Nagz memicu pembongkaran biofilm gonococcal | laporan ilmiah

Nagz memicu pembongkaran biofilm gonococcal | laporan ilmiah

Anonim

Subjek

  • Biofilm
  • Patogen

Abstrak

Interaksi bakteri-bakteri memainkan peran penting dalam mempromosikan pembentukan biofilm. Di sini kami menunjukkan bahwa NagZ, protein yang terkait dengan daur ulang peptidoglikan, memiliki aktivitas sambilan yang memungkinkannya memodulasi akumulasi biofilm oleh Neisseria gonorrhoeae . Kami mengkarakterisasi sifat biokimia NagZ dan menunjukkan kemampuannya untuk berfungsi sebagai agen pendispersi untuk biofilm yang terbentuk pada permukaan abiotik. Kami memperluas pengamatan ini pada model kultur sel dan eksplan jaringan dan menunjukkan bahwa pada mutan nagZ , biofilm yang terbentuk dalam kultur sel dan pada jaringan manusia mengandung lebih banyak biomassa secara signifikan daripada yang dibentuk oleh strain tipe liar. Hasil kami menunjukkan bahwa enzim yang dianggap terbatas pada daur ulang peptidoglikan mampu menyebarkan biofilm yang telah terbentuk sebelumnya.

pengantar

Gonore, yang disebabkan oleh patogen manusia eksklusif Neisseria gonorrhoeae (GC), adalah penyakit bakteri kedua yang paling sering dilaporkan di AS, mempengaruhi lebih dari 800.000 orang setiap tahun 1 . Sementara studi laboratorium telah berkontribusi pada pemahaman yang signifikan tentang dasar-dasar mekanistik interaksi GC dengan tuan rumah, selama infeksi alami organisme mungkin ada pada permukaan mukosa sebagai biofilm 2 . Pengamatan ini mengarah pada pertanyaan tentang perbedaan potensial dalam studi yang dilakukan dengan bakteri planktonik dibandingkan dengan bagaimana organisme tumbuh in vivo . Pertumbuhan GC dalam biofilm juga memiliki implikasi untuk pengobatan, terutama dengan munculnya cefixime dan ceftriaxone-resistant strain 3, 4 .

GC dapat membentuk biofilm pada sel epitel serviks manusia primer dan transformasi 2 . Namun, sedikit yang diketahui tentang bagaimana gonokokus membentuk biofilm, sinyal-sinyal yang mengatur produksi biofilm atau mekanisme penyebaran gonokokus dari biofilm. DNA memainkan peran penting dalam mengatur matriks biofilm neisserial, dengan sekresi DNA beruntai tunggal memainkan peran penting dalam inisiasi biofilm gonococcal 5 . Namun, sumber DNA ini tidak jelas karena strain seperti FA1090 dan 1291 membentuk biofilm, namun tidak memiliki sistem sekresi tipe 4 yang terkait dengan sekresi DNA 6 . Penambahan DNase atau Spermine eksogen merusak pembentukan biofilm dan berkontribusi terhadap gangguan biofilm 7, 8 . Karena jalur urogenital manusia kaya akan poliamin, dan molekul-molekul ini dapat melindungi GC dari antimikroba inang, interaksi dengan poliamin mungkin menjadi salah satu mekanisme di mana GC meninggalkan biofilm dalam kondisi fisiologis. Studi tentang biofilm yang dihasilkan oleh organisme lain telah menyarankan beberapa mekanisme penyebaran, termasuk erosi 10 dan peluruhan 11 . Erosi dan peluruhan dapat terjadi akibat proses metabolisme terkait bakteri, seperti sekresi glikosidase 12 dan nukleasi 13 .

GC dalam biofilm tampaknya terkait erat satu sama lain melalui mekanisme yang tidak diketahui. Studi kami sebelumnya menunjukkan bahwa N. gonorrhoeae MS11ΔOpa, strain yang tidak memiliki ekspresi protein opacity, terganggu dalam kemampuannya untuk membentuk mikrokoloni 14 . Karena protein Opa dapat bertindak sebagai lektin dan berikatan dengan LOS dari sel tetangga 15, kami berhipotesis bahwa harus ada glikosidase yang memodulasi interaksi LOS-Opa untuk memungkinkan pemisahan masing-masing kokus dari mikrokoloni. Kami selanjutnya memperkirakan bahwa protein ini dapat mengatur pelarian bakteri dari biofilm.

Dalam penelitian ini, kami mengkarakterisasi NagZ dari N. gonorrhoeae dan menganalisis perannya dalam pengembangan biofilm. Kami menyatakan nagZ dalam Escherichia coli, memurnikan protein dan mendefinisikan sifat biokimia. Kami menunjukkan bahwa mutan nagZ menghasilkan biofilm yang lebih kuat yang mengakumulasi lebih banyak biomassa dari waktu ke waktu. Kami juga menunjukkan bahwa NagZ yang ditambahkan secara eksogen mengurangi biofilm. Akhirnya, kami menunjukkan bahwa dengan tidak adanya NagZ, gonokokus menghasilkan biofilm yang lebih tebal pada jaringan serviks manusia berbudaya ex vivo .

