Migrasi lipid pip2 pada permukaan saluran gasium yang dipengaruhi tegangan memengaruhi penonaktifan saluran | laporan ilmiah

Migrasi lipid pip2 pada permukaan saluran gasium yang dipengaruhi tegangan memengaruhi penonaktifan saluran | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Biologi komputasi dan bioinformatika
  • Lemak
  • Biofisika membran
  • Biofisika molekuler

Abstrak

Studi yang dipublikasikan tentang interaksi lipid-protein terutama berfokus pada pengikatan lipid ke satu lokasi protein. Di sini, kami menunjukkan bahwa lipid dapat bermigrasi antara berbagai situs pengikatan dalam protein dan migrasi ini memodulasi fungsi protein. Saluran potassium (Kv) tegangan-gated memiliki beberapa situs mengikat potensial untuk phosphatidylinositol-4, 5-bifosfat (PIP 2 ). Simulasi dinamika molekul (MD) kami pada saluran KCNQ2 mengungkapkan bahwa PIP 2 secara istimewa mengikat ke linker S4-S5 ketika saluran tersebut dalam keadaan terbuka sambil mempertahankan probabilitas tertentu untuk bermigrasi ke linker S2-S3. Dipandu oleh hasil MD, percobaan electrophysiological menggunakan saluran KCNQ2, KCNQ1, dan hERG menunjukkan bahwa migrasi PIP 2 menuju linker S2-S3 mengontrol laju penonaktifan saluran. Data menunjukkan bahwa PIP 2 dapat bermigrasi antara situs pengikatan yang berbeda di saluran Kv dengan dampak signifikan pada penonaktifan saluran, memberikan wawasan baru ke dalam dinamika dan fungsi fisiologis interaksi protein-lemak.

pengantar

Gating adalah salah satu sifat dasar yang menentukan fungsi saluran ion 1 . Channel gating umumnya mencakup proses aktivasi dan deaktivasi 2, 3 . Dipercayai bahwa segmen transmembran S4 dan S6, serta penghubung S4-S5, saluran kalium berpagar tegangan (Kv) membentuk faktor penentu struktural utama dari aktivasi saluran 4, 5, 6, 7, 8, 9, setelah dimana gerakan luar S4 mengencangkan linker S4-S5, mengganggu linker-S6-helix packing 9, 10, 11 . Juga telah diketahui bahwa membran plasma minor phospholipid, phosphatidylinositol-4, 5-bifosfat (PIP 2 ) dapat secara signifikan mempengaruhi parameter aktivasi (misalnya amplitudo saat ini dan sensitivitas tegangan) saluran Kv dengan berinteraksi langsung dengan faktor-faktor penentu struktural ini 12, 13 . Sebaliknya, meskipun ada apresiasi yang meningkat pada efek PIP 2 dan lipid lain pada aktivasi saluran 14, 15, 16, sedikit yang diketahui tentang bagaimana lipid mengatur penonaktifan saluran ion 17 .

Deaktivasi lambat adalah salah satu properti gating khas dari "arus M" (misalnya saluran Kv7 atau KCNQ) dan saluran kalium hERG, yang menghasilkan arus "ekor" besar dalam menanggapi repolarisasi tegangan membran 18, 19 . Deaktivasi lambat dan arus ekor besar memainkan peran penting dalam lambat setelah hiperpolarisasi (AHP) yang terkait dengan potensial aksi dari beberapa jenis neuron dan menentukan panjang gelombang QT dari miosit jantung 20, 21 . Saat ini, mekanisme molekuler yang mendasari proses penutupan saluran yang lambat ini masih belum jelas. Seperti dalam proses pembukaan (aktivasi) saluran, interaksi saluran lipid juga dapat memainkan peran penting dalam proses penutupan (penonaktifan). Tes hipotesis ini harus mengungkapkan fungsi baru lipid dalam pengaturan fisiologi saluran ion.

Interaksi lipid-protein bersifat dinamis karena interaksi ini biasanya terjadi pada celah permukaan protein dangkal daripada di dalam kantong 22, 23, 24, 25 . Namun, sedikit yang diketahui tentang dinamika interaksi lipid-protein meskipun baru-baru ini terjadi kemajuan dalam mengidentifikasi situs pengikatan lipid potensial pada saluran ion. Serupa dengan studi tentang interaksi ligan-protein, penelitian yang diterbitkan tentang interaksi saluran lipid terutama berfokus pada pengikatan lipid ke situs individu dari saluran protein 26, 27 . Memanfaatkan hasil fungsional dan struktural yang kaya pada saluran Kv, simulasi dinamika molekul (MD) memungkinkan visualisasi dari beberapa transisi dinamis dan transformasi konformasi besar antara keadaan diaktifkan dan dinonaktifkan 9, yang bila dikombinasikan dengan pendekatan fungsional, kemungkinan akan memberikan penerangan mendalam dari pengaruh integral PIP 2 pada saluran Kv, termasuk bagaimana mengatur proses penonaktifan lambat.

Baru-baru ini, dengan menggabungkan simulasi 200-ns MD, mutagenesis terarah-situs, dan tes elektrofisiologi, kami mengidentifikasi situs interaksi PIP 2 pada kedua linker S4-S5 dan linker S2-S3 dari saluran KCNQ2, dan menemukan bahwa PIP 2 memengaruhi aktivasi. saluran KCNQ2 berbeda dari saluran Shaker dan Kv1.2 28 . Di sini, kami melakukan simulasi MD baru dan lebih lama (mikrodetik) untuk memeriksa dinamika interaksi PIP 2 dengan keadaan terbuka dan tertutup saluran KCNQ2. Kami mengamati bahwa meskipun PIP 2 secara istimewa mengikat ke linker S4-S5 dalam keadaan terbuka, itu menunjukkan kemungkinan untuk bermigrasi ke linker S2-S3, di mana lipid berada dalam keadaan tertutup. Migrasi dihapuskan oleh netralisasi muatan positif pada tautan S2-S3, yang menunjukkan bahwa PIP 2 dapat bermigrasi di antara berbagai situs pengikatan di saluran Kv dan muatan positif di tautan S2-S3 sangat penting untuk fungsi ini. Dipandu oleh hasil MD, kami kemudian melakukan percobaan elektrofisiologi pada tipe liar (WT) dan mutan saluran KCNQ2, KCNQ1 dan hERG dan menunjukkan bahwa migrasi PIP 2 secara signifikan berdampak pada kinetika penonaktifan.

