Mutant p53-r273h memediasi kelangsungan hidup sel kanker dan resistensi anoikis melalui penindasan faktor-bcl2-modifying (bmf) yang tergantung-akt-dependent | kematian sel & penyakit

Mutant p53-r273h memediasi kelangsungan hidup sel kanker dan resistensi anoikis melalui penindasan faktor-bcl2-modifying (bmf) yang tergantung-akt-dependent | kematian sel & penyakit

Anonim

Subjek

  • Apoptosis
  • Pensinyalan sel
  • Terapi yang ditargetkan
  • Protein penekan tumor

Abstrak

p53 adalah gen penekan tumor yang paling sering bermutasi pada kanker manusia. Tidak seperti gen penekan tumor lainnya, mutasi p53 terutama terjadi sebagai mutasi missense dalam domain pengikatan DNA, yang mengarah ke ekspresi protein p53 mutan full-length. Protein p53 mutan tidak hanya kehilangan fungsi penekan tumornya, tetapi juga dapat memperoleh fungsi onkogenik baru dan meningkatkan tumorigenesis. Di sini, kami menunjukkan bahwa membungkam mutan kontak p53-R273H endogen, tetapi tidak mutan konformasi p53-R175H, mengurangi fosforilasi AKT, menginduksi ekspresi faktor pemodifikasi (BMF) BCL2, disosiasi BIM peka dari BCL-X L dan menginduksi apoptosis yang bergantung pada mitokondria dalam sel kanker. Yang penting, sel-sel kanker yang menyimpan mutan p53-R273H endogen juga ditemukan secara inheren resisten terhadap anoikis dan kurangnya induksi BMF mengikuti kultur dalam suspensi. Yang mendasari kegiatan ini adalah kemampuan mutan p53-R273H untuk menekan ekspresi BMF yang bergantung pada pensinyalan PI3K / AKT yang aktif secara konstitutif. Secara kolektif, temuan ini menunjukkan bahwa p53-R273H dapat secara spesifik mendorong pensinyalan AKT dan menekan ekspresi BMF, yang menghasilkan peningkatan ketahanan hidup sel dan resistensi anoikis. Temuan ini membuka kemungkinan bahwa pemblokiran PI3K / AKT akan memiliki manfaat terapeutik pada p53-R273H yang mengekspresikan kanker.

Utama

Protein p53 adalah penekan tumor yang berfungsi sebagai faktor transkripsi spesifik urutan yang mengatur ekspresi berbagai gen target yang terlibat dalam apoptosis, penangkapan siklus sel, perbaikan DNA, penuaan, dan penghambatan angiogenesis dan metastasis. 1 Namun, sekitar 50% dari semua kanker manusia mengandung mutasi pada gen TP53 , dengan sebagian besar mutasi ini terjadi di dalam domain pengikatan DNA, menyebabkan kerusakan pengikatan p53 pada DNA. 2, 3, 4, 5 Tidak seperti kebanyakan gen penekan tumor, yang sebagian besar tidak aktif oleh penghapusan atau pemotongan mutasi selama perkembangan kanker, gen TP53 pada tumor manusia sering ditemukan mengalami mutasi missense yang menghasilkan protein full-length yang hanya mengandung protein substitusi asam amino tunggal dengan waktu paruh yang sangat lama. 6, 7

Sebagian besar mutasi yang terkait dengan kanker TP53 dapat dianggap berasal dari dua kelas utama: kontak DNA dan mutan konformasi. Kelompok pertama termasuk mutasi pada residu yang terlibat langsung dalam pengikatan DNA (misalnya, R248Q dan R273H). Kelompok kedua terdiri dari mutasi yang menyebabkan lokal (misalnya, R249S dan G245S) atau distorsi konformasi global (misalnya, R175H dan R282W). 8, 9, 10 Konsekuensi biologis dari mutasi p53 berkisar dari sekadar kehilangan fungsi hingga mendapatkan fungsi. Banyak penelitian in vitro telah menunjukkan dengan jelas bahwa beberapa mutan p53 dapat memperoleh fungsi baru, sehingga berkontribusi aktif terhadap inisiasi tumor, perkembangan dan peningkatan resistensi terhadap perawatan antikanker konvensional. 3, 10, 11, 12, 13 Memang, tikus yang mengetuk dengan p53-R270H atau p53-R172H mutan, masing-masing dengan mutan hotspot manusia p53-R273H dan p53-R175H, masing-masing, mengembangkan tumor yang sangat metastasis dibandingkan dengan tikus p53-null., mendukung gagasan tentang fungsi perolehan fungsi yang diperoleh oleh p53 mutan. 14, 15, 16, 17, 18, 19

Pada tingkat molekuler, beberapa mekanisme telah disarankan untuk menjelaskan fungsi fungsi p53 mutan termasuk aktivasi transkripsional MYC, BAG1, MDR1, NFkB2, EGR1, GEF-H1, ID4 dan MAD1; 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 represi transkripsional ATF3, CD-95, ID2, hTERT dan MST1; 30, 31, 32, 33 interaksi unik dengan motif DNA spesifik seperti daerah lampiran matriks matriks / perancah; 34 modifikasi epigenetik, 35 regulasi miRNA 36, 37, 38 dan interaksi dengan protein lain (misalnya, p63, p73, NFY dan BRD1). 39, 40, 41, 42

Penelitian sebelumnya dari laboratorium kami telah menunjukkan bahwa sebagian dari mutan p53 yang berasal dari tumor memediasi kelangsungan hidup sel dalam sel kanker payudara yang mengekspresikannya. Kami menemukan bahwa membungkam p53-R273H mutan dalam sel MDA-MB-468 menginduksi apoptosis masif. Yang penting, efek apoptosis setelah mutan p53 knockdown tidak tergantung pada fungsi TAp63 dan TAp73. Meskipun banyak bukti yang tersedia mendokumentasikan mekanisme potensial melalui mana mutan p53 menderegulasi pertumbuhan sel, mekanisme melalui mana protein p53 mutan meningkatkan kelangsungan hidup sel tumor tetap relatif belum dieksplorasi.

Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami telah menyelidiki efek mutan fungsi p53 terhadap deregulasi ketahanan hidup sel. Kami menemukan bahwa mutan kontak p53-R273, tetapi bukan mutan konformasi p53-R175, mempromosikan ketahanan sel kanker dan resistensi terhadap anoikis sel kanker. Yang mendasari kegiatan ini adalah kemampuan mutan p53-R273H untuk menekan ekspresi BMF dengan cara yang tergantung pada jalur pensinyalan PI3K / AKT. Hasil kami, dengan demikian, menyediakan mekanisme lain tentang bagaimana protein p53 mutan dapat berkontribusi terhadap beragam sinyal onkogenik dan pro-metastasis.

Hasil

Knockdown mutan kontak p53-R273H endogen, tetapi tidak mutan konformasi R175H, menginduksi apoptosis yang bergantung pada mitokondria

Untuk menentukan peran fungsional mutan p53 dalam sel kanker payudara manusia, gen p53 endogen dibungkam menggunakan transduksi lentiviral shRNA. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1a dan c dan Gambar Tambahan 1, pembungkaman sel p53-R273H endogen p53 mutan oleh dua shRNA lentiviral spesifik p53 independen dalam MDA-MB-468 (payudara), HT29 (kolon) dan sel A431 (epidermoid) menginduksi kematian sel apoptosis masif seperti yang dibuktikan dengan pembelahan PARP, blebbing sel dan pewarnaan annexin V / 7-AAD. Selain itu, caspase 3, caspase 9 dan, pada tingkat lebih rendah, kegiatan caspase 8 secara signifikan diregulasi setelah knockdown p53-R273H mutan dalam sel MDA-MB-468 (Gambar 1d). Penghambatan aktivitas caspase 9, caspase 3 dan pan-caspase memblokir apoptosis yang disebabkan oleh pembungkaman p53-R273H, sedangkan penghambatan aktivitas caspase 8 tidak menyelamatkan sel-sel dari menjalani apoptosis, menunjukkan bahwa induksi apoptosis setelah penipisan p53-R273H diperlukan caspase 9 dan caspase 3, tetapi tidak caspase 8 aktivitas (Gambar 1e). Secara konsisten, penipisan p53-R273H endogen dalam sel MDA-MB-468 juga menginduksi sejumlah besar depolarisasi mitokondria (Gambar 1f). Sebaliknya, tidak ada efek apoptosis yang diamati pada sel MCF-7 yang mengekspresikan p53 tipe liar, atau dalam sel SKBR3 yang mengekspresikan mutan konformasi p53-R175H (Gambar 1a dan Gambar Tambahan 1c). Hasil ini menunjukkan bahwa mutan kontak p53-R273H endogen memediasi kelangsungan hidup sel kanker payudara dengan menekan jalur apoptosis mitokondria.

Image

Knockdown mutan kontak p53-R273H endogen, tetapi tidak mutan konformasi R175H, menginduksi apoptosis yang bergantung pada mitokondria. ( a - c ) Mutant p53-R273H diperlukan untuk kelangsungan hidup sel kanker payudara manusia. Sel ditransduksi dengan vektor kontrol (vec), non-penargetan (NS) dan dua konstruksi lentiviral yang berbeda yang secara khusus menargetkan p53 manusia (p53si-1 dan p53si-2). Lisat dipersiapkan untuk imunobloting pada 72 jam setelah transduksi. β -aktin berfungsi sebagai kontrol pemuatan. Perubahan morfologis diamati pada 96 jam setelah transduksi lentiviral dengan mikroskop cahaya (pembesaran asli × 100). Kematian sel apoptosis ditentukan menggunakan annexin V / 7-AAD flow cytometry pada 96 jam setelah transduksi. ( D ) Knockdown dari p53 mutan menginduksi aktivasi caspase 8, 9 dan 3. Kegiatan caspase dinilai oleh uji CaspaseGlo pada 72 jam setelah transduksi. ( E ) Penipisan p53 mutan dalam sel MDA-MB-468 menginduksi apoptosis yang membutuhkan caspase 9 dan 3, tetapi tidak caspase 8, kegiatan. Kematian sel tergantung-caspase dievaluasi oleh annexin V / 7-AAD flow cytometry dengan ada atau tidaknya 20 μ M inhibitor caspase setelah p53-R273H mutan knockdown. ( f ) Knockdown p53 mutan dalam sel MDA-MB-468 menginduksi depolarisasi membran mitokondria. Sel diwarnai dengan JC-1 pada 72 jam setelah transduksi shRNA lentiviral p53. Warna merah menunjukkan adanya agregat JC-1 dalam mitokondria yang utuh. Warna hijau menunjukkan monomer JC-1 dalam sitoplasma. Sel pewarnaan JC-1 dianalisis menggunakan mikroskop epifluoresensi (pembesaran asli × 100). Balok mewakili ± SD dari tiga percobaan. * menunjukkan signifikansi statistik ( P <0, 05) oleh uji- t Student

Gambar ukuran penuh

Penipisan p53-R273H mutan menginduksi BCL2-modifying factor (BMF)

Karena protein keluarga BCL2 telah terbukti memiliki peran penting dalam jalur apoptosis yang bergantung pada mitokondria, kami berhipotesis bahwa p53-R273H mutan dapat memediasi kelangsungan hidup sel kanker payudara melalui regulasi ekspresi protein keluarga BCL-2. Untuk menguji hipotesis ini, kami menyelidiki ekspresi protein keluarga BCL2 pro-dan anti-apoptosis untuk peran mereka dalam jalur apoptosis yang bergantung pada mitokondria. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2a dan Gambar Tambahan 1a, salah satu protein keluarga BCL2 pro-apoptosis, BMF, diregulasi pada 48 jam setelah penipisan p53-R273H endogen, sebelum peristiwa apoptosis yang terjadi pada 72 jam (seperti yang ditunjukkan oleh pembelahan PARP) ). Sebaliknya, tidak ada perbedaan signifikan dalam ekspresi pro-apoptosis lainnya (misalnya, p-BAD, BAD, BAX, BID, BIM, PUMA dan BOK) atau anti-apoptosis (misalnya, BCL-X L dan MCL-1) BCL -2 anggota keluarga diamati (Gambar Tambahan 2).

