Regulasi negatif pensinyalan reseptor kemokin dan kemotaksis sel-b oleh p66shc | kematian sel & penyakit

Regulasi negatif pensinyalan reseptor kemokin dan kemotaksis sel-b oleh p66shc | kematian sel & penyakit

Anonim

Subjek

  • Sel B
  • Pensinyalan sel
  • Kemokin
  • Chemotaxis

Abstrak

Adaptor Shc (Src homology 2 domain) adalah komponen di mana-mana dari jalur pensinyalan yang dipicu oleh reseptor tyrosine kinase-coupled. Dalam limfosit, mirip dengan jenis sel lainnya, isoform p52 dan p66 dari ShcA / Shc berpartisipasi dalam loop terbatas sendiri di mana p52Shc bertindak sebagai regulator positif pensinyalan reseptor antigen dengan mempromosikan aktivasi Ras, sedangkan p66Shc membatasi aktivitas ini dengan menghambat p52Shc secara kompetitif . Berdasarkan fakta bahwa banyak mediator pensinyalan dibagikan oleh reseptor antigen dan kemokin, termasuk p52Shc, kami telah menilai implikasi potensial dari p66Shc dalam regulasi respon sel-B terhadap chemokine, dengan fokus pada reseptor homing CXCR4 (reseptor kemokin tipe CXC 4) ) dan CXCR5 (reseptor kemokin CXC tipe 5). Hasilnya mengidentifikasi p66Shc sebagai regulator negatif dari respon chemotactic yang dipicu oleh reseptor ini, termasuk adhesi, polarisasi dan migrasi. Kami juga memberikan bukti bahwa fungsi ini tergantung pada kemampuan p66Shc untuk berinteraksi dengan reseptor kemokin dan mempromosikan perakitan kompleks penghambatan, yang meliputi fosfatase SHP-1 (Src homologi fosfatase-1) dan SHIP-1 (domain SH2 -mengandung inositol 5'-fosfatase-1), yang mengakibatkan gangguan reorganisasi Vav-dependen dari sitoskeleton aktin. Fungsi ini memetakan ke residu tirosin terfosforilasi dalam domain homologi kolagen 1 (CH1). Hasilnya mengidentifikasi p66Shc sebagai regulator negatif dari chemotaxis sel-B dan menyarankan peran adaptor ini dalam kontrol homing sel-B.

Utama

Homeostasis dan aktivasi limfosit memerlukan lalu lintas sikliknya melalui organ limfoid sekunder (SLO). Homing limfosit untuk SLO, serta lalu lintasnya di dalamnya, diatur oleh reseptor yang merespons kemokin yang diturunkan dari sel stroma. 1 Reseptor homing sel B utama adalah CCR7 (CC chemokine receptor type 7) dan CXCR4 (CXC chemokine receptor type 4) yang bertanggung jawab untuk jalan keluar dari aliran darah dan masuk ke dalam SLO, 2 sedangkan lalu lintas sel B ke folikel diatur oleh CXCR5 (CXC chemokine receptor type 5). 3 Reseptor ini juga membantu mempertahankan sel-B dalam SLO yang penting bagi sel-B untuk menerima isyarat bertahan hidup dan menjadi diaktifkan dengan adanya antigen. 3

Reseptor kemokin mengatur langkah-langkah berurutan dari limfosit, yaitu, penangkapan, polarisasi dan migrasi transendotelial, keduanya dengan memicu konversi integrin ke konformasi afinitas tinggi mereka untuk ligan pada sel endotel (EC), yang menghasilkan adhesi yang kuat, dan dengan mempromosikan pengaturan ulang sitoskeletal yang diperlukan untuk polarisasi dan migrasi. 4 Reseptor kemokin adalah reseptor transmembran tujuh bentang yang dipasangkan dengan Gi-protein yang mengurangi produksi siklik adenosin monofosfat (cAMP) dengan menghambat adenilat siklase. 5 Src kinase berpartisipasi dalam jalur yang bergantung pada Gi / cAMP yang dipicu oleh reseptor kemokin, memulai kaskade foshorylation yang mempromosikan pensinyalan ke dalam ke luar ke integrin dan pengaturan ulang sitoskeletal yang bergantung pada GTPase yang diperlukan untuk polarisasi dan migrasi sel. 6, 7, 8 Reseptor kemokin juga memicu jalur independen Gi-, Janus kinase (JAK) yang terlibat dalam migrasi sel. 8 Oleh karena itu, kemotaksis diatur secara terkoordinasi oleh beberapa jalur pensinyalan.