Hasil

PIP 2 bermigrasi antara tautan S2-S3 dan tautan S4-S5 dalam keadaan terbuka KCNQ2

Pertama, kami melakukan simulasi panjang, semua-atom, MD pada keadaan terbuka saluran KCNQ2. Model keadaan terbuka dibangun menggunakan struktur kristal Kv1.2 (PDB kode 2A79) 29 dan saluran KcsA K + yang diaktifkan (PDB kode 3PJS) 30 . Sebelumnya, kami menggunakan model ini untuk berhasil mengidentifikasi situs pengikatan ztz240 (aktivator KCNQ2) dan situs interaksi PIP 2 di saluran KCNQ2 28, 31 . Untuk memantau dinamika interaksi PIP 2 dengan saluran, kami menempatkan empat molekul PIP 2 dalam leaflet bilayer POPC yang jauh dari saluran. Jarak antara PIP 2 dan saluran setidaknya 15 Å (Gambar Tambahan 1a). Sistem ini menjadi sasaran dua simulasi MD 1-μs independen. Untuk meningkatkan kekuatan statistik dari simulasi, kami juga membangun sistem lain, di mana molekul PIP 2 terletak setidaknya 20 Å dari saluran. Dua simulasi 1-μs MD independen juga dilakukan pada sistem ini (Gambar Tambahan 1b).

Dari empat simulasi MD independen, kami menangkap lintasan gerak total 16 molekul PIP 2 (Gbr. 1), yang dapat dibagi menjadi tujuh jenis: (1) tiga molekul PIP 2 berinteraksi dengan K230 dan akhirnya stabil di S4- Penghubung S5; (2) dua molekul PIP 2 pindah ke penghubung S2-S3 dan langsung berinteraksi dengan residu dalam penghubung; (3) dua molekul PIP 2 pindah ke linker S4-S5 pada awalnya tetapi kemudian bermigrasi dan distabilkan pada linker S2-S3; (4) berbeda dengan tipe 3, tiga molekul PIP 2 pindah ke linker S2-S3 pada awalnya dan kemudian bermigrasi ke dan distabilkan pada linker S4-S5; (5) dua molekul PIP 2 pindah ke penghubung S4-S5 pada awalnya dan kemudian bergerak bolak-balik antara penghubung S2-S3 dan penghubung S4-S5 tanpa menstabilkan di kedua situs; (6) dua molekul PIP 2 pindah ke linker S2-S3 pada awalnya dan kemudian bergerak bolak-balik antara linker S4-S5 dan linker S2-S3 tanpa menstabilkan di kedua situs; dan (7) dua molekul PIP 2 pindah ke penghubung S4-S5 dan berinteraksi dengan K230 pada awalnya, tetapi ketika waktu simulasi berlangsung, mereka secara bertahap terlepas dari domain ini dan pindah ke lingkungan membran dan kemudian bergerak bolak-balik antara S4- S5 linker dan lingkungan membran selama waktu simulasi 1-μs. Secara statistik, simulasi MD menyarankan bahwa PIP 2 istimewa berinteraksi dengan S4-S5 linker di saluran KCNQ2 keadaan terbuka. Namun, fosfolipid tidak selalu melekat pada penghubung, dengan 9 dari 16 molekul PIP 2 menunjukkan gerakan migrasi antara penghubung S4-S5 dan penghubung S2-S3. Selama simulasi MD yang lama ini, ada banyak kontak PIP 2 dan residu bermuatan positif. Secara umum, molekul PIP 2 terutama tinggal di tiga model pengikat yang kontak dengan saluran KCNQ2 selama migrasi antara penghubung S4-S5 dan penghubung S2-S3: PIP 2 mengikat dengan penghubung S4-S5, PIP 2 mengikat secara bersamaan dengan penghubung S4-S5 dan S2-S3 linker, dan PIP 2 mengikat dengan S2-S3 linker (Tambahan Gambar. 2).

Image

( a, b ) Simulasi di mana jarak awal antara molekul PIP 2 dan saluran setidaknya 15 Å. ( c, d ) Simulasi di mana jarak awal antara molekul PIP 2 dan saluran setidaknya 20 Å. Garis warna (kode warna dari biru tua ke merah) menunjukkan distribusi posisi 4′-fosfat dari PIP 2 selama simulasi 1-μs pada interval 200 ps. Posisi awal (biru tua) dan akhir (merah) dari molekul 4′-fosfat PIP 2 ditampilkan sebagai bola. Cuplikan terakhir saluran KCNQ2 ditampilkan sebagai pita, dan residu kritis yang berinteraksi dengan molekul PIP 2 dalam simulasi disajikan sebagai batang magenta. Panah hitam menunjukkan tren umum untuk pergerakan molekul PIP 2 .