Image

Penipisan p53-R273H mutan menginduksi BMF. Knockdown p53 mutan menginduksi ( a ) protein BMF dan ( b ) ekspresi mRNA. Sel MDA-MB-468 ditransduksi dengan p53 lentiviral shRNA. Ekspresi protein dan mRNA masing-masing diakses oleh immunoblot dan RT-PCR kuantitatif. Ekspresi mRNA BMF dinormalisasi terhadap GAPDH manusia. ( c ) Ekspresi ektopik dari BMF cukup untuk menginduksi apoptosis dalam sel MDA-MB-468. Sel-sel ditransfeksi dengan 5 μg HA-tagged BMF menggunakan X-tremeGENE pereaksi transfeksi DNA HP seperti yang dibahas dalam bagian Bahan dan Metode. ( d - e ) Penipisan BMF menyelamatkan sel MDA-MB-468 dari apoptosis yang disebabkan oleh knockdown p53 mutan. Protein lisat dan apoptosis dianalisis dengan ( d ) immunoblotting dan ( e ) annexin V / 7-AAD flow cytometry pada 72 jam setelah transduksi. Balok mewakili ± SD dari tiga percobaan. * menunjukkan signifikansi statistik ( P <0, 05) oleh uji- t Student

Gambar ukuran penuh

Untuk menyelidiki lebih lanjut apakah peningkatan regulasi BMF terjadi pada tingkat transkripsional, RT-PCR real-time dilakukan untuk menentukan tingkat ekspresi mRNA BMF dalam sel MDA-MB-468 setelah p53-R273H knockdown. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2b, knockdown p53-R273H secara signifikan menginduksi ekspresi BMF mRNA pada 48 dan 72 jam, dikuatkan dengan peningkatan level protein. Sebaliknya, tidak ada induksi yang diamati dalam sel SKBR3 mengekspresikan p53-R175H (data tidak ditampilkan). Khususnya, penindasan ekspresi BMF oleh p53-R273H mutan dalam sel kanker payudara tidak tergantung pada pengikatan promotor langsung, karena tidak ada p53-R273H endogen yang terdeteksi pada promotor BMF dengan uji kromatin imunopresipitasi (Tambahan Gambar 3).

BMF diperlukan untuk induksi apoptosis setelah menipisnya p53-R273H endogen

Untuk menguji apakah upregulasi BMF saja dapat menginduksi apoptosis, ekspresi ektopik BMF dilakukan dalam sel MDA-MB-468 dengan transfeksi sementara. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2c, ekspresi ektopik BMF menginduksi sejumlah besar apoptosis, menunjukkan bahwa, memang, overekspresi BMF dapat menginduksi apoptosis pada sel MDA-MB-468.

Kami selanjutnya menyelidiki apakah apoptosis yang disebabkan oleh penipisan p53-R273H diperlukan fungsi BMF endogen. Hasil kami menunjukkan bahwa penipisan p53-R273H menginduksi upregulasi BMF yang signifikan dalam sel-sel kontrol vektor yang dikuatkan dengan kematian sel apoptosis yang signifikan (Gambar 2d dan e dan Gambar Tambahan 4); tingkat apoptosis berkurang secara signifikan dalam sel yang habis BMF, menunjukkan bahwa induksi apoptosis setelah penipisan p53-R273H diperlukan fungsi BMF.

Induksi BMF peka terhadap pelepasan BIM dari BCL-X L untuk mempromosikan apoptosis mitokondria

Berbagai penelitian menunjukkan bahwa sinyal kerusakan tertentu, seperti kehilangan perlekatan sel, akan melepaskan BMF, memungkinkannya untuk mentranslokasi, dan mengikat protein pro-apoptosis BH3 saja, BIM, menggantikan BCL2 atau BCL- XL pro-survival pro-survival menginduksi apoptosis. 44, 45, 46 Di sini, kami menyelidiki apakah peningkatan regulasi BMF setelah penipisan p53-R273H endogen dalam sel MDA-MB-468 dapat menginduksi dimerisasi BCL-X L / BMF dan mengganggu interaksi BCL-X L / BIM. Memang, hasil kami menunjukkan bahwa BCL-X L terikat ke BIM tetapi tidak BMF dalam kondisi normal (Gambar 3a). Namun, pada saat induksi BMF setelah p53-R273H knockdown, sejumlah besar BMF ditemukan mengikat BCL-X L, bertepatan dengan disosiasi BIM dari BCL-X L (Gambar 3a). Secara konsisten, overekspresi BCL-X L sepenuhnya membatalkan efek apoptosis dari penipisan p53-R273H (Gambar 3b dan c). Sebagai catatan, tidak ada BCL-2 yang terdeteksi dalam sel MDA-MB-468. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa pembungkaman p53-R273H mutan endogen dalam sel MDA-MB-468 menginduksi ekspresi BMF dan pembentukan kompleks BMF / BCL-X L. Ini pada gilirannya menyebabkan perpindahan BIM dari BCL-X L untuk menginduksi apoptosis.

