampuan deteksi paralel bebas terkunci untuk analisis spektral throughput getaran tinggi dari objek yang mengalir cepat.

Image

Analisis spektral SRL dari objek yang mengalir cepat. ( a ) Citra SRL time-stack (∼ 300 ms) pada 2914 cm −1 diperoleh dengan jendela pemindaian satu dimensi 50 µm. ( B ) Rata-rata spektrum time-murtad dari posisi 32-37 μm di jendela waktu 30-66 ms. ( c ) Peta konsentrasi MCR yang telah lewat waktu dari mikrosfer PS dan PMMA. ( D ) spektra output MCR dan spektrum Raman yang sesuai. ( e ) Gambar waktu-tumpukan (∼ 300 ms) SRL dari sel PC3 yang mengalir pada 2874 cm −1 . ( f ) Rata-rata spektra time-murtad dari posisi 25-30 μm di jendela waktu 27-63 ms. Pixel dwell time adalah 32 μs. MCR, resolusi kurva multivariat; PMMA, poli (metil metakrilat); PS, polystyrene; SRL, merangsang hilangnya Raman.

Gambar ukuran penuh

Pekerjaan saat ini menunjukkan platform untuk akuisisi spektrum SRL pada waktu tinggal 32 μs. Sensitivitas deteksi array amplifier yang disetel kami lebih baik daripada array amplifier lock-in yang dilaporkan 19 dan teknologi CMOS kamera 18 oleh hampir dua urutan besarnya. Untuk mikroskop SRS satu-warna, sensitivitas deteksi retinol 50 µM atau larutan metanol 5 mM dilaporkan oleh Freudiger et al . 3 dengan waktu integrasi 1 menit. Batas konsentrasi 5 mM untuk kolesterol dilaporkan oleh Freudiger et al. dicapai pada waktu integrasi 1 detik. 39 Di sini kami mencapai sensitivitas solusi DMSO 160 mM pada waktu integrasi 32 μs. Pada waktu integrasi 1 detik, rasio sinyal terhadap noise kami akan ditingkatkan 176 kali dalam teori, yang sesuai dengan sensitivitas deteksi 0, 9 mM. Dengan demikian, sensitivitas deteksi set SRS multipleks kami berada pada level yang sama dengan SRS satu warna. Sensitivitas ini sebagian dikontribusikan oleh deteksi terbatas tembakan-bising dan sebagian melalui analisis MCR dari seluruh kumpulan data.

Teknik multiplex SRL kami mendorong kecepatan akuisisi spektral Raman ke skala mikrodetik dibandingkan dengan mikroskop CARS multipleks yang canggih, yang membutuhkan waktu diam pixel 3, 5 ms. 16 Salah satu faktor kunci untuk perbaikan ini dikontribusikan oleh osilator lokal yang kuat dalam skema deteksi SRS. Secara teori, sensitivitas deteksi SRS dan CARS di bawah kondisi tembakan terbatas sebanding. 5 Dalam mikroskop CARS multipleks dengan susunan perangkat yang digabungkan dengan muatan khusus, diperlukan waktu diam milidetik untuk mencapai batas noise tembakan. 40 Dalam kasus kami, delapan dari enam belas saluran spektral menunjukkan deteksi terbatas noise tembakan pada waktu tinggal piksel 32 µs. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan. S2d, noise elektronik 0, 68 nV Hz -1 / 2 dalam sistem kami berhubungan dengan besarnya noise yang ditembakkan ketika daya osilator lokal 0, 2 mW menyala pada satu saluran spektral. Mempertimbangkan efisiensi kuantum 0, 5 A / W dari fotodioda dan impedansi masukan 1, 0 kΩ dari TAMP, setiap saluran spektral dengan output DC yang lebih tinggi dari 0, 1 V harus didominasi oleh suara tembakan laser. Oleh karena itu, berdasarkan pada spektrum DC yang ditunjukkan pada Gambar Tambahan. S3b, noise tembakan lebih besar daripada noise elektronik dalam saluran spektral 4–11. Selain itu, total noise per saluran menentukan sensitivitas deteksi kami. Untuk saluran pusat 7 dan 8, total kebisingan adalah 1, 16 nV Hz −1/2 . Pada konstanta waktu 32 μs, noise ini berhubungan dengan kedalaman modulasi I / I 2, 6 × 10 −6 d. Tidak dapat dihindari, saluran spektral di tepian menerima daya osilator lokal yang lebih rendah dan karenanya menderita noise elektronik yang tinggi. Masalah ini dapat diatasi dengan menggunakan sumber laser dengan bandwidth yang lebih luas.