Gambar ukuran penuh

Selanjutnya, kami berusaha menentukan apakah PIP 2 juga bermigrasi di permukaan saluran KCNQ2 keadaan tertutup. Untuk melakukan ini, dua sistem simulasi saluran tertutup KCNQ2 dibangun dengan posisi awal molekul PIP 2 ditempatkan mirip dengan simulasi saluran keadaan terbuka. Molekul PIP 2 ditempatkan dalam leaflet bilayer POPC setidaknya 15 Å atau 20 Å dari saluran (Tambahan Gambar. 1c, d). Struktur kondisi tertutup KCNQ2 dibangun berdasarkan konformasi kondisi tertutup saluran kimik Kv1.2 / Kv2.1 yang dilaporkan oleh Jensen et al. 9 dan struktur kristal saluran KcsA tertutup (kode PDB: 3EFF) 32 . Gambar 2 menunjukkan lintasan difusi dari delapan molekul PIP 2 dalam dua, independen, simulasi 1-μs MD. Semua molekul PIP 2 pindah ke linker S2-S3 dan berinteraksi dengan residu bermuatan positif, seperti R158, R160 atau K162. Tak satu pun dari molekul PIP 2 yang berangkat dari linker S2-S3 setelah ia membentuk interaksi dengan linker. Hasil MD ini menunjukkan bahwa dalam saluran KCNQ2 keadaan tertutup, tidak hanya PIP 2 mendukung pengikatan ke tautan S2-S3, tetapi juga lipid tidak bermigrasi pada permukaan saluran.

Image

Posisi awal molekul PIP 2 dalam setiap simulasi setidaknya 15 Å ( a ) dan 20 Å ( b ) dari saluran KCNQ2 yang tertutup. Semua molekul PIP 2 pindah ke linker S2-S3 dalam simulasi 1-μs. Gaya tampilan sama seperti pada Gambar. 1.

Gambar ukuran penuh

Residu yang bermuatan positif di linker S2-S3 memodulasi migrasi PIP 2

Umumnya, residu yang bermuatan positif bertanggung jawab atas ikatan PIP 2 dengan protein saluran. Oleh karena itu, muatan positif pada tautan S4-S5 dan tautan S2-S3 harus dilibatkan dalam interaksi dengan PIP 2 dan migrasi antara kedua domain ini di saluran keadaan terbuka. Untuk menguji ide ini, kami melakukan simulasi 1-μs lainnya pada keadaan terbuka saluran KCNQ2 bermutasi, di mana semua residu bermuatan positif dalam linker S2-S3 (R153, R155, R158, R160, K162, R165, dan K166) dinetralkan oleh substitusi dengan alanin (A) (Gambar Tambahan 1e). Dalam simulasi ini, semua molekul PIP 2 bergerak menuju posisi dekat K230 dalam penghubung S4-S5 dan membentuk interaksi dengan residu terdekat. Tidak ada dari mereka yang pindah ke linker S2-S3 atau bermigrasi antara linker S4-S5 dan linker S2-S3 (Gambar Tambahan 3). Oleh karena itu, residu S2-S3 linker bermuatan positif memang penting untuk migrasi PIP 2 dari S4-S5 linker ke S2-S3 linker di saluran open state. Namun, mutagenisasi semua residu bermuatan positif ke alanin dapat mengganggu fungsi normal saluran. Untuk meminimalkan kemungkinan ini, kami selanjutnya mempelajari apakah satu mutasi mempengaruhi migrasi PIP 2 .

Simulasi MD pada saluran WT menunjukkan bahwa PIP 2 dapat sering berinteraksi dengan R160 pada linker S2-S3. Kami kemudian mempelajari interaksi PIP 2 dengan mutan R160A dari saluran KCNQ2. Mirip dengan simulasi yang dilakukan pada saluran WT yang ditunjukkan pada Gambar. 1, empat simulasi MD dilakukan pada mutan R160A (Tambahan Gambar. 1f, g). Dibandingkan dengan saluran WT, lebih banyak molekul PIP 2 berinteraksi dengan K230 dan akhirnya stabil di penghubung S4-S5 (Gbr. 3). Konsisten dengan penurunan afinitas pada PIP 2 pada linker S2-S3, probabilitas migrasi untuk PIP 2 antara linker S4-S5 dan linker S2-S3 lebih rendah pada mutan R160A daripada saluran WT dalam stimulasi ini. Hanya tiga dari enam belas molekul PIP 2 yang menunjukkan pergerakan migrasi pada mutan R160A. Tambahan Tabel 1 menunjukkan persentase waktu selama simulasi ketika molekul PIP 2 tinggal di membran, dihubungi dengan penghubung S4-S5, dihubungi dengan penghubung S2-S3, dan secara bersamaan berinteraksi dengan penghubung S4-S5 dan S2-S3 linker, untuk saluran WT KCNQ2 dan mutan R160A. Hasil ini dengan jelas mengungkapkan penurunan kuantitatif dalam probabilitas migrasi PIP 2 ke linker S2-S3 dari mutan R160A.

Image

( a, b ) Simulasi di mana jarak awal antara molekul PIP 2 dan saluran setidaknya 15 Å. ( c, d ) Simulasi di mana jarak awal antara molekul PIP 2 dan saluran setidaknya 20 Å. Gaya tampilan sama seperti pada Gambar. 1.