Hasil

NagZ adalah β- N -acetylglucosaminidase yang tidak esensial

Dengan menggunakan basis data CAZy 16, kami menentukan bahwa ORF0135 dalam N. gonorrhoeae FA1090 mengkodekan beta-hexosaminidase putatif (EC 3.2.1.52) milik superfamili glycoside phosphorylase (GH3). Glikosidase dari GH3 adalah enzim penahan dan membelah substratnya dalam mekanisme perpindahan dua langkah dua langkah yang dikatalisis oleh asam / basa yang melibatkan zat antara enzim glikosil kovalen yang berfungsi sebagai asam aspartat yang dikonservasi sepenuhnya berfungsi sebagai nukleofil katalitik 17 . Karena ORF0135 homolog dengan NagZ dalam berbagai macam bakteri gram negatif dan mengandung asam aspartat yang diawetkan (homologi untuk E. coli dan Pseudomonas aeruginosa ditunjukkan pada Gambar Tambahan. 1) kami mengusulkan penggantian nama ORF0135 nagZ. Gen ini hadir di semua genom neisserial saat ini tersedia di NCBI, dengan tingkat konservasi yang tinggi (> 97% identitas) pada tingkat nukleotida di antara strain GC (Gambar S1). Sintesis gen identik dalam galur patogen, tetapi berbeda secara signifikan dalam galur komensal (data tidak ditunjukkan).

Pengkodean DNA NagZ diklon ke vektor ekspresi pET28a dan protein yang diekspresikan dimurnikan. Massa molekul NagZ yang ditentukan oleh SDS-PAGE (47 kDa) konsisten dengan prediksi massa untuk protein ini (Gambar Tambahan 2). Kami menentukan kondisi enzimatik yang optimal untuk NagZ menggunakan p -Nitrophenyl N -acetyl-β-D-glucosaminide (pNP-GlcNAc) sebagai substrat. Kondisi optimal untuk pengujian ditentukan menjadi 37 ° C, dalam buffer KPO 4 (200 hingga 400 mM) pada pH 8, 0 (Gambar Tambahan 2B, C). Enzim mempertahankan 100% aktivitas setelah 48 jam pada suhu kamar (data tidak ditampilkan). Parameter kinetik Km dan Vmax terhadap (pNP-GlcNAc) masing-masing adalah 3, 2 mM dan 64 μmol min- 1 mg- 1, dan nilai-nilai ini berada dalam urutan yang sama besarnya dengan yang untuk beberapa hexosaminidases lainnya 18 . Kami menghitung aktivitas spesifik protein murni kami sebagai 1600 nmol min −1 mg −1 . Kami melakukan skrining untuk aktivitas enzim ini menggunakan p- Nitrophenyl terkonjugasi dengan gula lainnya (Tambahan Gambar. 2D). Dari substrat yang menghasilkan produk belahan yang dapat dideteksi, NagZ memiliki aktivitas maksimal sekitar 20% pada p -nitrophenyl-beta-D- N, N '-diacetylchitobiose dibandingkan yang diukur dengan PNP-GlcNAc.

Karena N. gonorrhoeae kekurangan gen yang dibutuhkan untuk menyandikan kapsul karbohidrat 19, permukaan sel N -asetil-glukosamin hanya ditemukan terkait dengan LOS. Namun, ini tidak akan menghalangi NagZ yang memiliki kemampuan untuk memecah N -asetil-glukosamin yang dihubungkan melalui konformasi lainnya. Ini mengarahkan kami untuk menguji Staphylococcus aureus, yang menghasilkan polisakarida ekstraseluler yang merupakan polimer yang terhubung dengan β-1-6, sebagian besar terdiri dari N -asetil-glukosamin 20 yang diperlukan untuk pembentukan biofilm 21 . Ketika polimer ini terdegradasi oleh perlakuan dengan dispersin B, biofilm terganggu 22 . Kami menguji untuk melihat apakah NagZ dapat mengganggu biofilm yang dibentuk oleh S. aureus SH1000. Pengobatan NagZ dari biofilm S. aureus memiliki dampak yang dapat diabaikan pada biofilmnya (Gambar Tambahan 2E). Sebaliknya, pengobatan dengan Dispersin B secara signifikan mengurangi biomassa biofilm S. aureus . Pengobatan Dispersin B dari biofilm gonokokal menghasilkan dampak yang dapat diabaikan pada biofilmnya (data tidak ditunjukkan). Mengingat bahwa pengobatan jangka panjang dari biofilm S. aureus dengan NagZ gagal berdampak padanya, ada kemungkinan bahwa NagZ tidak memiliki aktivitas exo dan endo-β-1-6-N-asetil-glukosaminidase.

Karena NagZ diperlukan untuk pembentukan monosakarida dari disakarida yang dilepaskan selama langkah sitosolik dari jalur daur ulang muropeptida di E. coli 23, kami berhipotesis bahwa akumulasi fragmen peptidoglikan yang akan terjadi pada mutan nagZ dapat mempengaruhi viabilitas gonokokus. Kami menggunakan strategi rekombinasi untuk menghapus gen ini dan memverifikasi bahwa penghapusan telah dimasukkan dengan benar dalam genom dengan analisis sekuens DNA dari wilayah yang mengandung penghapusan. Kami mengukur sifat pertumbuhan dari mutan penghapusan dan data menunjukkan bahwa dalam media pertumbuhan cair standar, tidak ada perbedaan dalam pertumbuhan antara induk dan strain penghapusan (Tambahan Gambar. 3A).

Aktivitas NagZ dapat dideteksi pada supernatan saat kultur memasuki fase diam (Tambahan Gambar. 3A). Kami tidak dapat mendeteksi aktivitas NagZ dalam supernatan kultur sel fase Log, tetapi dapat dengan mudah mendeteksi aktivitasnya dalam lisat sel. Program bioinformatika untuk memprediksi lokasi seluler nagZ (Signal p4.0 24, PSORTb v3.0 25, PSLPred 26 dan MESSA 27 ) menyarankan lokasi sitosolik atau periplasma untuk NagZ (data tidak ditampilkan). Menggunakan lisat bakteri dan supernatan kaldu yang diisolasi dari kultur semalam dari FA109010nagZ, kami tidak dapat mendeteksi aktivitas beta-hexosaminidase, menunjukkan bahwa NagZ adalah satu-satunya beta-hexosaminidase di N. gonorrhoeae FA1090.