Platform kami dapat digunakan untuk memantau respons sel tunggal terhadap rangsangan eksternal (misalnya, pemuatan mekanik) atau intervensi (misalnya, terapi obat) dengan resolusi spasial dan temporal yang tinggi. Seiring dengan omics dan teknologi pengurutan sel tunggal, metode untuk analisis sel telah maju secara signifikan. Namun, masih ada kesulitan dalam memantau dinamika spasial temporal sel dalam lingkungan jaringan yang utuh. Untuk pencitraan real-time protein dan dinamika RNA dalam sel hidup, mikroskop fluoresensi adalah metode yang lebih disukai. Namun, label-label fluoresen terlalu besar untuk molekul-molekul kecil (mis., Asam lemak, asam amino, kolesterol, glukosa, obat-obatan) yang memainkan peran kunci dalam kelangsungan hidup dan perkembangbiakan sel. Platform pencitraan spektroskopi vibrasional bebas label yang dilaporkan, dengan kemampuannya untuk membedakan konten kimia dalam waktu nyata, memungkinkan seseorang untuk memvisualisasikan respons sel hidup tunggal pada tingkat molekuler. Salah satu aplikasi yang potensial adalah pencitraan tanpa label dari penyimpanan kolesterol di dalam sel-sel hidup sebagai respons terhadap mutasi gen atau terhadap terapi obat penurun kolesterol. Aplikasi contoh lainnya adalah memetakan organisasi sel otot polos vaskular sebagai respons terhadap stres mekanik.

Selain itu, platform pencitraan kami memungkinkan pemantauan difusi molekul alami yang tumpang tindih secara spektral dengan sinyal jaringan dengan bantuan analisis multivariat dari spektrum SRL yang diurutkan waktu. Karena proses difusi sangat dinamis pada skala kedua, mikroskop SRS frame-by-frame hiperspektral rentan terhadap distorsi spektral yang disebabkan oleh dinamika difusi cepat dan gerakan hewan hidup. Teknik kami mengatasi kesulitan ini dengan perekaman spektral paralel pada skala μs. Pengembangan di masa depan dari sebuah mikroskop SRL multipleks yang telah dilaporkan dapat memungkinkan penilaian lebih lanjut tentang ketersediaan hayati obat lokal dalam jaringan yang tidak transparan seperti kulit manusia.

Studi kami juga membuka jalan untuk penerapan sitometri spektroskopi bebas label. Sitometri aliran berbasis fluoresensi saat ini membutuhkan label fluoresen dan terbatas pada deteksi paralel sejumlah kecil spesies. Selain itu, label dapat mengubah kimia seluler dan mengganggu hasil eksperimen. 41 Sitometri aliran bebas-label berdasarkan getaran molekuler telah ditunjukkan baru-baru ini. Misalnya, Lau et al . 42 berhasil menunjukkan pemisahan dua populasi sel limfositik dengan analisis komponen utama spektrum Raman di bawah waktu integrasi 120-an per sel. Dengan multiplex CARS, Camp et al. memisahkan dua subpopulasi sel ragi berdasarkan foton yang tersebar ke depan dan spektrum CARS yang terdeteksi ke depan pada waktu tinggal 10-ms pixel. 43 Teknik multiplex SRL kami menawarkan kecepatan akuisisi data yang sebanding dengan penyortir sel berbasis fluoresensi tipikal dengan kemampuan potensial untuk menggali 100.000.000 objek per detik. Dalam karya ini, kami mengeksplorasi kelayakan dengan menggunakan pemindaian laser satu dimensi dan mengumpulkan spektrum SRL dari sel tumor tunggal yang mengalir cepat. Mengambil keuntungan dari fakta bahwa sinyal SRS selalu cocok dengan fase dan dengan demikian memungkinkan geometri balok collinear dalam kondisi yang fokusnya lemah, pengembangan di masa depan akan melibatkan sinar laser yang fokus lemah dan fokus hidrodinamik dari sel yang mengalir untuk menerangi seluruh sel satu per satu dalam 32 μs. Dibantu oleh analisis multivariat, penyortir sel spektroskopi SRS menandai potensi perbedaan populasi sel berdasarkan pada kandungan kimianya yang melekat.