Image

Induksi BMF peka terhadap pelepasan BIM dari BCL-X L. ( a ) sel MDA-MB-468 ditransduksi dengan shRNA non-targeting (NS) atau p53si-1 lentiviral shRNA selama 72 jam dan interaksi BMF / BCL-X L dan BIM / BCL-X L dideteksi oleh ko uji imunopresipitasi. Input untuk co-imunopresipitasi juga menjadi sasaran analisis imunoblot. IgG dan rantai berat (HC) masing-masing digunakan sebagai kontrol negatif dan kontrol pembebanan. ( b - c ) Ekspresi BCL-X L yang berlebihan membatalkan efek apoptosis dari knockdown p53-R273H mutan dalam sel MDA-MB-468. Sel ditransfungsi bersama dengan konstruk ekspresi BCL-X L dan p53si-1 shRNA. Protein lisat dan apoptosis dianalisis dengan immunoblotting dan annexin V / 7-AAD flow cytometry pada 72 jam setelah ko-transfeksi. Balok mewakili ± SD dari tiga percobaan. * menunjukkan signifikansi statistik ( P <0, 05) oleh uji Student dibandingkan dengan sel kontrol vektor

Gambar ukuran penuh

P53-R273H mutan menekan anoikis seluler

Karena hasil kami menunjukkan bahwa p53-R273H endogen memediasi kelangsungan hidup sel kanker payudara melalui penekanan BMF dan bahwa BMF telah dilaporkan untuk memediasi anoikis seluler, 44, 47 kami berhipotesis bahwa p53-R273H juga dapat mengerahkan fungsi onkogeniknya melalui penekanan dari anoikis seluler dalam sel kanker. Untuk menguji hipotesis ini, kami menguji sensitivitas sejumlah garis sel kanker yang menyimpan mutasi p53 berbeda untuk anoikis. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, lebih dari 50% kematian sel apoptosis diamati pada garis sel kanker yang mengekspresikan p53 tipe liar atau berbagai mutan (R280T, R175H, R179R, L194F dan M246I) dalam kultur suspensi. Sebaliknya, sel kanker yang mengekspresikan p53-R273H (MDA-MB-468, HT29 dan A431) menunjukkan resistensi yang signifikan terhadap anoikis. Demikian pula, BMF mRNA signifikan dan induksi protein juga diamati dalam MCF-7 anoikis-sensitif dan MCF-10A (p53 tipe liar), dan SKBR3 (p53-R175H) sel, sedangkan tidak ada induksi BMF signifikan yang diamati dalam anoikis- sel MDA-MB-468, HT29 dan A431 yang resisten yang mengandung mutasi p53-R273H (Gambar 4a dan c dan Gambar Tambahan 5a dan b). Hasil ini menunjukkan bahwa mutan p53-R273H mungkin menghambat anoikis seluler melalui penekanan induksi BMF.

Tabel ukuran penuh

Image

P53-R273H mutan menekan anoikis seluler. ( a - b ) P53-R273H endogen menekan induksi BMF dalam sel kanker payudara yang dikultur dalam suspensi. Total sampel RNA dan protein lisat yang berasal dari sel yang dikultur sebagai lapisan tunggal yang terlampir atau dalam suspensi menjadi sasaran analisis RT-PCR real-time dan immunoblotting. ( c ) sel p53-R273H yang mengekspresikan MDA-MB-468 secara inheren resisten terhadap anoikis. Semua sel dikultur seperti pada a. Apoptosis / anoikis ditentukan menggunakan annexin V / 7-AAD flow cytometry. ( d ) Ekspresi ektopik p53-R273H, tetapi tidak p53-R175H, menekan protein BMF dan induksi mRNA (Gambar Tambahan 5c) dalam sel MCF-10A yang dikultur dalam suspensi. Sel MCF-10A p53si-3 ditransfusikan dengan vektor, plasmid yang mengekspresikan p53-R175H- atau p53-R273H. Protein lisat yang berasal dari sel yang dikultur sebagai pelapis yang melekat (att) atau dalam suspensi (susp) menjadi sasaran imunoblotting. ( e ) Ekspresi ektopik p53-R273H memberikan resistensi anoikis dalam sel MCF-10A. Sel MCF-10A p53si-3 dikultur dan ditransfeksi seperti pada d . Apoptosis dianalisis dengan annexin V / 7-AAD flow cytometry pada 48 jam setelah kultur. Bilah mewakili ± SD dari tiga percobaan independen. * menunjukkan signifikansi statistik ( P <0, 05) oleh uji- t Student

Gambar ukuran penuh

Untuk secara langsung memvalidasi apakah mutan kontak p53-R273H memang mampu menekan ekspresi BMF dan anoikis, dan bukan karena resistensi anoikis yang melekat pada sel MDA-MB-468, HT29 atau A431, kami melakukan eksperimen rekonstitusi gen pada non -Modifikasi sel MCF-10A. Sekumpulan sel MCF-10A yang ditransduksi secara stabil dengan lRR p53 lentiviral yang menargetkan 3′-UTR endogen p53 tipe liar (p53si-3) dihasilkan diikuti oleh ekspresi transien ektopik mutan p53-R175H atau p53-R273H. Tingkat anoikis kemudian dianalisis dengan membiakkan sel-sel yang ditransfusikan pada pelat kultur jaringan yang diobati dengan poli-HEMA diikuti oleh analisis sitometri aliran V / 7-AAD annexin.

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4d, lebih dari 80% dari ekspresi p53 endogen diregulasi dalam sel yang secara stabil mengekspresikan p53si-3 shRNA dalam sel MCF-10A. Seperti yang diharapkan, detasemen sel menginduksi upregulasi yang signifikan dari BMF mRNA dan tingkat protein dalam sel-sel kontrol vektor dan p53-R175H yang mengekspresikan MCF-10A (Gambar 4d dan Gambar Tambahan 5c). Sebaliknya, tidak ada peningkatan regulasi BMF yang diamati dalam sel yang ditransfeksi dengan mutan p53-R273H, menunjukkan bahwa p53-R273H, tetapi tidak p53-R175H, menekan ekspresi BMF dalam sel MCF-10A yang tumbuh dalam suspensi. Secara konsisten, sel MCF-10A yang mengekspresikan p53-R273H secara signifikan lebih tahan terhadap anoikis dibandingkan dengan vektor atau sel yang mengekspresikan p53-R175H ( P <0, 05, uji- t Student) (Gambar 4e). Hasil serupa juga diamati pada sel kanker paru H5399 p53-null (Tambahan Angka 5d dan e), menunjukkan bahwa p53-R273H kontak mutan, tetapi tidak mutan konformasi p53-R175H, memberikan resistensi anoikis pada sel kanker manusia.