NagZ bekerja pada peptidoglikan

Saat gonokokus tumbuh, mereka mendaur ulang fragmen peptidoglikan yang dikeluarkan dari sacculus. Namun, mereka melepaskan sebagian besar dari fragmen-fragmen ini ke dalam medium, dan karakterisasi fragmen-fragmen ini menghasilkan profil kromatografi yang dapat direproduksi 28 . Kami menguji NagZ karena kemampuannya untuk mencerna fragmen peptidoglikan berlabel metabolik. Menggunakan persiapan rebus NagZ sebagai kontrol negatif, kami menghasilkan profil yang diharapkan (Gbr. 1). Data pada Gambar. 1A menunjukkan bahwa penambahan NagZ mengubah profil fragmen peptidoglikan, di mana puncak monomer peptidoglikan bergeser ke fraksi kemudian (ukuran lebih kecil) dari kolom ukuran, konsisten dengan penghapusan N-asetilglukosamin dari monomer peptidoglikan. Demikian pula, puncak disakarida bebas dihilangkan dan puncak muncul untuk asam 1, 6-anhydro-N-asetilmuramat bebas. Tidak ada perubahan signifikan yang terlihat pada puncak untuk dimer peptidoglikan dan tetrasakarida-peptida, menunjukkan bahwa molekul-molekul ini bukan substrat NagZ. Data ini konsisten dengan aktivitas NagZ yang diketahui dalam bakteri lain, bertindak untuk menghilangkan N-acetylglucosamine dari monomer peptidoglikan dan disakarida bebas 29 .

Image

Panel ( A ) menunjukkan aktivitas NagZ di peptidoglikan. Gonococci diberi label metabolik dengan [6-3 H] glukosamin. Setelah periode pengejaran, supernatan dikumpulkan dan dirawat dengan NagZ murni. Fragmen radiolabeled dipisahkan oleh kromatografi eksklusi ukuran dan dideteksi dengan penghitungan kilau cair. Peptidoglikan gonokokal mengandung dimer PG, monomer, disakarida bebas, dan asam anhidro- N- asetillamatamat. GlcNAc, N -acetylglucosamine; MurNAc, asam N- acetylmuramic; anhMurNAc, anhydro- N- acetylmuramic acid. Panel ( B ) adalah gel SDS-PAGE LOS yang diisolasi dari: 1) N. gonorrhoeae F62 Δ8-1 42 ; 2) N. gonorrhoeae F62; 3) N. gonorrhoeae F62ΔNagZ; dan 4) N. gonorrhoeae F62ΔNagZ diobati dengan NagZ. Bagian bawah panel adalah representasi grafis dari bagian oligosakarida LOS yang diisolasi dari F62 51 . Huruf di atas panah sesuai dengan pita LOS yang terlihat di panel atas.

Gambar ukuran penuh

NagZ tidak bertindak atas LOS

Karena NagZ mampu membelah substrat yang mengandung N -asetil-glukosamin, dan LOS neisserial mengandung N- asetilglukosamin dalam berbagai konformasi, kami menguji NagZ karena kemampuannya untuk bertindak pada LOS neisserial. LOS yang dimurnikan dari N. gonorrhoeae F62 dicerna dengan NagZ dan mobilitasnya dibandingkan dengan LOS yang tidak tercerna. Karena F62 mengungkapkan beberapa isoform berbeda dari LOS yang mengandung terminal dan internal N-acetylglucosamine, dan NagZ tidak dapat bertindak pada salah satu komponen ini, baik di terminal atau lokasi internal (Gbr. 1B), kami menyimpulkan bahwa NagZ kekurangan β1–3 exoglycosidase aktivitas dan aktivitas α1–2 endoglikosidase. Kami juga melakukan tes ini dengan menambahkan NagZ ke sel utuh, dan menganalisis LOS setelah pengobatan. Data yang diperoleh sama dengan yang diperoleh dengan menggunakan LOS yang dimurnikan, menunjukkan bahwa aktivitas enzimatik tidak terkait dengan keberadaan konformasi LOS tertentu (Data tidak ditampilkan).