Berbeda dengan sel T, di mana pensinyalan oleh reseptor kemokin telah dikarakterisasi sampai batas yang signifikan, pemahaman kita tentang kaskade pensinyalan yang dipicu oleh reseptor homing dalam sel B sangat terbatas, terlepas dari kenyataan bahwa beberapa molekul terlibat, seperti limpa tirosin kinase (Syk), fosfatidlinositida 3-kinase (PI3-K) dan tirosin kinase Bruton (Btk), dieksploitasi secara terapi untuk pengobatan neoplasma sel-B. 10, 11 Secara khusus, peran adaptor yang memasangkan proksimal tirosin kinase (TK) ke mediator hilir dalam jalur pensinyalan sel-B lainnya masih sangat sulit dipahami.

Adaptor Shc (mengandung domain Src 2) telah terlibat dalam semua proses seluler sentral, termasuk proliferasi, diferensiasi, ketahanan hidup, dan motilitas. 12 Dalam limfosit, isoform p52 dan p66 ShcA / Shc membentuk loop self-limiting, dengan p52Shc yang secara positif mengatur pensinyalan antigen receptor (AgR) dan p66Shc bertindak sebagai inhibitor kompetitif. 12 Dengan demikian, respons mitogenik dan kelangsungan hidup terhadap keterlibatan AgR ditingkatkan pada tikus p66Shc - / -, yang menghasilkan autoimunitas. Selain itu, sel-B leukemia limfositik kronis (CLL) memiliki cacat dalam ekspresi p66Shc yang berkontribusi terhadap kelangsungan hidup mereka yang lebih lama. Berdasarkan fakta bahwa banyak mediator pensinyalan dibagikan oleh AgRs dan reseptor kemokin, termasuk p52Shc, 15 di sini kami telah menilai implikasi potensial p66Shc dalam regulasi respon sel-B terhadap chemokine. Kami menunjukkan bahwa p66Shc bertindak sebagai regulator negatif dari semua langkah respon chemotactic yang dipicu oleh CXCR4 dan CXCR5 dengan menghambat reorganisasi cytoskeleton actin yang bergantung pada vav dan memberikan wawasan tentang mekanisme di mana p66Shc memisahkan reseptor-reseptor ini dari aktivasi Vav.

Hasil

p66Shc menghambat adhesi dan polarisasi sel B yang bergantung pada CXCR4- dan CXCR5

Adhesi sel-B pada EC diatur oleh fungsi limfosit terkait antigen-1 integrin (LFA-1), yang berinteraksi dengan molekul adhesi sel-1 (ICAM-1), dan antigen-4 yang sangat terlambat (VLA-4), yang berinteraksi dengan VCAM-1 dan komponen ECM, fibronectin (FN). Peran p66Shc dalam adhesi sel-B pada awalnya dibahas dalam sel B-sel MEC yang kekurangan p66Shc, 14 secara stabil ditransfeksi dengan konstruksi pengkodean p66Shc, menggunakan sel-sel kosong yang ditransfeksi vektor sebagai kontrol. Semua transfectants menyatakan tingkat yang sama LFA-1 dan VLA-4, serta CXCR4 dan CXCR5 (Tambahan Gambar S1A). Sel-sel dilapisi pada ICAM-1 atau FN yang diimobilisasi dengan ada atau tidak adanya CXCL12 (chemokine motif CXC 12) atau CXCL13 (chemokine motif CXC 13). Proporsi sel yang melekat setelah inkubasi pendek ditentukan oleh flow cytometry. Seperti yang diharapkan, sel-sel kontrol mengalami perubahan morfologis yang mendalam di hadapan kedua kemokin, dari bulat ke fenotip terpolarisasi ditandai dengan tonjolan yang kaya F-aktin (Gambar 1a). Ekspresi p66Shc mengakibatkan kerusakan adhesi yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 pada ICAM-1 / FN (Gambar 1b). Konsisten dengan temuan ini, pencitraan sel-sel ini menunjukkan bahwa pola punctate dari LFA-1, yang dihasilkan dari pengelompokan integrin setelah pergeseran konformasi afinitas tinggi, 16 hilang dalam sel MEC yang mengekspresikan p66Shc (Tambahan Gambar S2). Polarisasi juga terganggu dengan adanya p66Shc, sebagaimana dinilai dengan mengukur sel-sel yang diwarnai phalloidin yang mengandung morfologi terpolarisasi (Gambar 1a dan c).