Gambar ukuran penuh

Validasi fungsional untuk prediksi MD

Transisi konformasional dari linker S4-S5 berikut perubahan potensial membran sangat penting untuk saluran Kv channel 9 . Simulasi MD yang dilakukan di atas menunjukkan bahwa PIP 2 berinteraksi dengan penghubung S4-S5 hanya dalam keadaan terbuka saluran KCNQ2, yang dapat menjadi penting untuk stabilitas sensor tegangan dalam keadaan terbuka 28 . Dengan demikian, pengikatan PIP 2 pada penghubung S4-S5 dapat menghadirkan hambatan struktural untuk transisi dari keadaan terbuka ke keadaan tertutup dan laju disosiasi PIP 2 dari wilayah ini harus memengaruhi proses penutupan saluran, yaitu penonaktifan saluran. . Hasil simulasi MD menunjukkan bahwa migrasi PIP 2 dari linker S4-S5 ke linker S2-S3 memfasilitasi disosiasi dari linker S4-S5. Oleh karena itu, sangat masuk akal bahwa mengganggu ikatan PIP 2 baik pada linker S2-S3 atau linker S4-S5 harus memengaruhi migrasi PIP 2 dan dengan demikian berdampak pada kinetika penonaktifan saluran KCNQ2. Misalnya, menetralkan residu yang bermuatan positif pada penghubung S4-S5, misalnya K230, harus melemahkan interaksi PIP 2 di wilayah ini dan mendorong lipid lebih jauh ke arah penghubung S2-S3, yang akan mempercepat penutupan saluran. Sebaliknya, menetralkan residu bermuatan positif pada linker S2-S3 harus menghambat pemisahan PIP 2 dari linker S4-S5, dan dengan demikian memperlambat proses penutupan. Untuk memverifikasi hipotesis ini, kami membuat serangkaian mutasi substitusi muatan baik di S4-S5 linker atau S2-S3 linker dari saluran KCNQ2 dan membandingkan kinetika deaktivasi mereka dengan saluran WT dengan seluruh rekaman sel penjepit patch setelah ekspresi heterolog dalam Sel CHO.

Untuk mengukur kinetika deaktivasi saluran KCNQ2, langkah tegangan dari −80 mV ke +40 mV diterapkan untuk mendapatkan arus. Kemudian langkah tegangan penutup dari +40 mV turun ke −60 mV diterapkan untuk memungkinkan pengembangan arus buntut, yang dilengkapi dengan persamaan eksponensial tunggal untuk mendapatkan konstanta waktu penonaktifan. Karena mutan K230N ditampilkan sangat kecil hingga hampir tidak ada arus yang dapat diukur, kami bersama-sama menyatakan PI (4) 5-kinase (PI5K) untuk meningkatkan konsentrasi PIP 2 dalam sel, yang, konsisten dengan laporan sebelumnya 28, 33, menghasilkan peningkatan amplitudo arus steady state (Gambar Tambahan 4). Dalam kondisi ini, konstanta waktu penonaktifan K230N (15, 3 ± 1, 6 ms) secara signifikan lebih kecil daripada saluran WT KCNQ2 (77, 1 ± 7, 4 ms) (Gambar 4a-c dan Tabel Tambahan 2). Hasil ini mendukung prediksi MD bahwa menetralkan K230 pada linker S4-S5 akan mendorong PIP 2 lebih jauh ke arah linker S2-S3 dan pada gilirannya mempercepat laju penutupan saluran.

Image

( a, b ) Arus sel utuh dicatat dari sel CHO yang mengekspresikan saluran WT dan K2NN KCNQ2 mutan yang berlebih. Arus ditimbulkan oleh langkah tegangan depolarisasi dari potensi holding −80 mV hingga 40 mV dan kemudian turun menjadi −60 mV. Konstanta waktu penonaktifan diperoleh dengan kecocokan eksponensial dari arus ekor yang ditunjukkan oleh lingkaran. PI4 (5) -kinase (PI5K) secara bersamaan diekspresikan untuk memungkinkan pengembangan saat ini dari mutan K230N. ( c ) Statistik konstanta waktu deaktivasi WT KCNQ2 dan mutan K230N-nya. ( d, e ) Contoh-contoh dari arus sel utuh yang disalut untuk WT KCNQ2 dan mutan R155L dan R160L. Perbedaan dalam tingkat deaktivasi ditekankan oleh lingkaran. ( f ) Statistik konstanta waktu deaktivasi WT KCNQ2 dan muatan individual menetralkan mutasi pada linker S2-S3 seperti yang ditunjukkan. ** P <0, 01, sangat berbeda dari WT oleh paired t -test.

Gambar ukuran penuh

Kami kemudian mempelajari dampak netralisasi muatan pada tautan S2-S3 pada kinetika penonaktifan KCNQ2. Kami menguji mutasi R155L, R158L, R160L, K162L, dan R165L secara individual. Meskipun tidak ada mutasi yang mengubah amplitudo saat ini (Gambar Tambahan. 4), mereka semua menunjukkan kecenderungan untuk memiliki proses penonaktifan yang lebih lambat dengan konstanta waktu penonaktifan R155L, R160L, dan R165L secara signifikan lebih lambat daripada saluran WT KCNQ2 ( Gambar. 4d – f dan Tambahan Tabel 2). Hasil ini juga konsisten dengan prediksi oleh simulasi MD, menunjukkan bahwa K230 pada linker S4-S5 penting untuk mempertahankan proses penutupan, sedangkan R155, R160, dan R165 semuanya berkontribusi untuk memfasilitasi penutupan saluran dengan mempromosikan migrasi PIP 2 ke tautan S2-S3.

Efek migrasi PIP 2 dinamis pada kinetika deaktivasi saluran Kv terkait

Setelah menunjukkan pentingnya migrasi dinamis PIP 2 di permukaan sitoplasmik saluran KCNQ2 dalam regulasi penonaktifan, kami berupaya menentukan apakah mekanisme ini juga beroperasi di saluran kalium lain yang terjaga tegangannya. Kami pertama kali menguji saluran KCNQ1, yang termasuk keluarga Kv7 yang sama dengan saluran KCNQ2. Namun, meskipun linker S2-S3 dari KCNQ1 sangat homolog dengan KCNQ2, ia mengandung lebih sedikit residu yang bermuatan positif. Secara khusus, residu yang sesuai dengan R155 dan R158 dari KCNQ2 adalah netral di KCNQ1 (masing-masing V185 dan W188). Jika linker S2-S3 KCNQ1 memiliki peran yang sama dengan KCNQ2 dalam memodulasi penutupan saluran, maka bermutasi V185 dan W188 menjadi residu yang bermuatan positif harus meningkatkan laju penutupan. Tidak mengherankan, percobaan mutagenesis dan elektrofisiologi kami menunjukkan penurunan yang signifikan dalam konstanta waktu penonaktifan V185R atau W188R menjadi sekitar setengah dari saluran WT KCNQ1 (Gbr. 5a-c dan Tabel Tambahan 3).