Strain penghapusan nagZ membentuk biofilm yang lebih tebal

Strain gonokokal yang tumbuh dalam biofilm berada di bawah tekanan metabolik yang signifikan. Dengan demikian, kita akan berharap bahwa lingkungan ekstraseluler biofilm akan mengandung enzim sitosol karena sel-sel yang tertekan sedang sekarat dan sel-sel yang sekarat sedang melisis. Kami berhipotesis bahwa mutasi nagZ dapat mengubah struktur biofilm gonokokal. Jenis liar dan strain Δ nagZ dari N. gonorrhoeae FA1090 dibandingkan karena kemampuan mereka untuk membentuk biofilm dalam kondisi statis dan dinamis. Biofilm dinamis dikembangkan pada antarmuka udara cair pada permukaan bagian dalam tabung biakan. Setelah 24 jam, biakan bakteri disedot dan biofilm dikeringkan. Data (Gbr. 2, panel A) adalah representasi visual dari biofilm yang dibentuk pada tabung biakan. Data pada Gambar. 2, panel B adalah kuantifikasi biomassa biofilm ini, menggunakan prosedur pewarnaan kristal violet 31 . Analisis statistik menggunakan uji-t Student menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam biomassa dari regangan knockout terhadap strain tipe liar (n = 6, p <0, 001) sekitar 4 kali lipat. Sebuah fenotipe yang serupa diamati ketika biofilm dibuat dalam kondisi statis (Gbr. 2C). Peningkatan biofilm ini hilang ketika mutan itu dilengkapi (Gbr. 2C). Kami melakukan mikroskop confocal pada biofilm statis yang ditanam selama 36 jam, menggunakan pewarnaan Hoechst untuk memvisualisasikan biofilm. Strain mutan menunjukkan biofilm lebih padat dan lebih tinggi (~ 4 kali lipat), konsisten dengan kuantifikasi biomassa menggunakan kristal violet (Gbr. 2D). Kami membandingkan kemampuan FA1090 dan FA1090∆nagZ untuk membentuk biofilm dari waktu ke waktu. Biomassa yang terkait dengan FA1090nagZ terus menumpuk selama 3 hari, sedangkan biomassa biofilm yang diproduksi oleh FA1090 memuncak sekitar 48 jam (Gambar 2E).

Image

Panel ( A ) Foto biofilm dinamis yang dibentuk oleh bakteri wildtype (kiri) dan strain mutan (kanan) setelah 24 jam. Panel ( B ) Kuantifikasi pembentukan biofilm dinamis (n = 6). Panel ( C ) Komplementasi nag Z dalam regangan knock out mengurangi kemampuan mutan untuk membentuk biofilm yang lebih tebal dalam biofilm statis (n = 5). Panel ( D ) Pencitraan confocal dari biofilm statis berumur 24 jam, setelah pewarnaan dengan pewarnaan Hoescht. Strain mutan membentuk biofilm yang lebih tebal dan lebih padat. Skala bar mewakili 100 μm. Panel E: Biofilm statis disiapkan, dan biomassa biofilm ditentukan pada berbagai titik waktu. Data mewakili nilai rata-rata (± SE) dari tiga percobaan independen yang dilakukan dalam rangkap tiga. Statistik adalah uji t dua ekor (*** p <0, 001). ns = Tidak signifikan.

Gambar ukuran penuh

Efek NagZ pada pembentukan biofilm gonokokal

Kami menganalisis evolusi biofilm dari waktu ke waktu menggunakan pemindaian mikroskop elektron. Setelah 12 jam, biofilm yang diproduksi oleh FA1090 dan FA1090ΔnagZ tampak berbeda. Biofilm yang diproduksi oleh FA1090 tampak tidak merata dengan banyak situs nukleasi sedangkan biofilm yang diproduksi oleh FA1090ΔnagZ tampak menyebar di seluruh bidang pandang tanpa situs nukleasi yang jelas (Gbr. 3A). Biofilm ini secara dramatis berbeda dalam penampilan mereka pada 12 jam. Biofilm FA1090ΔnagZ menunjukkan peningkatan kepadatan sel dari waktu ke waktu, sedangkan kepadatan biofilm FA1090 tampaknya memuncak pada 48 jam. Perbedaan ini tidak dapat dijelaskan oleh perbedaan dalam tingkat pertumbuhan karena kedua strain memberikan profil pertumbuhan yang sama (lihat Gambar Tambahan. 3A) atau karena adanya komponen ekstraseluler lainnya karena keseluruhan biomassa biofilm mutan lebih besar.

Image

Panel ( A ) SEM menunjukkan organisasi biofilm yang dihasilkan dari waktu ke waktu (perbesaran 250X). Panel ( B ) adalah SEM dari biofilm FA1090∆nagZ, diolah dan tidak diobati dengan NagZ yang ditambahkan secara eksogen (Perbesaran 5000 X). Tanda panah di panel menunjukkan bahwa pengobatan NagZ tidak menghilangkan untai DNA. Panel ( C ) Kuantifikasi biofilm yang dibentuk oleh strain mutan yang tidak diobati, dan biofilm strain mutan yang diolah dengan NagZ murni, menggunakan metode kristal violet. Ada pengurangan yang signifikan secara statistik dalam biofilm pada pengobatan dengan NagZ (p <0, 001). Uji t dua sisi dengan asumsi varians tidak sama digunakan untuk menentukan signifikansi statistik. Panel ( D ) menunjukkan keberadaan DNA ekstraseluler dalam biofilm kedua strain (perbesaran 20000X). Panel atas adalah FA1090 dan panel bawah adalah FA1090∆nagZ.

Gambar ukuran penuh

Kami berhipotesis bahwa perbedaan yang terlihat dalam biofilm yang dibuat oleh FA1090 dan FA1090∆nagZ adalah karena keberadaan NagZ yang terlokalisasi di lingkungan ekstraseluler. Agar hal ini terjadi, kami berhipotesis bahwa NagZ dapat memperoleh akses ke lingkungan ekstraseluler melalui autolisis. Kami menganalisis dampak NagZ yang ditambahkan secara eksogen pada biofilm yang diproduksi oleh FA1090∆nagZ. Biofilm statis terbentuk dan setelah perawatan dengan protein NagZ, biofilm divisualisasikan menggunakan SEM. Perawatan NagZ mengurangi ketebalan dan kerapatan biofilm yang dibentuk oleh FA1090∆nagZ (Gbr. 3B). Pengurangan biomassa dihitung, dan data menunjukkan lebih dari 50% dari biofilm telah dihapus dengan penambahan NagZ yang ditambahkan secara eksogen (Gbr. 3C). Penambahan NagZ ke suspensi bakteri pada awal pembentukan biofilm juga menghasilkan pengurangan serupa dalam pembentukan biofilm setelah 24 jam (data tidak ditampilkan). Setelah pengobatan NagZ, untaian asam nukleat masih tampak jelas dalam biofilm (Gambar 3B); pengobatan dengan DNase tidak hanya menghilangkan DNA ekstraseluler tetapi juga menurunkan biofilm (data tidak ditunjukkan). Data pada Gambar. 3D menunjukkan keberadaan DNA ekstraseluler dalam biofilm yang diproduksi oleh kedua strain.