Image

p66Shc menghambat adhesi dan polarisasi sel B yang bergantung pada CXCR4- dan CXCR5, bergantung pada integrin. ( a ) Analisis imunofluoresensi kontrol transfectants MEC (ctr) yang dilapisi pada slide yang dilapisi dengan 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc, baik tidak distimulasi atau distimulasi dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13, dan diberi label dengan Phalloidin- TRITC (merah) dan antibodi anti-aktin (hijau). Bagian optik rata-rata ditampilkan. Ukuran bar, 5 m. ( B, d ) Kuantifikasi oleh flow cytometry dari persentase ctr dan p66 sel MEC yang ditransfusikan secara stabil ( b ) atau dari splenosit dari tikus wt dan p66Shc - / - ( d ) yang melekat pada pelat 48 sumur yang dilapisi dengan 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc atau 10 μg / ml Fibronectin setelah 10 menit perawatan dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Sel-sel tikus diberi label dengan antibodi anti-CD3-FITC / anti-CD22-PE sebelum analisis. Data, yang merujuk pada sampel rangkap empat dari empat percobaan independen, disajikan sebagai% dari total sel input yang tetap melekat pada masing-masing sumur. Bilah galat, SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01; *** P ≤0.001. ( c, e ) Kuantifikasi persentase sel terpolarisasi dalam ctr dan p66 transfectants MEC ( c ) atau dalam limfosit B yang dimurnikan dari limpa tikus wt dan p66Shc - / - ( e ) berlapis selama 5 menit pada slide yang dilapisi dengan 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc atau 10 μg / ml Fibronectin distimulasi selama 5 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13 dan diberi label dengan Phalloidin-TRITC dan antibodi anti-aktin. Persentase terpolarisasi terhadap sel yang tidak terpolarisasi dihitung pada empat gambar bidang lebar yang berbeda dari masing-masing sumur dalam tiga percobaan independen. Bilah galat, SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01

Gambar ukuran penuh

Percobaan serupa dilakukan pada sel B limpa dari tikus tipe-liar dan p66Shc - / - . Adhesi yang bergantung pada CXCL12 dan CXCL13 terhadap ICAM-1 / FN (Gambar 1d), serta polarisasi (Gambar 1e), secara signifikan ditingkatkan dalam sel-sel p66Shc - / - B dibandingkan dengan rekan-rekan tipe liar mereka, menunjukkan bahwa ekspresi dari p66Shc pada tingkat fisiologis sudah cukup untuk mengatur respons sel B secara negatif terhadap kemokin ini. Tidak ada perbedaan yang diamati dalam tingkat ekspresi LFA-1 / VLA-4 atau CXCR4 / CXCR5 antara wild-type dan p66Shc - / - B-sel (Tambahan Gambar S1B). Oleh karena itu, p66Shc bertindak sebagai regulator negatif dari jalur keluar-keluar yang memasangkan CXCR4 / CXCR5 ke aktivasi integrin.

p66Shc menghambat kemotaksis sel B yang bergantung pada CXCR4- dan CXCR5

Implikasi p66Shc dalam kemotaxis sel B dibahas dalam tes migrasi transwell, menggunakan CXCL12 / CXCL13 sebagai chemoattractants. Migrasi yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 terganggu pada sel MEC yang mengekspresikan p66Shc dibandingkan dengan kontrol (Gambar 2a). Konsisten dengan pengamatan ini, migrasi sel p66Shc - / - B menuju CXCL12 / CXCL13 ditingkatkan dibandingkan dengan kontrol tipe liar (Gambar 2b).