Mutant p53-R273H mengatur jalur pensinyalan PI3K / AKT

Untuk mengidentifikasi mekanisme dimana mutan p53-R273H memediasi ketahanan sel tumor dan resistensi anoikis, profiling gen microarray dilakukan setelah penipisan p53-R273H endogen dalam sel MDA-MB-468. Sebanyak 58 gen diregulasi (> 1, 5 kali lipat), sementara 117 gen diregulasi pada 72 jam setelah p53-R273H knockdown (Gambar Tambahan 6). Dari catatan, hasil microarray menunjukkan bahwa ekspresi BMF diregulasi sementara p53 mRNA diturunkan setelah knockdown p53-R273H dalam sel MDA-MB-468, secara independen memvalidasi hasil kami sebelumnya yang menunjukkan bahwa penipisan p53-R273H menginduksi mRNA dan ekspresi protein BMF .

Untuk memvalidasi hasil microarray, kami melakukan RT-PCR real-time independen pada sejumlah gen kandidat. Memang, ekspresi LZTFL1, POU2F3 dan SOSTDC1 diregulasi secara tergantung waktu setelah knockdown p53-R273H dalam sel MDA-MB-468, sementara TMBIM1, ICAM1 dan LIFR secara signifikan downregulasi, konsisten dengan data microarray (Tambahan Gambar 6 ).

Setelah memastikan tanda tangan gen p53-R273H, kami berusaha mengidentifikasi target molekul langsung p53-R273H menggunakan sumber daya Connectivity Map. 48, 49 Peta Konektivitas terdiri dari perangkat lunak pencocokan pola yang membandingkan tanda tangan gen input ke database 7000 profil ekspresi yang mewakili 1.309 molekul kecil (disebut perturbagens). Skor konektivitas dari +1 hingga −1 kemudian ditetapkan berdasarkan tingkat kesamaan atau ketidaksamaan antara kedua tanda tangan. 48, 49 Dengan demikian, obat dengan skor konektivitas tinggi dan nilai P rendah memiliki tanda tangan gen yang sangat mirip dengan tanda tangan permintaan dan mungkin dihipotesiskan untuk bertindak pada jalur yang paralel dengan obat yang menghasilkan tanda tangan permintaan.

Analisis Connectivity Map menunjukkan bahwa tiga dari lima perturbagen teratas yang diprediksi berbagi jalur umum yang diaktifkan oleh penipisan p53-R273H dalam sel MDA-MB-468 adalah penghambat langsung atau tidak langsung dari jalur pensinyalan PI3K (Tabel 2). Ini termasuk wortmannin dan LY-294002, yang merupakan PI3K inhibitor, 50 dan sirolimus, sebuah inhibitor mTOR. 51 Selain itu, kami juga mengidentifikasi vorinostat dan trichostatin A, keduanya adalah inhibitor histone deacetylase, sebagai salah satu hit setelah p53-R273H knockdown. Namun, tidak seperti PI3K inhibitor, tanda tangan gen yang diperkaya setelah p53-R273H knockdown berkorelasi terbalik dengan tanda tangan gen yang diinduksi oleh histone deacetylase inhibitor. Temuan-temuan ini mengarahkan kami untuk berhipotesis bahwa p53-R273H dapat mengerahkan efek fungsinya melalui aktivasi jalur pensinyalan PI3K / AKT dan / atau penghambatan aktivitas histone deacetylase.

Tabel ukuran penuh

Penipisan dephosphorylates AKT p53-R273H

Untuk menguji hipotesis ini secara langsung, imunoblot dilakukan untuk mengevaluasi ekspresi AKT terfosforilasi setelah p53-R273H knockdown dalam sel MDA-MB-468.

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5a dan Gambar Tambahan 7a, induksi BMF setelah penipisan p53-R273H endogen dikuatkan dengan pengurangan fosforilasi AKT pada serine 473 dan threonine 308. Demikian pula, ekspresi ektopik p53-R273H di MCF-10A p53si-3 atau Sel-sel H1299 menginduksi fosforilasi AKT yang signifikan dan penindasan BMF, sedangkan tidak ada efek seperti yang diamati dalam sel ditransfusikan dengan p53-R175H, atau dalam sel ditransfusikan dengan kontrol vektor (Gambar 5b dan Gambar Tambahan 7b).

Image

Mutant p53-R273H mengatur jalur pensinyalan PI3K / AKT. ( a ) Knockdown p53-R273H dalam sel MDA-MB-468 mengurangi fosforilasi AKT. Sel MDA-MB-468 ditransduksi dengan shRNA lentiviral non-targeting (NS) atau p53si-1 dan lisat diisolasi untuk analisis imunobloting pada 48 dan 72 jam setelah transduksi. ( B ) Ekspresi ektopik p53-R273H mutan, tetapi tidak p53-R175H, menginduksi fosforilasi AKT. Sel MCF-10A ditransduksi dengan vektor lentiviral atau p53si-3 shRNA yang menargetkan 3′-UTR p53 tipe liar endogen diikuti oleh pemilihan obat singkat (1 μM puromisin). Kelompok sel p53si-3 yang mengekspresikan secara stabil 3 ditransfeksi dengan vektor, p53-R175H atau p53-R273H diikuti oleh imunobloting pada 72 jam setelah transfeksi. ( c ) Ekspresi ektopik myr-AKT menekan ekspresi BMF setelah knockdown p53-R273H dalam sel MDA-MB-468. ( d ) Ekspresi ektopik myr-AKT membatalkan efek apoptosis yang disebabkan oleh penipisan p53-R273H dalam sel MDA-MB-468. Sel ditransfusikan bersama dengan myr-AKT dan p53si-1 selama 72 jam. Apoptosis ditentukan menggunakan annexin V / 7-AAD flow cytometry. Bilah mewakili ± SD dari tiga percobaan independen

Gambar ukuran penuh

Kami selanjutnya menyelidiki ketergantungan penindasan BMF yang dipediasi p53-R273H dan kelangsungan hidup sel pada aktivitas AKT. Memang, ekspresi AKT myristoylated konstitutif aktif benar-benar membatalkan induksi BMF dan secara dramatis mengurangi apoptosis setelah penipisan p53-R273H di MDA-MB-468, sel HT29 dan A431 (Gambar 5c dan d serta Gambar Tambahan 7c dan d). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa mutan p53-R273H mampu mengatur pensinyalan PI3K dan AKT.