Image

( a ) Jejak representatif dari arus yang direkam dari sel CHO yang mengekspresikan saluran WT dan KCNQ1 mutan secara berlebihan. Sel ditahan pada −80 mV, dan arus ditimbulkan oleh langkah tegangan depolarisasi hingga 40 mV dan kemudian turun ke −60 mV. ( B ) Arus ekor dinormalisasi untuk membandingkan proses penonaktifan antara WT dan saluran KCNQ1 mutan. ( c ) Pengenalan muatan positif ke penghubung S2-S3, V185R atau W188R, secara signifikan mempercepat proses penutupan KCNQ1, sebagaimana ditunjukkan oleh konstanta waktu penonaktifan yang menurun. ( d, e ) Arus sel utuh dicatat dari CHO yang mengekspresikan saluran HERG WT dan mutan secara berlebihan. Sel ditahan pada −80 mV. Langkah-langkah tegangan dari −80 mV ke +60 mV dengan penambahan 20 mV diterapkan selama 800 ms sebelum mundur ke −60 mV. ( f ) Mutasi W497K pada tautan S2-S3 dari saluran hERG secara signifikan mempercepat proses penutupannya. Konstanta waktu penonaktifan pada awalnya diukur dengan pemasangan dua-eksponensial, dan kemudian dibandingkan dengan konstanta waktu tertimbang (lihat detail dalam Metode Online). * P <0, 05; ** P <0, 01, sangat berbeda dari WT, dengan uji-t berpasangan.

Gambar ukuran penuh

Dari penjajaran urutan tautan S2-S3 dari saluran Kv yang dikenal umum 28, 34, kami melihat pemisahan yang jelas dari dua jenis saluran Kv: satu berisi 11 residu asam amino (loop pendek) sementara yang lain memiliki 20-24 residu (panjang lingkaran). Kami bertanya-tanya apakah saluran S2-S3 panjang, termasuk keluarga Kv7 dan saluran hERG, semuanya memiliki mekanisme regulasi PIP 2 yang sama tentang penonaktifan saluran, terutama yang berkaitan dengan pemisahannya dari penghubung S4-S5 dan migrasi ke tempat lain. situs Namun, bermutasi dua residu bermuatan positif, R488 dan K495, serta H492 bermuatan sangat lemah, pada linker S2-S3 dari saluran hERG secara individual ke alanin (A) tidak secara signifikan mengubah konstanta waktu penonaktifan (Tambahan). Gambar. 5 dan Tabel Tambahan 4), yang sudah cukup besar untuk saluran WT yang ditandai dengan proses penutupan yang sangat lambat 35 . Ini tidak terlalu mengejutkan mengingat bahwa hanya ada dua residu bermuatan positif dalam linker S2-S3 dari saluran hERG, dibandingkan dengan sebanyak tujuh residu bermuatan positif dalam loop yang sesuai dari KCNQ2. Oleh karena itu, penonaktifan hERG yang sangat lambat mungkin disebabkan oleh muatan positif yang tidak memadai pada linker S2-S3 untuk menarik PIP 2 menjauh dari linker S4-S5, di mana laju disosiasi lipid menentukan seberapa cepat saluran dapat ditutup. Jika ini benar, maka memperkenalkan muatan positif baru di tautan S2-S3 dapat memfasilitasi pemisahan PIP 2 dari tautan S4-S5 dan mempercepat laju penutupan saluran. Untuk menguji kemungkinan ini, kami membuat mutasi pada linker S2-S3 dengan tujuan untuk meningkatkan muatan positif kolektif di wilayah ini. Kami menemukan bahwa mutasi Y493K tidak menunjukkan fungsi, sedangkan mutasi fungsional W497K pada linker S2-S3, secara dramatis menurunkan konstanta waktu penonaktifan hERG hampir 5 kali lipat, dari 630 ± 57 ms menjadi hanya 135 ± 15 ms (Gbr. 5d– f dan Tambahan Tabel 4), mengubah saluran hERG yang sangat lambat menjadi saluran "normal". Mutasi W497K mempertahankan karakteristik lain dari saluran hERG, seperti inaktivasi yang lebih cepat daripada aktivasi dan pemulihan yang lebih cepat dari inaktivasi daripada deaktivasi. Hasil ini mendukung gagasan bahwa saluran hERG berbagi mekanisme serupa PIP 2 -dependent deactivation sebagai saluran KCNQ, yang melibatkan pemisahan PIP 2 dari penghubung S4-S5 dan migrasi ke penghubung S2-S3.

Diskusi

"M current" adalah arus K + gated tegangan sub-ambang batas yang dikodekan oleh saluran Kv7 / KCNQ dan ditandai dengan penonaktifan lambat dan non-inaktivasi, yang sangat penting untuk menstabilkan potensi membran dan mengatur laju pembakaran yang dikeluarkan. sel 36, 37, 38 . Saluran KCNQ1 memainkan peran penting dalam fungsi jantung, dan saluran KCNQ2 adalah target terapi anti-epilepsi 39, 40 . Saluran hERG dan KCNQ1 membentuk arus repolarisasi utama (IKr) dalam miosit ventrikel, yang membantu mempertahankan interval QT 41, 42 . Kinetika lambat penutupan saluran HERG dianggap penting untuk repolarisasi potensial membran sel ventrikel dan pencegahan denyut prematur 41, 43, 44 . Namun, mekanisme molekuler yang mendasari penonaktifan lambat baik saluran KCNQ maupun hERG telah jelas dijelaskan. Penelitian ini sangat menyarankan bahwa penonaktifan diatur oleh migrasi dinamis PIP 2 di antara beberapa situs pengikatannya di kedua jenis saluran ini.