Image

p66Shc menghambat kemotaksis sel B yang bergantung pada CXCR4- dan CXCR5. ( a ) Migrasi cfect dan p66 transfectants MEC, diukur setelah perawatan selama 3 jam dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Data, diperoleh pada sampel duplikat dari setidaknya tiga percobaan independen, disajikan sebagai indeks migrasi rata-rata ± SD (rasio sel yang bermigrasi dalam sampel yang diobati dengan chemokine dibandingkan sampel yang tidak diobati). *** P ≤0.001. Stimulus kemotaktik yang tidak berhubungan (10 μ M f-MLP) digunakan sebagai kontrol negatif. Tidak ada migrasi sel kontrol atau MEC yang mengekspresikan p66Shc yang diamati dalam menanggapi pengobatan ini (data tidak ditampilkan). ( B ) Migrasi sel yang diperoleh dari limpa, sumsum tulang atau kelenjar getah bening dari wt dan p66Shc - / - tikus dirawat selama 3 jam dengan 100 ng / ml mCXCL12 atau 200 ng / ml mCXCL13 dan kemudian diwarnai dengan anti-CD3-FITC / antibodi anti-CD22-PE. Data, diperoleh pada sampel duplikat dari setidaknya tiga percobaan independen, disajikan sebagai indeks migrasi rata-rata ± SD * P ≤0, 05; ** P ≤0, 01. ( c dan d ) Kuantifikasi oleh flow cytometry dari persentase ctr dan p66 sel MEC yang ditransfusikan secara stabil ( c, panel bawah) atau dari splenosit dari tikus wt dan p66Shc - / - ( d ) yang tetap melekat pada sel stroma yang tumbuh pada 48- well plate setelah stimulasi dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Sebelum menghitung, sel MEC diberi label dengan mAb anti-CD19-FITC dan sel tikus dengan antibodi anti-CD3-FITC / anti-CD22-PE. Data, yang merujuk pada sampel rangkap empat dari setidaknya empat percobaan independen, disajikan sebagai% dari total sel input yang tetap melekat pada masing-masing sumur. Bilah galat, SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01; *** P ≤0.001. ( c, panel atas). Analisis imunofluoresensi ctr dan p66 transfectants MEC masing-masing diwarnai dengan DiO (hijau) atau Dil (merah) diinkubasi selama 10 menit pada sel stroma yang ditumbuhkan pada slide 8-sumur dan baik distimulasi atau distimulasi selama 40 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Bagian optik rata-rata ditampilkan. Ukuran bar, 5 m

Gambar ukuran penuh

Kemampuan p66Shc untuk mempengaruhi kemotaksis selanjutnya dinilai dalam tes pseudoemperipolesis sel-B yang mengukur kemampuan sel-B untuk bermigrasi di bawah sel stroma yang dikultur bersama. 17 Emperipolesis spontan tidak terpengaruh oleh p66Shc. Perbedaannya, sel MEC yang mengekspresikan p66Shc menjalani pseudoemperipolesis yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 dengan efisiensi yang lebih rendah dibandingkan dengan kontrol (Gambar 2c). Cacat ini dikonfirmasi dalam percobaan kultur menggunakan campuran kontrol dan sel MEC yang mengekspresikan p66Shc yang dilabeli dengan probe fluoresen yang berbeda. Memang, sejumlah kecil sel yang mengekspresikan p66Shc menjalani pseudoemperipolesis dibandingkan dengan kontrol dalam lapisan sel stroma yang sama (Gambar 2c). Konsisten dengan hasil ini, pseudoemperipolesis ditingkatkan pada p66Shc - / - B-sel dibandingkan dengan sel B tipe liar (Gambar 2d). Oleh karena itu, p66Shc bertindak sebagai regulator negatif migrasi sel B yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5.

p66Shc menghambat polimerisasi aktin yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 dan aktivasi Vav

Kemampuan p66Shc untuk mempengaruhi polarisasi sel B dan migrasi dalam menanggapi CXCL12 / CXCL13 menunjukkan bahwa hal itu mungkin terlibat dalam penggandengan CXCR4 / CXCR5 untuk polimerisasi aktin. Masalah ini telah diatasi dengan confocal microscopy of control dan sel MEC yang mengekspresikan p66Shc yang dilapisi ICAM-1 / FN di hadapan atau tidak adanya CXCL12 atau CXCL13. Sel diberi label dengan phalloidin untuk mengidentifikasi F-actin dan anti-actin monoclonal antibody (mAb) sebagai kontrol normalisasi. Pengukuran intensitas fluoresensi F-aktin menunjukkan bahwa ekspresi p66Shc menghasilkan kerusakan signifikan pada polimerisasi aktin yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 (Gambar 3a; tidak diperlihatkan untuk FN). Percobaan serupa dilakukan pada sel wild type dan p66Shc - / - B yang murni. Polimerisasi aktin yang lebih kuat sebagai respons terhadap CXCL12 / CXCL13 dari p66Shc - / - B-cell yang dilapisi ICAM-1 (Gambar 3b) atau FN (tidak ditampilkan) diamati ketika dibandingkan dengan sel-B tipe liar, mendukung peran untuk p66Shc dalam kopling CXCR4 / CXCR5 untuk aktinisasi polimerisasi.