Kurangnya nagZ tidak mengubah blebbing

N. gonorrhoeae menghasilkan vesikel membran luar 32 dan perubahan dalam pembentukan vesikel telah diamati pada bakteri dengan defek pada metabolisme peptidoglikan 33 . Karena NagZ terlibat dalam daur ulang peptidoglikan, ada kemungkinan bahwa NagZ dapat mempengaruhi pembentukan biofilm secara tidak langsung dengan meningkatkan pelepasan vesikel membran luar. Menggunakan SEM resolusi tinggi untuk memvisualisasikan arsitektur biofilm dan ultrastruktur bakteri dalam biofilm, kami menentukan jumlah dan ukuran Bleb yang dibuat oleh FA1090 dan FA1090∆nagZ. Kami menemukan bahwa tidak ada perbedaan dalam ukuran bleb atau distribusi antara dua strain, mengesampingkan cacat blebbing membran sebagai penyebab perbedaan dalam pembentukan biofilm (Lihat Gambar tambahan. 4).

Viabilitas sel dalam biofilm

Gambar SEM menunjukkan apa yang tampak sebagai DNA yang melibatkan agregat bakteri secara acak. Karena FA1090 tidak memiliki pulau genetik gonococcal yang terlibat dalam sekresi DNA 34, sumber DNA bisa melalui lisis bakteri atau kebocoran DNA dari sel-sel mati. Data pada Gambar. 4A menunjukkan biofilm bernoda ganda (Hoechst dan propidium iodide (PI)) yang divisualisasikan dengan mikroskop confocal (Hoechst menodai bakteri hidup dan mati sedangkan PI hanya meresap ke membran bakteri mati). Gambar 4B menunjukkan kuantifikasi gambar-gambar ini dengan membandingkan rasio intensitas fluoresensi rata-rata (FIR) dari pewarnaan Hoechst ke pewarnaan PI. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam proporsi bakteri hidup-mati yang diamati, meskipun jumlah bakteri mati meningkat dari waktu ke waktu seperti yang terlihat oleh peningkatan intensitas fluoresensi PI. Pada 72 jam, kedua biofilm mengandung sebagian besar sel mati.

Image

( A ) Biofilm statis dibentuk dengan strain FA1090 dan FA1090∆nagZ untuk periode waktu yang berbeda, dan divisualisasikan dengan mikroskop confocal setelah pewarnaan dengan propidium iodide (merah) dan Hoechst (hijau). ( B ) Rasio intensitas fluoresensi (FIR) antara Hoechst dan PI diukur untuk kedua strain pada tiga titik waktu. Tidak ada perbedaan signifikan yang diamati antara rasio sel mati dan sel hidup pada berbagai titik waktu.

Gambar ukuran penuh

Pengaruh ekspresi NagZ pada pembentukan Biofilm pada sel manusia

Kami menentukan kemampuan FA1090 dan FA1090∆nagZ untuk membentuk biofilm pada sel T84 terpolarisasi. Biofilm yang terbentuk pada permukaan apikal divisualisasikan oleh SEM (Gambar 5A). Area permukaan yang dicakup oleh biofilm dikuantifikasi menggunakan ImageJ dan persentase area yang dicakup oleh biofilm ditentukan. Data (Gbr. 5B) menunjukkan bahwa galur mutan menutupi area permukaan secara signifikan lebih banyak daripada galur tipe liar, konsisten dengan eksperimen yang dilakukan pada kaca penutup kaca. Meskipun kami tidak dapat mengukur total biomassa dari dua biofilm ini, tampak bahwa biofilm FA1090∆nagZ lebih tinggi daripada biofilm FA1090.

Image

Sisi kiri gambar adalah SEM yang representatif dari sel T84 pada perbesaran berbeda, dijajah dengan atau tanpa tambahan gonokokus. Kontrol no sel adalah sel epitel T84 yang tidak diobati yang menunjukkan morfologi normal sel-sel ini sebagaimana divisualisasikan oleh SEM. Grafik di sebelah kanan adalah kuantifikasi biofilm. Persentase permukaan yang ditutupi oleh biofilm diukur menggunakan analisis ImageJ. Beberapa gambar (n = 9) dievaluasi menggunakan SEM dan signifikansi perbedaan yang ditentukan dengan uji-t Student. (*** p <0, 001).