Kami mencatat bahwa ada banyak ruang untuk meningkatkan teknologi kami. Dalam set-up kami, kami menyebarkan sinyal pada array fotodioda 35-elemen dan hanya menggunakan 16 saluran dari 35 elemen ini. Lebih dari 50% sinyal tidak digunakan. Hasilnya, kami dapat memiliki 35 kanal spektral pada level daya pompa yang sama dan dengan level rasio sinyal-ke-noise yang sama. Teknologi ini juga mudah diukur. Bersama-sama dengan sumber laser broadband yang sesuai, rangkaian TAMP dari 128 saluran dapat dibuat untuk mencakup seluruh wilayah sidik jari tanpa menambah waktu perolehan data. Selain itu, waktu tunda 32-µs piksel dapat dikurangi lebih lanjut. Faktor pembatas kecepatan akuisisi spektral kami adalah papan akuisisi data yang digunakan dalam penelitian kami. Papan ini memberikan input 32-saluran dengan laju pengambilan sampel total 1 MHz. Dengan menggunakan papan akuisisi data yang lebih cepat dengan laju pengambilan sampel GHz, kami berpotensi mengurangi waktu akuisisi spektral menjadi kurang dari 1 μs.

KESIMPULAN

Kami telah menunjukkan susunan TAMP 16-kanal yang memungkinkan akuisisi satu spektrum SRS, dalam jendela yang ditentukan oleh pulsa broadband, pada kecepatan 32 μs. Skema deteksi paralel kami memungkinkan pencitraan bahan kimia dari sistem yang sangat dinamis berdasarkan pita Raman yang tumpang tindih secara spektral. Kemajuan ini memungkinkan kami untuk memetakan komposisi organel yang sangat dinamis, misalnya, persentase kolesterol yang disimpan dalam tetesan lipid, dalam sel hidup tunggal, yang sangat penting untuk evaluasi agresivitas sel kanker. Kami juga menunjukkan potensi untuk memantau metabolisme retinoid dalam sel kanker hidup. Selain itu, kami menunjukkan dalam pencitraan in vivo difusi obat ke dalam jaringan biologis, yang berpotensi dapat lebih memungkinkan penilaian in vivo ketersediaan hayati obat lokal di kulit manusia. Selain itu, kami menunjukkan analisis spektral sel yang mengalir cepat oleh platform kami. Kemampuan ini membuka peluang untuk menerapkan sitometri spektroskopi label bebas untuk analisis throughput tinggi sel tunggal (misalnya, sel tumor yang bersirkulasi) berdasarkan kandungan kimianya. Secara kolektif, upaya ini berpotensi mendorong spektroskopi Raman, yang terutama digunakan untuk pengukuran titik atau pencitraan kimia spesimen tetap, menuju pemetaan komposisi / fungsional kompartemen intraseluler atau profil spektral sel yang mengalir dengan cara throughput yang tinggi.

KONTRIBUSI PENULIS

Mikhail N. Slipchenko dan Chien-Sheng Liao merancang eksperimen. Robert A. Oglesbee merancang sirkuit elektronik. Chien-Sheng Liao, Ping Wang, Junjie Li dan Seung-Young Lee melakukan percobaan. Chien-Sheng Liao melakukan analisis data. Ji-Xin Cheng menyusun konsep dan memberikan panduan keseluruhan untuk proyek ini. Semua penulis mendiskusikan hasil dan berkontribusi pada naskah.

Informasi tambahan

Dokumen Word

  1. 1.

    Informasi tambahan

File gambar

  1. 1.

    Informasi tambahan

  2. 2.

    Informasi tambahan

  3. 3.

    Informasi tambahan

  4. 4.

    Informasi tambahan

    Catatan: Informasi Tambahan untuk artikel ini dapat ditemukan di situs web Light: Science & Applications ' (//www.nature.com/lsa/).