Image

p66Shc menghambat polimerisasi aktin yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 dan fosforilasi Vav. ( a dan b ) Kuantifikasi polimerisasi aktin dalam transfectan MTR ctr dan p66 ( a ) atau dalam limfosit B yang dimurnikan dari limpa tikus wt dan p66Shc - / - ( b ), disepuh selama 5 menit pada slide yang dilapisi dengan 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc dan distimulasi selama 5 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Slide kemudian diberi label dengan Phalloidin-TRITC dan antibodi anti-aktin. Data, dihitung pada empat gambar bidang luas yang berbeda dari empat percobaan independen, disajikan sebagai intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) dari pewarnaan Phalloidin dalam sampel yang distimulasi dibandingkan yang tidak distimulasi, dikuantisasi menggunakan perangkat lunak ImageJ dan dinormalisasi dengan konten aktin intraseluler. Bilah galat, SD ** P ≤0.01; *** P ≤0.001. ( c ) Analisis imunoblot dengan antibodi anti-fosfo-Vav supernatan postnuclear dari ctr dan p66 transfectants MEC baik tidak distimulasi atau distimulasi selama 1 atau 5 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 (kiri) atau 200 ng / ml CXCL13 (kanan). Kontrol imunoblot anti-Vav dari filter yang dilucuti ditunjukkan di bawah ini. Migrasi penanda massa molekul ditunjukkan. ( d, kanan) Analisis mikroskopis konfokal dari fosforilasi Vav dalam ctr dan p66 transfectants MEC berlapis selama 5 menit pada slide yang dilapisi dengan 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc dan distimulasi selama 2 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Slide kemudian diberi label dengan antibodi anti-fosfo-Vav dan anti-Vav. Bagian optik rata-rata ditampilkan. Ukuran bar, 5 m. ( d, kiri) Kuantifikasi fosforilasi Vav pada empat gambar bidang-lebar yang berbeda dari tiga percobaan independen disajikan sebagai MFI pewarnaan fosfo-Vav dalam sampel yang distimulasi versus yang tidak distimulasi, dikuantisasi menggunakan perangkat lunak ImageJ dan dinormalisasi dengan konten intraseluler Vav. Bilah galat, SD *** P ≤0.001

Gambar ukuran penuh

Polimerisasi aktin diatur oleh Rho GTPases. 18 Rac1 (substrat toksin botulinum C3 yang berhubungan dengan Ras 1) dan aktivasi Cdc42 (protein kontrol pembelahan sel 42) bergantung pada penukar nukleotida guanin, Vav, yang diaktifkan oleh fosforilasi tirosin dan juga diatur oleh PIP 2 / PIP 3 ( phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate / (3, 4, 5) -trisphosphate) berikatan dengan domain homologi (PH) pleckstrin-nya. Analisis Immunoblot tentang fosforilasi Vav pada transfectants MEC menunjukkan bahwa ekspresi p66Shc menghasilkan penurunan fosforilasi Vav yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 dibandingkan dengan kontrol (Gambar 3c). Pencitraan fosfo-Vav dalam transfectant kontrol mengungkapkan pengayaan fosfo-Vav dalam tonjolan yang kaya akan F-aktin yang tidak dapat dideteksi dengan adanya p66Shc (Gambar 3d). Oleh karena itu, p66Shc memodulasi reorganisasi F-actin yang bergantung pada chemokine dengan melemahkan aktivasi Vav.

p66Shc menghambat jalur bergantung Src kinase dan PI3-K yang dipicu oleh CXCR4 dan CXCR5

Gi-protein mempromosikan aktivasi Vav melalui dua jalur yang diaktifkan masing-masing oleh subunit G α dan G βγ . 20, 21 G α i aktivasi menghasilkan pengurangan aktivitas protein kinase A (PKA) yang memperkuat loop penghambatan mengendalikan kinase Src dengan meningkatkan aktivitas C-terminal Src kinase (Csk). 20 Sebagai hasilnya, Lyn menjadi aktif dan memulai kaskade fosforilasi yang melibatkan Syk dan Btk yang bersama-sama mempromosikan fosforilasi Vav. 20 G βγ mempromosikan aktivasi PI3-K 22 yang menyatu pada aktivasi Vav dengan menstabilkan pada membran plasma Vav dan Btk melalui interaksi yang dimediasi domain PH dengan PIP 2 / PIP 3 . 21