Gambar ukuran penuh

Untuk menetapkan relevansi klinis NagZ dalam pembentukan biofilm, kami memperoleh jaringan serviks dari wanita yang menjalani operasi rahim dan bersumber dari National Disease Research Interchange (NDRI). Sampel jaringan terinfeksi dengan ~ 10 9 bakteri per sampel jaringan, dan setelah 48 jam inkubasi, kehadiran GC pada sampel divisualisasikan dengan confocal microscopy. Fungsi ubin Peta digunakan untuk mengambil gambar dari bagian-bagian kecil dari jaringan sebagai Z-stack, dan semua gambar ubin menggunakan perangkat lunak otomatis untuk membuat Z-stack seluruh spesimen serviks. Tumpukan diproyeksikan Z seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6A. Jumlah relatif sel serviks di daerah sampel tertentu ditentukan berdasarkan intensitas fluoresensi dari noda Hoescht (biru), yang menodai nuklei. Bentuk keseluruhan eksplan ditunjukkan oleh pewarnaan aktin (hijau). Jumlah relatif GC dalam suatu daerah sampel ditentukan berdasarkan fluoresensi merah, yang merupakan hasil dari immunostaining GC. Kuantitas biofilm didefinisikan sebagai rasio intensitas fluoresensi merah terhadap intensitas fluoresensi biru. Ini kemudian dinormalisasi menjadi 100 (Gbr. 6C). Data ini menunjukkan bahwa galur nagZ menghasilkan biofilm dengan jumlah GC empat kali lipat dibandingkan galur jenis liar, yang sesuai dengan eksperimen yang dilakukan pada permukaan abiotik.

Image

Gonococci diizinkan untuk membentuk biofilm selama 48 jam pada jaringan eksplan serviks dan setelah fiksasi divisualisasikan dengan mikroskop confocal. Panel ( A ) menunjukkan jaringan yang diwarnai untuk DNA (Hoechst - biru), aktin (phalloidin - hijau), dan gonokokus (antibodi anti-GC - merah). Bagian paling kanan panel ( A ) menunjukkan hamparan semua saluran. Skala bar sesuai dengan 500 μm. Panel ( B ) adalah pembesaran area yang sama seperti yang ditunjukkan pada panel ( A ) untuk memungkinkan visualisasi inti yang berbeda. Semua area yang diperbesar berasal dari posisi yang sama seperti yang ditunjukkan untuk GC. Biomassa GC pada jaringan eksplan serviks diukur dengan menormalkan rasio rata-rata intensitas fluoresensi (MFI) gonokokus pada biofilm terhadap pewarnaan relatif nuklir. Sampel dari strain tipe liar dinormalisasi menjadi 100%. Hasilnya adalah rata-rata 10 bidang independen dari dua percobaan independen. Signifikansi perbedaan ditentukan dengan uji-t Student. (*** p <0, 001).

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Sementara N. gonorrhoeae dapat membentuk biofilm in vivo dan in vitro 2, mekanisme pembentukannya dan proses yang memediasi penyebarannya masih belum jelas. Kami menunjukkan bahwa ketika GC tidak memiliki kemampuan untuk membuat NagZ, mereka menghasilkan biofilm yang lebih kuat yang terus menumpuk dari waktu ke waktu (Gbr. 2) dan NagZ yang ditambahkan secara eksogen mengurangi biofilm ini (Gbr. 3). Karena NagZ berperan dalam pergantian peptidoglikan (PG) pada organisme lain 23, dan mampu bertindak secara analog pada fragmen peptidoglikan gonococcal, NagZ dapat dianggap sebagai contoh lain dari enzim penerangan cahaya bulan 35 .

Studi mikroskopis elektron dari spesimen biopsi serviks dari pasien dengan infeksi N. gonorrhoeae yang terbukti kultur telah mengungkapkan bukti biofilm; biofilm-biofilm ini nampaknya hanya beberapa bakteri setebal 36 . Tidak jelas mengapa biofilm ini tidak mengambil kualitas yang terlihat pada permukaan abiotik atau pada sel kultur jaringan. Karena biofilm FA1090∆nagZ secara signifikan lebih tebal pada sel-sel kultur jaringan dan eksplan serviks dibandingkan FA1090, kami menyarankan bahwa pelepasan NagZ selama autolisis membatasi akumulasi biomassa.

Telah dihipotesiskan bahwa biofilm GC yang dihasilkan selama kolonisasi cevix menghasilkan gerbong tanpa gejala 36 . Bagaimana N. gonorrhoeae menekan perkembangan respon imun adaptif selama infeksi alami di hadapan fragmen peptidoglikan imunostimulatori tidak jelas. Kami menyarankan bahwa penghilangan N-asetilglukosamin dari monomer peptidoglikan toksik 38 menjadikannya imunosilen, dan pelepasan N-asetilglukosamin menekan fungsi neutrofil 39 dan induksi sitokin proinflamasi [ 40] . Oleh karena itu, pembebasan N-acetylglucosamine dari fragmen peptidoglikan oleh NagZ dapat berfungsi untuk menekan pensinyalan imunologis ketika gonococcus menjajah mukosa serviks.

Prosedur Eksperimental

Strain bakteri dan plasmid

N. gonorrhoeae ditanam dalam medium gonokokus standar (Difco, MI), ditunjuk GCP jika digunakan sebagai kaldu buffer-fosfat, dan GCK yang ditunjuk jika digunakan dengan agar, ditambah dengan 1% suplemen Kellogg 41, pada 37 ° C dan 5% CO 2 . Strain F62∆8-1 telah dijelaskan sebelumnya dan merupakan strain yang dihapus secara genetik untuk lgtA 42 . Semua galur GC adalah fenotipik non-piliated dan Opa negatif. E. coli BL21 (DE3) dan E. coli DH5αMCR (Life Technologies, MD) ditanam dalam L broth (LB) pada suhu 37 ° C atau 30 ° C 43 . Antibiotik yang dimasukkan dalam media digunakan pada konsentrasi akhir berikut (μg ml- 1 ): ampisilin 100, kanamisin 50. Plasmid pUC19 (New England Biolab) dan pET28a (+) (Novagen) digunakan untuk membuat penghapusan pada berbagai jenis N. gonorrhoeae dan untuk mengekspresikan protein NagZ, masing-masing. Strain S. aureus SH1000 diperoleh dari Dr. Jeffery Kaplan, Universitas George Washington.