Mutant p53-R273H mengatur secara khusus ekspresi AKT dan BMF dalam berbagai sel kanker

Untuk menentukan apakah efek pro-survival dari mutan p53-R273H hadir dalam jenis tumor lain, kami melakukan pemogokan gen p53 dalam panel garis sel kanker manusia yang menyimpan berbagai mutasi p53. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6, penipisan p53-R273H endogen dalam MDA-MB-468, HT29 dan A431 menginduksi sejumlah besar apoptosis dan ekspresi BMF, konsisten dengan pengamatan kami sebelumnya.

Image

Mutant p53-R273H mengatur ekspresi AKT dan BMF dalam berbagai sel kanker. Sel ditransduksi dengan p53si-1 lentiviral shRNA. Protein lisat diisolasi untuk imunobloting pada 72 jam setelah transduksi. Perhatikan defosforilasi AKT yang dikuatkan dengan induksi BMF hanya dalam sel yang mengandung p53-R273H.

Gambar ukuran penuh

Menariknya, penipisan p53-R280K endogen dalam MDA-MB-231 dan p53-R280T dalam sel CNE-1 juga mengurangi fosforilasi AKT, tetapi alih-alih upregulasi, ekspresi BMF ditemukan diturunkan secara signifikan dan tidak ada kematian sel apoptotik yang diamati. Sebaliknya, penipisan p53-M246I pada sel kanker paru NCI-H23 menyebabkan penurunan regulasi BMF dengan kadar fosfat-AKT yang tidak berubah. Level phosho-AKT dan BMF tetap tidak terpengaruh pada SKBR3 (p53-R175H), KM12 (p53-H179R), MCF-7 (p53 tipe liar) atau MCF-10A (p53 tipe liar) setelah p53 endogen. Hasil ini menunjukkan bahwa p53-R273H mutan, tetapi tidak mutan lain, secara khusus mengatur kelangsungan hidup sel tumor melalui penekanan AKT yang bergantung pada AKT.

p53 mutan berkorelasi dengan fosforilasi AKT pada tumor payudara primer

Karena hasil kami memperkirakan bahwa tumor dengan p53 mutan akan menunjukkan pensinyalan PI3K / AKT yang lebih aktif, kami menodai jaringan mikro sampel kanker payudara manusia untuk p53 dan membandingkannya dengan kadar fosforilasi AKT. Kami menggunakan pewarnaan p53 yang tinggi sebagai indikasi adanya mutasi fungsi p53 yang berpotensi berfungsi (Tambahan Gambar 6). Konsisten dengan model kami, korelasi positif yang signifikan ( P <0, 001, uji Chi-square) terdeteksi antara pewarnaan p53 tinggi dan tingkat tinggi fosforilasi AKT (Tambahan Gambar 8). Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa mutan p53 secara khusus mendorong kelangsungan hidup sel kanker dan resistensi anoikis melalui perubahan pensinyalan AKT.

Diskusi

Studi ini menjelaskan keuntungan fungsi p53-R273H mutan dalam mempromosikan kelangsungan hidup sel dan resistensi anoikis sel kanker. Yang mendasari kegiatan ini adalah kemampuan p53-R273H mutan untuk menekan ekspresi BMF dengan cara yang tergantung pada jalur pensinyalan PI3K / AKT. Penipisan mutan kontak hot-spot p53-R273H endogen, tetapi bukan mutan konformasi p53-R175H, menurunkan fosforilasi AKT, menginduksi ekspresi BFF, menginduksi pemisahan BIM dari BCL-X L dan menginduksi apoptosis yang bergantung pada mitokondria dalam berbagai kanker. sel. Yang penting, knockdown BMF atau ekspresi ektopik dari AKT myristoylated secara signifikan menyelamatkan efek apoptosis dari penipisan p53-R273H, menunjukkan bahwa induksi BMF diperlukan untuk kematian sel apoptosis setelah kematian p53-R273H. Demikian pula, sel-sel kanker yang menyimpan mutan p53-R273H endogen juga ditemukan secara inheren resisten terhadap anoikis dan kurangnya induksi BMF mengikuti kultur dalam suspensi. Seperti yang diprediksi oleh model ini, overekspresi p53-R273H, tetapi tidak p53-R175H, dalam sel MCF-10A tipe liar p53 menjadikan sel-sel tersebut tahan terhadap anoikis dan menekan induksi BMF. Hasil ini menunjukkan bahwa p53-R273H mutan secara khusus mendorong kelangsungan hidup sel kanker melalui penekanan BMF, yang mungkin berkontribusi pada peningkatan resistensi anoikis selama metastasis. Karena induksi BMF juga dihapuskan dalam sel-sel pengekspres AKT myristoylated setelah p53-R273H knockdown, nampaknya induksi BMF adalah penghambatan AKT hilir.

Demonstrasi lebih lanjut tentang relevansi klinis mutan p53 dan poros PI3K / AKT diberikan oleh staining IHC dari kanker payudara manusia primer yang menunjukkan korelasi positif antara ekspresi tinggi p53 (indikator adanya penambahan fungsi mutan p53) dan pewarnaan phospho-AKT yang kuat.