Fungsi pengaturan PIP 2 pada saluran KCNQ dan saluran hERG telah diselidiki secara luas. Laporan sebelumnya telah menunjukkan pentingnya PIP 2 dalam aktivasi saluran dan mekanisme reseptor menghambat saluran Kv ini melalui hidrolisis PIP 2 45, 46 . Baru-baru ini, interaksi langsung PIP 2 dengan linker S4-S5 saluran Kv menerima banyak perhatian, karena implikasi bahwa PIP 2 mungkin merupakan kofaktor yang diperlukan untuk gating bergantung-tegangan pada saluran Kv 12, 13, 28 . Bukti lebih lanjut mengkonfirmasi bahwa PIP 2 memainkan peran penting dalam gerakan pemasangan sensor tegangan dan domain pori, dan situs pengikatan PIP 2 pada saluran KCNQ1 termasuk residu positif dari penghubung S4-S5, bagian bawah penghubung S4 dan S2-S3, terutama di negara tertutup dan sisanya dari saluran KCNQ1 47, 48 . Bukti-bukti ini mendukung bahwa pergeseran situs pengikatan PIP 2 sesuai dengan transisi konformasi gerakan kopling selama proses gating. Bukti awal menunjukkan bahwa sekelompok residu bermuatan sitoplasma positif dekat dengan antarmuka membran dapat membentuk situs pengikatan PIP 2 untuk mempengaruhi aktivasi saluran KCNQ 49 . Meskipun saat ini masih ada kekurangan informasi struktural yang sesuai dari domain sitoplasmik saluran KCNQ, kami menemukan mutasi R325A pada segmen S6 proksimal yang menunjukkan kecepatan penonaktifan yang lebih cepat, mirip dengan efek K230N pada penghubung S4-S5 (Gambar Tambahan 6). Amplitudo arus yang kecil dan kecepatan penutupan yang lebih cepat dari mutasi ini (R325A, K230N) menyiratkan bahwa hambatan dari ikatan PIP 2 ke situs aktivasi akan mendukung migrasi PIP 2 ke linker S2-S3 (menutup situs pengikatan), menghasilkan akselerasi proses penonaktifan. Setelah depolarisasi membran, penghubung S4-S5 bergerak ke posisinya dalam konformasi keadaan terbuka, di mana interaksinya dengan PIP 2 dapat meningkatkan stabilitas seluruh kompleks 28 . Namun, interaksi ini juga dapat menjadi penghalang pada kembalinya linker S4-S5 setelah repolarisasi ke posisinya dalam konformasi keadaan tertutup. Dalam kasus seperti itu, disosiasi PIP 2 dari linker S4-S5 akan membatasi laju penonaktifan saluran. Agaknya, prinsip-prinsip umum yang memandu pengikatan dan disosiasi lipid, seperti proses disosiasi pengikatan-lipid langsung dan interaksi protein-lipid, dapat diterapkan pada dinamika pengikatan PIP 2 di saluran. Namun, mekanisme sederhana semacam itu tidak memiliki fleksibilitas untuk saluran Kv untuk menyesuaikan kebutuhan yang berbeda dalam mengatur repolarisasi karena ketergantungan yang kuat pada afinitas PIP 2 yang mengikat pada satu situs. Simulasi MD kami menunjukkan bahwa interaksi PIP 2 dengan penghubung S4-S5 dari KCNQ2 bukan proses asosiasi-disosiasi sederhana. Sebaliknya, ia sangat dipengaruhi oleh linker S2-S3 di dekatnya karena kemampuan lipid untuk secara dinamis bermigrasi di antara kedua situs (Gbr. 1). Pengaturan ini memungkinkan untuk saluran Kv yang berbeda untuk menyesuaikan beragam kebutuhan fungsional melalui perubahan afinitas ke PIP 2 baik di linker S4-S5 atau linker S2-S3, serta jarak antara dua situs ini melalui evolusi dan / atau modifikasi pasca-terjemahan.

Mutasi saluran Kv meningkatkan risiko sindrom Romano-Ward (RWS) dan sindrom QT panjang (LQTs) 50 . Skrining klinis telah mendeteksi lebih dari 40 mutasi pada penghubung S2-S3 KCNQ1 dan saluran hERG yang mungkin terkait dengan RWS dan LQTs (//www.fsm.it/cardmoc). Demikian juga, mutasi pada linker S2-S3 KCNQ2 menyebabkan risiko tinggi penyakit neurologis 51 . Di sisi lain, peran domain S2-S3 dalam saluran-saluran tegangan sering diabaikan selama beberapa dekade terakhir. Hasil kami mengungkapkan bahwa linker S2-S3 memainkan peran penting dalam proses penutupan saluran Kv melalui modulasi disosiasi PIP 2 dari linker S4-S5. Dalam studi fungsional, tingkat penonaktifan saluran KCNQ dan hERG berkorelasi dengan jumlah muatan positif dalam tautan S2-S3, dengan laju penurunan dengan mengurangi muatan positif, tetapi meningkat dengan memperkenalkan asam amino baru yang bermuatan positif di wilayah ini. (Gambar 4 dan 5). Penemuan fungsi baru ini untuk penghubung S2-S3 harus memberikan wawasan struktural dan fungsional ke dalam patofisiologi penyakit terkait. Studi tambahan tentang mekanisme yang mengatur migrasi PIP 2 di saluran KCNQ dan hERG kemungkinan akan memberi penerangan baru pada perancangan terapi obat untuk mengobati penyakit.