Bahan Kimia dan Reagen

Semua reagen dibeli dari Sigma-Aldrich, kecuali dinyatakan lain. Reaksi rantai polimerase dilakukan menggunakan Pfu polimerase (Thermo Scientific Molecular Biology, Pittsburgh, PA) atau GoTaq polimerase (Promega, Madison, WI), dan dilakukan sesuai dengan instruksi pabrik. Semua enzim restriksi bersumber dari New England Biolabs (Beverly, MA). Sampel Dispersin B diperoleh dari Dr. Jeffery Kaplan, Universitas George Washington.

Konstruksi mutan

Daftar semua primer yang digunakan disediakan pada Tabel 1. Sebuah fragmen DNA yang membawa gen nagZ dari N. gonorrhoeae FA1090 bersama dengan ~ 850 bp sekuens sisi mengapit kanan dan kiri diamplifikasi menggunakan primer hexoF dan hexoR. Amplikon yang dihasilkan (~ 2700 bp) diklon ke situs EcoRI dan HindIII pUC19 dan diubah menjadi E. coli DH5αMCR, menghasilkan pembentukan pUC19 :: nagZ. Salah satu klon yang terisolasi digunakan untuk percobaan lebih lanjut. Untuk mengganggu nagZ dalam gonococcus, gen resistensi Kanamycin (Kan) dikeluarkan dari pK18 44 dengan SmaI, fragmen DNA yang dimurnikan dari gel agarose dan dimasukkan ke situs EcoRV pUC19 :: nagZ. Plasmid dari klon E. coli yang diduga membawa pUC19 :: nagZ :: Kan diisolasi dan konstruknya diverifikasi dengan sekuensing DNA (Macrogen, USA). DNA plasmid ini dibelah dengan EcoRV dan diikat dengan DNA oligo untai ganda yang dibuat dari DUSF dan DUSR, yang berisi dua situs EcoRV dan urutan pengambilan DNA N. gonorrhoeae , setelah dibelah dengan EcoRV. Transforman resisten kanamisin dipilih, DNA plasmid diisolasi dan diperiksa untuk keberadaan urutan serapan. DNA plasmid dari klon tersebut digunakan untuk transformasi galur N. gonorrhoeae dengan metode transformasi cair 45 dan dipilih pada pelat GCK yang mengandung kanamisin (50 ug / ml). nagZ dihapus oleh teknik transformasi tempat 46 di N. gonorrhoeae FA1090. Strain yang dilengkapi nagZ dibangun menggunakan amplikon PCR yang dihasilkan dengan primer hexoF dan hexoR untuk mengubah strain yang dihapus, menggunakan teknik transformasi tempat ( 43) .

Tabel ukuran penuh

Ekspresi dan pemurnian protein NagZ

Pengkodean fragmen DNA nagZ diisolasi dari N. gonorrhoeae FA1090 diamplifikasi menggunakan primer Ngo0135F dan Ngo0135R dan amplikon yang dihasilkan (1300 bp) dikloning ke pET28a (+) menggunakan NheI dan XhoI, menghasilkan pembentukan plasmid pET28a (+) :: nagZ . Untuk memurnikan NagZ, sebuah koloni tunggal yang dihasilkan oleh transformasi E. coli BL21 (DE3) dengan pET28a (+) :: nagZ digunakan untuk menginokulasi 100 ml kaldu LB dengan kanamycin. Kultur diinkubasi pada suhu 37 o C, dan ketika OD 600 kultur mencapai 0, 6, IPTG ditambahkan ke konsentrasi akhir 1 mM. Inkubasi dilanjutkan pada 30 ° C selama 12 jam tambahan. Kultur disentrifugasi dan pelet bakteri diresuspensi dalam 10 ml buffer A yang mengandung 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8.0), 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 10 mM -mercaptoethanol, 0, 1% (v / v) Antara 20, 100 μM PMSF. Setelah sonikasi, debris seluler dihilangkan dengan sentrifugasi pada 40.000 g selama 1 jam dan kemudian supernatan diterapkan pada kolom agarosa Ni-NTA 3 ml yang sebelumnya diseimbangkan dengan 100 ml buffer di atas. Kolom dicuci dengan 100 ml buffer B yang mengandung 50 mM NaH 2 PO 4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole dan 10% (v / v) gliserol dan protein dielusi dengan 6 ml buffer B yang mengandung peningkatan konsentrasi imidazole (20 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM dan 250 mM). N-asetil-β-D-heksaminidase dielusi pada 150 mM – 200 mM. Fraksi yang mengandung protein yang dimurnikan dikumpulkan dan didialisis terhadap buffer B dan diterapkan kembali ke kolom agarosa Ni-NTA. Kemurnian enzim ditentukan dengan menjalankan alikuot pada 15% SDS-PAGE. PageRuler TM tangga protein ternama (170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15 dan 10 kDa) (Fermentas) digunakan sebagai penanda berat molekul protein.

Pemurnian dan analisis LOS

LOS dimurnikan dari sel yang ditumbuhkan kaldu dengan metode fenol-air panas 47 . LOS kemudian dipekatkan dengan liofilisasi dan ekstraksi dengan air fenol-panas dilanjutkan sampai preparasi memperoleh absorbansi minimal pada 200 nm. LOS dianalisis pada gel Tris-Tricine 16, 5% pada arus tetap 0, 03 mA dalam ruang pendingin es, dan divisualisasikan dengan pewarnaan perak 48 .