Namun harus diingat bahwa efek p53 mutan pada pensinyalan PI3K / AKT tidak terbatas hanya pada mutan p53-R273H. Hasilnya juga tidak selalu menyiratkan bahwa semua tumor yang memiliki kadar fosfo-AKT tinggi akan memiliki mutasi p53-R273H dan memiliki tingkat resistensi yang sama terhadap apoptosis dan anoikis. Memang, penipisan p53-R280K endogen dalam MDA-MB-231 dan p53-R280T dalam sel CNE-1 menganugerahkan downregulasi fosfo-AKT yang serupa, tetapi ekspresi BMF ditemukan diturunkan secara signifikan (alih-alih diregulasi seperti yang diamati pada p53-R273H -mengekspresikan sel) dan tidak ada kematian sel apoptosis yang diamati. Tampaknya mutan p53 lain mungkin bekerja sama melalui mekanisme yang berbeda, independen dari BMF, untuk menyampaikan sinyal onkogenik yang berbeda untuk meningkatkan agresivitas pada kanker manusia. Ini membutuhkan penyelidikan lebih lanjut.

Bagaimana, tepatnya, mutan p53 berkontribusi pada aktivasi PI3K / AKT tetap menjadi pertanyaan terbuka. Karena mutan fungsi p53 dapat mendorong tumorigenesis melalui aktivasi reseptor faktor pertumbuhan (mis., Reseptor TGF- β , 52 EGFR 53, 54, 55 dan MET 56, 57 ) atau mempromosikan daur ulang yang digerakkan oleh integrin / rab-coupling protein. 53 Jalur pensinyalan ini telah terlibat dalam aktivasi pensinyalan PI3K / AKT. Oleh karena itu, tergoda untuk berspekulasi bahwa aktivasi konstitutif dari PI3K / AKT oleh p53-R273H dapat dimodulasi sebagian oleh satu atau kombinasi dari mekanisme ini. Memang, tiga garis sel (MDA-MB-468, HT29 dan A431) yang responsif terhadap de-fosforilasi AKT, induksi BMF dan kematian sel apoptosis setelah penipisan p53-R273H, menyatakan EGFR tingkat sedang hingga tinggi. 58 Pekerjaan lebih lanjut memang diperlukan untuk memahami apakah peran mutan p53-R273H dalam regulasi pensinyalan PI3K / AKT dan ekspresi BMF memengaruhi perkembangan metastasis pada kanker manusia. Penelitian yang membahas aspek ini juga perlu memastikan kontribusi relatif dari masing-masing properti fungsional dari mutan p53-R273H, yaitu, kontrol apoptosis, migrasi sel dan invasi sel, dalam tumorigenesis.

Akhirnya, beberapa penelitian juga mengungkapkan peran TAp63, protein keluarga p53 dan faktor transkripsi, yang berinteraksi dengan mutan tetapi tidak p53 tipe liar. 59, 60 Dengan menghambat TAp63, p53 mutan dapat mengatur program transkripsi pro-invasif yang mencakup regulasi ekspresi Pemain Dadu, DEPDC1, Cyclin G2 dan Sharp1. 52, 61 Namun, temuan kami menunjukkan bahwa p53-R273H mutan dapat mengatur kelangsungan hidup sel kanker dan resistensi anoikis independen dari fungsi TAp63 (dan TAp73). 43 Ini konsisten dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan bahwa kehilangan TAp63 kurang kuat dalam menginduksi metastasis dibandingkan dengan ekspresi p53 mutan dalam model tikus adenokarsinoma duktus pankreas, menunjukkan bahwa p53 mutan melakukan lebih dari menghambat TAp63. 62

Sebagai kesimpulan, kami menunjukkan bahwa kontak mutan p53-R273H menekan ekspresi BMF dengan cara yang tergantung pada jalur pensinyalan PI3K / AKT untuk meningkatkan kelangsungan hidup sel kanker dan resistensi anoikis. Hasil kami, dengan demikian, memberikan bukti untuk mekanisme lain yang dapat digunakan tumor untuk mempromosikan metastasis, terutama pada tumor di mana p53 mutan sangat diekspresikan. Temuan ini juga membuka kemungkinan bahwa penargetan jalur pensinyalan PI3K / AKT akan memiliki manfaat terapeutik pada kanker p53-R273H mutan yang mengekspresikan kanker.

Material dan metode

Kultur dan konstruksi sel

Garis sel karsinoma payudara manusia (HCC38, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 dan SKBR3), garis sel karsinoma usus besar (HT-29 dan KM12), garis sel karsinoma paru-paru (NCI-H1299 dan NCI- H23), karsinoma epidermoid (A431) dan karsinoma nasofaring (CNE1) dipertahankan dalam RPMI 1640 yang mengandung 10% serum janin sapi, 100 IU / ml penisilin, dan 100 μ g / ml streptomisin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, AS). Sel MCF-10A ditanam dalam DMEM-F12 (Sigma-Aldrich) yang ditambah dengan 5% serum kuda, 20 ng / ml EGF, hidrokortison 0, 5 g / ml, toksin kolera 100 ng / ml, insulin 10 μ g / ml, 100 IU / ml penisilin dan streptomisin 100 g / ml. Semua sel dipertahankan pada suhu 37 ° C di lingkungan yang mengandung 5% CO 2 . Ekspresi konstruksi diperoleh dari Addgene (Cambridge, MA, USA) dan ditransfeksi menggunakan X-tremeGENE pereaksi transfeksi DNA HP (Roche, Indianapolis, IN, USA) sesuai dengan instruksi pabrik (Tabel Tambahan 1).

Produksi dan transduksi lentiviral

Konstruksi Lentiviral shRNA dibeli dari Sigma-Aldrich. Stok lentiviral dengan titer tinggi dihasilkan oleh ko-transfeksi dengan kemasan plasmid psPAX2 (Addgene; plasmid 12260) dan plasmid amplop pMD2.G (Addgene; plasmid 12259) ke dalam sel HEK-293T seperti yang dijelaskan sebelumnya. 43, 63, 64, 65, 66 Urutan target shRNA untuk p53 dan BMF ditunjukkan pada Tabel 2 Tambahan.

Analisis imunoblot

Protein lisat dari sel diekstraksi dalam buffer lisis dingin (0, 75% NP-40, 1 mM DTT, inhibitor fosfatase dan protease inhibitor di PBS). Total protein (50 μg) menjadi sasaran SDS-PAGE diikuti oleh imunoblotting. Rincian sumber antibodi yang digunakan untuk immunoblotting disediakan dalam Tabel Tambahan 3.