Hasil kami jelas mendukung bahwa transformasi konformasi dari linker S4-S5 digabungkan dengan pengikatan dan disosiasi PIP 2 . Proses dinamis dari kopling ini adalah pertanyaan mendasar untuk memahami proses gating saluran Kv. Simulasi dan hasil eksperimen kami mendukung model pada Gambar. 6. Pada kondisi tertutup, PIP 2 mengikat secara stabil ke linker S2-S3 tanpa migrasi ke linker S4-S5. Pembukaan saluran karena gerakan sensor tegangan membawa S4-S5 linker ke posisinya dalam konformasi aktivasi (terbuka), memungkinkan migrasi PIP 2 dari S2-S3 linker ke S4-S5 linker. Pengikatan PIP 2 ke daerah ini membantu menstabilkan konformasi keadaan terbuka dan sebagai hasilnya, ia juga mencegah transisi dari keadaan terbuka ke keadaan tertutup pada repolarisasi membran yang seharusnya menggerakkan sensor tegangan dan penghubung S4-S5 kembali ke tempatnya. posisi asli dalam konformasi tertutup. Oleh karena itu, laju disosiasi PIP 2 dari linker S4-S5 dapat menentukan kinetika penutupan atau penonaktifan saluran. Migrasi PIP 2 ke S2-S3 linker membantu mengatur disosiasi dari linker S4-S5, yang memungkinkan kontrol yang lebih dinamis dari proses penonaktifan daripada hanya mengandalkan laju non-intrinsik lipid untuk dipisahkan dari linker S4-S5. Hasil fungsional kami sepenuhnya konsisten dengan model ini, mendukung gagasan bahwa migrasi PIP 2 antara penghubung S4-S5 dan penghubung S2-S3, dan oleh karena itu efek yang ditimbulkan pada pemisahan PIP 2 dari penghubung S4-S5, dapat dinilai. membatasi penonaktifan saluran KCNQ dan hERG. Oleh karena itu, migrasi dinamis PIP 2 pada permukaan sitoplasma memainkan peran penting dalam fungsi fisiologis saluran Kv ini melalui regulasi penonaktifannya.

Image

Dalam keadaan tertutup, molekul PIP 2 diadsorpsi ke linker S2-S3 dari saluran KCNQ2. Setelah aktivasi saluran, konformasi S4-S5 linker dari saluran KCNQ2 diubah terlebih dahulu, dan kemudian PIP 2 bermigrasi dari S2-S3 linker ke S4-S5 linker. Setelah itu, PIP 2 berlabuh di linker S4-S5, yang membuat saluran stabil pada kondisi terbuka. Ketika saluran ditutup, PIP 2 pertama-tama bermigrasi dari linker S4-S5 ke linker S2-S3, dan kemudian konformasi dari linker S4-S5 beralih ke keadaan tertutup dari keadaan terbuka. Molekul PIP 2 ditampilkan sebagai batang magenta.

Gambar ukuran penuh

Simulasi MD telah memainkan peran penting dalam mengidentifikasi migrasi dinamis dari molekul yang sangat kecil dalam protein, seperti migrasi CO dalam mioglobin 52 . Hasil kami menunjukkan bahwa simulasi MD juga dapat diterapkan sebagai alat yang kuat untuk mengungkapkan migrasi molekul yang lebih besar pada permukaan protein. Selain PIP 2, lipid membran lain juga menampilkan beberapa interaksi dengan protein membran. For example, various cholesterol interaction sites have been found in G-protein coupled receptors 27, 53 . Our current work may provide a good reference for future studies on the lipid regulation of other ion channels and membrane proteins in general.

Metode

Structural models of the open- and closed-state KCNQ2 channels

The open-state and closed-state KCNQ2 channel structure models used in molecular dynamic simulations were generated by homology modeling. The crystal structure of Kv1.2 (PDB code 2A79) 29 provides the information about the open-state conformation. Recently, using long time all-atom MD simulation, Jensen et al. 9 reported the closed-state conformation of a Kv1.2/Kv2.1 “paddle chimera” channel. Based on these structures, we modeled the structures of the transmembrane domains in open- and closed-state KCNQ2 channels. The structures of the cytoplasmic C termini of the open- and closed-state KCNQ2 channels were modeled based on the open- and closed-state KcsA crystal structures (PDB codes 3PJS and 3EFF) 30, 32 . The N-terminal and the remaining C-terminal extensions of the open- and closed-state KCNQ2 channel were not modeled due to the absence of equivalent proteins as template structures. Multiple sequence alignments of the templates and KCNQ sequences were performed by using the CLUSTALW Web server (www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2), and the highly conserved residues were used to guide the alignment. After manually adjusting the alignments, homology models of the KCNQ2 channel in the open- and closed-state were built with program MODELLER in Discovery Studio 2.6 (Accelrys Software Inc.) based on the templates mentioned above. The generations of these models are described in detail elsewhere 28 . The accuracy of the models had also been analyzed and evaluated by a variety of methods, which all suggested the suitable quality of the open- and closed-state KCNQ2 channel structures 28 . The structural models for mutant KCNQ2 channels used for MD simulations were built from the open-state KCNQ2 model by mutating R160 or all of the basic residues (R153, R155, R158, R160, K162, R165, and K166) located in the S2-S3 linker to alanines.

Simulation systems

The open- and closed-state WT and R160A mutant KCNQ2 channel models were embedded separately into a palmitoyloleolyl phosphatidylcholine (POPC) bilayer by aligning the protein's axis of symmetry with the bilayer normal. In each system, lipids located within 1 Å of the KCNQ2 channel were removed, and four PIP 2 molecules were added manually to the inner leaflet of the POPC bilayer. The initial positions of the PIP 2 molecules were at least 15 Å or 20 Å away from any atom of the channel, respectively (Supplementary Fig. 1). The simulation systems for KCNQ2 mutants with positive charges neutralized in the S2-S3 linker were also built as described above with the exception that the initial positions of the four PIP 2 molecules were no less than 15 Å away from the mutant model. Subsequently, each system was solvated by TIP3P waters with 0.15 M KCl. Each simulation system included ~200, 000 atoms (140 × 140 × 110 Å).