Uji hexosaminidase

Aktivitas enzim diuji dengan menggunakan berbagai p-nitrooligosaccharides sebagai substrat. Campuran reaksi standar terdiri dari 20 μl larutan substrat pada konsentrasi akhir 1, 2 mM, 20 μl 1 M KPO 4 buffer pH 8, 0 (konsentrasi akhir 200 mM), 50 μl air dan 2 μg enzim (konsentrasi akhir μg 380 nM). Setelah 30 menit inkubasi pada suhu 37 ° C, reaksi dihentikan dengan penambahan 50 μl dari 200 mM gliserin buffer NaOH pH 10. Air (860 μl) kemudian ditambahkan dan pelepasan p-nitrophenol dari substrat dipantau pada 405 nm . Satu unit (U) enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim yang melepaskan 1 μmol p-nitrofenol dari pNP-GlcNAc per menit pada suhu 37 o C.

Pembentukan biofilm

Untuk menyiapkan biofilm, bakteri dari kultur semalam ditanam di piring agar GCK disuspensikan dalam GCP dengan natrium bikarbonat dan suplemen Kellogg hingga konsentrasi akhir 10 8 bakteri per mL. Biofilm dinamis ditanam dalam tabung gelas baru yang disterilkan dengan menambahkan 1 mL suspensi bakteri per tabung, dan menginkubasi dalam pengocok rotari selama 48 jam. Biofilm statis diperoleh dengan membuat suspensi bakteri ke Klett 100 di GCP dan menambahkan alikuot ke labu menggunakan metode yang dipublikasikan 49 . Biofilm dihitung dengan pewarnaan dengan kristal violet 1% b / v. Biofilm bernoda kristal violet dielusi dengan melarutkan dalam asam asetat 30% dan absorbansi dibaca pada 590 nm dalam spektrofotometer.

Protokol yang sama digunakan untuk mempelajari pembentukan biofilm pada sel epitel terpolarisasi. Sel epitel T84 diunggulkan pada 10 5 per transwell insert dalam 24 well plate dan ditanam selama 10 hari. Sel-sel dianggap terpolarisasi setelah tingkat resistensi listrik transepitel (TEER) mencapai di atas 1500 Ω.cm 2 . Bakteri ditambahkan pada permukaan apikal dan biofilm yang terbentuk untuk titik waktu yang berbeda. Untuk pemindaian mikroskop elektron, membran transwell difiksasi dalam glutaraldehid dan membran dipotong dan dikeluarkan dari insert sebelum pewarnaan.

Analisis Mikroskopi konfokal

Biofilm statis ditanam di 35 mm microwell dish bawah kaca dengan No. 15 coverglass (MatTek, MA) selama 48 jam. Biofilm dicuci dengan PBS tiga kali dan diwarnai dengan pewarnaan Hoechst selama 15 menit diperbaiki dengan 4% PFA selama 20 menit divisualisasikan dengan mikroskop confocal Leica TCS SP5 X (Leica Microsystems, IL, USA).

Memindai mikroskop elektron

Biofilm statis ditanam selama 36 jam di atas kaca penutup yang ditempatkan di dalam pelat kultur sel 24-sumur. Secara singkat, coverlips dicuci dengan lembut dengan PBS, dan difiksasi dengan 2% glutaraldehyde selama 60 menit di RT dan kemudian semalam pada suhu 4 o C. Coverlips diperbaiki pada hari berikutnya menggunakan 1% osmium tetroxide, didehidrasi oleh serangkaian pencucian dengan peningkatan konsentrasi etanol, dikeringkan dengan metode pengeringan titik kritis, dan akhirnya dilapisi dengan paduan paladium emas. Sampel divisualisasikan dengan mikroskop Amray 1820D (20 kV) dan mikroskop Hitachi S4700 (5 kV).

Infeksi serviks

Wanita yang menjalani operasi rahim memberikan persetujuan untuk penggunaan sampel jaringan serviks, yang diperoleh dari NDRI (National Disease Research Interchange). Dewan Peninjau Institusional Universitas Maryland menyetujui percobaan dan metode, yang dilakukan sesuai dengan pedoman yang disetujui. Jaringan endoserviks ini diterima dalam 24 jam pasca operasi. Sampel dipotong menjadi ~ 2, 5 cm (L) × 0, 6 cm (W) × 0, 3 cm (H) potongan, diinkubasi dalam CMRL-1066 (GIBCO) ditambah antibiotik selama 24 jam, dan beralih ke media bebas antibiotik selama 24 jam. Gambar 6 jaringan terinfeksi dengan sekitar 10 9 bakteri per sampel jaringan. Setelah 48 jam masa inkubasi, jaringan yang difiksasi dengan paraformaldehyde, cryopreservasi dalam gelatin, cryosectioned, dan immunostained. Antibodi yang digunakan untuk memberi label GC adalah seperti yang dijelaskan sebelumnya 50 . Gambar diperoleh dengan mikroskop confocal menggunakan fungsi ubin peta digunakan untuk mengambil gambar bagian-bagian kecil dari jaringan sebagai Z-stack, dan semua gambar ubin menggunakan perangkat lunak otomatis untuk membuat Z-stack dari seluruh sampel.

informasi tambahan

Cara mengutip artikel ini : Bhoopalan, SV et al. nagZ Memicu Pembongkaran Biofilm Gonococcal. Sci. Rep. 6, 22372; doi: 10.1038 / srep22372 (2016).

Informasi tambahan

Dokumen Word

  1. 1.

    Angka Tambahan

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.