Uji apoptosis dan anoikis

Kuantisasi apoptosis dengan pewarnaan Annexin V-PE / 7-AAD dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. 43, 63 Semua analisis dilakukan pada FACSCalibur flow cytometer menggunakan perangkat lunak CellQuest Pro (versi 5.1.1; BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Untuk uji anoikis, sel-sel disepuh pada lempeng kultur jaringan yang diberi perlakuan awal dengan 20 mg / ml polyHEMA (Sigma, St. Louis, MO, USA) dan dianalisis untuk apoptosis dengan uji Annexin V-PE.

Aktivasi dan penghambatan caspase

Kegiatan caspase 3, 8 dan 9 dalam sel diukur pada 72 jam setelah transduksi lentiviral shRNA menggunakan kit CaspaseGlo (Promega, Madison, WI, USA) sesuai dengan protokol pabrikan. Caspase 3, 8, 9 atau inhibitor pan-caspase (Z-DEVD-FMK, Z-IETD-FMK, Z-LEHD-FMK dan Z-VAD-FMK, masing-masing; Promega) digunakan untuk menghambat aktivitas caspase. Konsentrasi optimal dari semua inhibitor ditentukan menjadi 20 μ M. Inhibitor ditambahkan ke sel 24 jam setelah transduksi shRNA lentiviral. Apoptosis diukur dengan uji Annexin V-PE pada 72 jam.

Pengujian depolarisasi membran mitokondria

Sel diinkubasi dengan 5 μg / ml JC-1 (Merck, Darmstadt, Germany) dalam kondisi gelap selama 30 menit pada suhu kamar diikuti dengan visualisasi dengan mikroskop fluoresensi atau analisis aliran sitometri.

RT-PCR kuantitatif

Total RNA dari sel diekstraksi menggunakan kit isolasi RNA Qiagen (Qiagen, Valencia, CA, USA) dan cDNA strand pertama disintesis menggunakan Master Mix RNA-ke-cDNA Kapasitas Tinggi (Biosystems Terapan, Carlsbad, CA, USA) sesuai dengan protokol pabrik. Tingkat ekspresi gen diukur dengan RT-PCR real-time menggunakan pereaksi FastStart Universal SYBR Green Master (Roche) dan sistem detektor PCR waktu-nyata Bio-Rad iQ5 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Analisis data dilakukan dengan menggunakan Bio-Rad iQ5 Optical System Software V1.0. Urutan primer maju dan mundur spesifik ditunjukkan pada Tabel Tambahan 4. Kondisi untuk semua reaksi RT-PCR real-time adalah sebagai berikut: 3 menit pada 94 ° C diikuti oleh 40 detik pada 94 ° C, 40 detik pada 60 ° C dan 25 detik pada 72 ° C selama 40 siklus. Data ekspresi dinormalisasi terhadap GAPDH atau B2M sebagai gen housekeeping.

Microarray dan analisis peta konektivitas

Percobaan microarray dilakukan dalam rangkap dua dalam sel MDA-MB-468 ditransduksi dengan p53 lentiviral shRNA atau dengan kontrol shRNA non-spesifik selama 48 jam. RNA Terisolasi diserahkan ke laboratorium layanan bersertifikasi Affymetrix (Origen Labs, Singapura) untuk pengendalian dan pemrosesan kualitas. Semua hibridisasi dilakukan pada Affymetrix Human Gene 1.0ST Array. Analisis data microarray dilakukan menggunakan Affymetrix Expression Console V1.1 (Santa Clara, CA, USA), Analisis Pengayaan Gene Set (Institut Luas Harvard dan MIT, MA, USA) 67 dan Connectivity Map. 48 Semua data ekspresi microarray telah disimpan di Pusat Nasional untuk Informasi Gene Expression Omnibus Informasi Bioteknologi (nomor aksesi seri GEO: GSE65967).

Aksesi

Omnibus Ekspresi Gen

  • GSE65967

Informasi tambahan

File Powerpoint

  1. 1.

    Gambar Tambahan 1

  2. 2.

    Gambar Tambahan 2

  3. 3.

    Gambar Tambahan 3

  4. 4.

    Gambar Tambahan 4

  5. 5.

    Gambar Tambahan 5

  6. 6.

    Gambar Tambahan 6

  7. 7.

    Gambar Tambahan 7

  8. 8.

    Gambar Tambahan 8

Dokumen Word

  1. 1.

    Legenda Gambar Tambahan

  2. 2.

    Tabel Tambahan

Glosarium

7-AAD

7-aminoaktinomisin D

AKT

v-akt murine thymoma virus onkogen homolog 1

ATF3

mengaktifkan faktor transkripsi 3

B2M

beta-2-microglobulin

BURUK

Agonis terkait BCL2 dari kematian sel

BAG1

Atanogen terkait-BCL2

BAX

Protein X terkait BCL2

BCL-2

B-sel CLL / limfoma 2

BCL-X L

BCL2-like 1 (BCL2L1)

TAWARAN

BH3 berinteraksi agonis kematian domain

BIM

BCL2-like 11 (fasilitator apoptosis) (BCL2L11)

BMF

Faktor pengubah Bcl2

BOK

Pembunuh ovarium terkait BCL2

BRD1

bromodomain mengandung 1

CD-95

Reseptor kematian permukaan sel Fas (juga dikenal sebagai FAS)

DEPDC1

Domain DEP yang mengandung 1

Pemain dadu

pemain dadu 1, ribonuklease tipe III

DTT

Dithiothreitol

EGF

faktor pertumbuhan epidermis

EGFR

reseptor faktor pertumbuhan epidermal

EGR1

respons pertumbuhan awal 1

GAPDH

gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase

GEF-H1

Rho / Rac guanine nucleotide exchange factor (GEF) 2 (juga dikenal sebagai ARHGEF2)

Informasi Tambahan menyertai makalah ini di situs web Kematian dan Penyakit Sel (//www.nature.com/cddis)