Simulasi dinamika molekul

All MD simulations were performed using the GROMACS 4.6 package with the lsobaric-lsothermal (NPT) ensemble and the CHARMM36-CAMP force field. Please refer to the previous article for more details of MD-simulation parameters 28 . Energy minimizations were first performed to relieve unfavorable contacts, followed by equilibration steps of 27 ns in total to equilibrate the lipid bilayer and the solvent, with restraints (isotropic force constant κ = 1×10 3 kJ·mol −1 ·nm −2 ) on PIP 2 and the main chain of the transmembrane domain. We simultaneously relaxed all of the loops during the equilibration steps, when the PIP 2 molecules were still distant from the KCNQ2 channel with the minimum distance between PIP 2 molecules and the KCNQ2 channel no less than 15 Å or 20 Å as was initially set. Subsequently, we performed four independent 1-μs all-atom molecular dynamic simulations of the open-state WT KCNQ2 simulation systems (each system, according to the initial position of the PIP 2 molecules, has two independent MD simulations). Two independent 1-μs MD simulations of the closed-state KCNQ2 simulation system were also carried out (each system, according to the initial position of the PIP 2 molecules, has one independent MD simulation). After that, we performed four independent 1-μs all-atom molecular dynamic simulations of the open-state R160A mutant simulation systems (each system, according to the initial position of the PIP 2 molecules, has two independent MD simulations, as for the open-state WT KCNQ2 simulations described above). Furthermore, we performed an additional 1-μs MD simulation for the KCNQ2 mutant model in which all positive charges in the S2-S3 linker were neutralized. As the KCNQ2 channel contains a large cytoplasmic domain (536 residues) after residue 337, the motions of the C-terminal residues 313–337 should be restrained by the cytoplasmic domain. Since no similar structure is available in the databank to allow construction of a homology model for this domain, we applied conformational restraints (isotropic force constant κ = 1×10 3 kJ·mol −1 ·nm −2 ) to the Cα atoms of residues 313–337 to mimic the effects of the missing cytoplasmic domain on the motion of these residues. Analysis of the trajectories was performed using Gromacs analysis tools. PyMOl (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.3, Schrödinger, LLC) was used to visualize the structure models and generate figures.

Kultur sel dan transfeksi

CHO cells were used for electrophysiological analysis as described previously 45 . Cells were grown in 100 mm tissue culture dishes (Corning Incorporated) in DMEM/F12 (Gibco) with 10% FBS (Gibco), 100 U/mL penicillin (Cellgro) and 100 μg/mL streptomycin (Cellgro) in a humidified incubator at 37 °C (5% CO 2 ). Cells were passaged every 2–3 days. The cells were transiently transfected with the plasmids using PolyJet™ reagent (SignaGen) according to the instructions of the manufacturer. Cells were used 36–96 hours after transfection for electrophysiological experiments. To facilitate identification of transfected cells, cDNA encoding green fluorescent protein (GFP) was cotransfected with the cDNA of the interested channel at a 1:10 ratio. Cells displaying green fluorescence were used for electrophysiological recording.

Electrophysiological recording

Whole-cell patch clamp recordings were performed at room temperature (22–25 o C) with an Axopatch-200B amplifier (Molecular Devices) on transfected CHO cells. The microelectrodes were pulled from Flaming/Brown type micropipette puller (P-97; SUTTER INSTRUMENT) and had the resistances of 3–6 MΩ when filled with a solution containing (in mM): 140 KCl, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 1 CaCl 2, 10 HEPES (pH set to 7.3 using KOH). Cells were bathed in a solution containing (in mM): 150 NaCl, 5 KCl, 0.5 CaCl 2, 1.2 MgCl 2, 10 HEPES (pH set to 7.3 using NaOH). Current signals were low-pass filtered at 1 kHz and digitized at a 10 kHz sampling frequency using DigiData 1440 A. Data were analyzed using pClamp 10.2 software (Molecular Devices).

Analisis data

The parameters of whole-cell patch clamp recordings of KCNQ2 and KCNQ1 channels were set up as follows: Cells were held at −80 mV and then depolarized to potentials from −80 mV to +80 mV with 17 steps (10 mV increment), each for a duration of 800 ms, and then stepped down to −60 mV. For recording of hERG channel currents, the holding potential was set at −80 mV, and depolarization steps from −80 mV to +60 mV in 10 mV increments, each had a duration of 800 ms and was followed by stepping down to −60 mV, were applied.

To quantify deactivation kinetics, the decaying process of tail currents for hERG channel was fitted by a bi-exponential function as follows:

Image

where I is the current amplitude, t is time, A 1 and A 2 and τ 1 and τ 2 are the amplitudes and time constants for the slow and fast components, respectively, and C is a constant. To compare the difference between wild type construct and its mutants, the weighted mean of the time constants was calculated as: τ deact = (A 1 τ 1 + A 2 τ 2 )/(A 1 + A 2 ).

For KCNQ1 and KCNQ2 channels, the decaying portion was fitted using a single exponential function:

Image

pClamp 10.2 and origin were used to perform Curve fitting and statistical comparisons. Data are shown as the means ± SEM. n represented the number of tested cells. Two-sample t-test was used to perform statistical analysis.

informasi tambahan

How to cite this article : Chen, L. et al. Migration of PIP 2 lipids on voltage-gated potassium channel surface influences channel deactivation. Sci. Rep. 5, 15079; doi: 10.1038/srep15079 (2015).

Informasi tambahan

Dokumen Word

  1. 1.

    Informasi tambahan

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.