Untuk mengidentifikasi jalur mana yang diatur oleh p66Shc, tes migrasi dilakukan dengan adanya inhibitor farmakologis dari pensinyalan reseptor kemokin. Seperti yang diharapkan, pengobatan sel MEC kontrol dengan pertusis toksin (PTX), penghambat Gα, atau penghambat fosfodiesterase 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), yang menetralkan efek Gα, menghasilkan blok di Migrasi yang bergantung pada CXCR4 / CXCR5 (Gambar 4a). Migrasi juga dihambat oleh Src kinase inhibitor PP2 dan PI3-K inhibitor wortmannin (Gambar 4a), serta inhibitor Jak AG490 (Tambahan Gambar S3). Kemampuan p66Shc untuk menipiskan chemotaxis yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR semakin ditingkatkan oleh PTX dan IBMX, serta oleh PP2 dan wortmannin (Gambar 4a), tetapi tidak oleh AG490 (Gambar Tambahan S3), menunjukkan bahwa p66Shc secara selektif berpartisipasi dalam Jalur Src dan PI3-K dipicu oleh reseptor ini di hilir aktivasi Gi.

Image

p66Shc menghambat pensinyalan Src kinase dan PI3-K yang bergantung pada respons terhadap CXCL12 dan CXCL13. ( a ) Migrasi transfectan MTR ctr dan p66 yang tidak diobati atau dirawat selama 2 jam dengan PP2 atau 500 ng / ml PTX atau 500 μ M IBMX atau 100 μ M Wortmannin dan kemudian distimulasi selama 3 jam dengan 100 ng / ml CXCL12 (kiri ) atau 200 ng / ml CXCL13 (kanan). Data, diperoleh pada sampel duplikat dari setidaknya tiga percobaan independen, disajikan sebagai indeks migrasi rata-rata ± SD (rasio sel yang bermigrasi dalam sampel yang diobati dengan chemokine dibandingkan sampel yang tidak diobati). * P ≤0.05; ** P ≤0, 01; *** P ≤0.001. ( B ) Analisis Immunoblot dengan antibodi anti-fosfo-Lyn, anti-fosfo-Syk atau anti-fosfo-Btk dari supernatan postnuclear dari ctr dan p66 transfectants MEC baik distimulasi atau distimulasi selama 1 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Kontrol imunoblot dari filter yang dilucuti ditunjukkan di bawah ini. Migrasi penanda massa molekul ditunjukkan. ( c ) Analisis imunofluoresensi sel MTR dan p66 transien transien untuk mengekspresikan fusi PH-GFP, diimobilisasi 24 jam setelah transfeksi pada slide yang dilapisi dengan 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc baik distimulasi atau distimulasi dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13 dan diberi label dengan antibodi Phalloidin-TRITC (merah) dan anti-GFP (hijau). Bagian optik rata-rata ditampilkan. Ukuran bar, 5 m. Antagonis CXCR4 farmakologis (50 μM AMD3100, ditambahkan 1 jam sebelum kemokin) digunakan dalam kombinasi dengan CXCL12 sebagai kontrol spesifisitas. Tidak ada migrasi yang diamati dalam kondisi ini dalam sel MEC kontrol atau p66Shc yang mengekspresikan (data tidak ditampilkan), konsisten dengan penekanan di bawah kondisi ini dari semua kaskade pensinyalan yang dipicu oleh CXCR4 yang terlibat dalam migrasi sel

Gambar ukuran penuh

Untuk memetakan p66Shc di jalur Src-dependent yang dipicu oleh CXCL12 / CXCL13, fosforilasi inisiasi kinase Lyn dan kinase efektor Syk dan Btk diukur dengan immunoblot dengan antibodi spesifik fosfat. Lyn diaktifkan pada tingkat yang sama oleh keterlibatan CXCR4 / CXCR5 dalam kontrol dan sel MEC yang mengekspresikan p66Shc (Gambar 4b). Sebaliknya, aktivasi bergantung-chemokine dari Syk dan Btk secara signifikan terganggu di hadapan p66Shc (Gambar 4b), menunjukkan bahwa p66Shc berpartisipasi dalam jalur dependen TK yang dipicu oleh CXCR4 / CXCR5, menipiskan pensinyalan di hilir Lyn.

Implikasi p66Shc dalam jalur PI3-K yang dipicu oleh CXCL12 / CXCL13 juga dibahas, menggunakan sebagai pembacaan reporter PI3-K yang menyandikan domain PH hijau yang bertanda protein Green Gores (GFP). Mikroskopi konfokal kontrol dan sel MEC yang mengekspresikan p66Shc ditransfungsikan secara sementara dengan konstruk PH-GFP menunjukkan bahwa stimulasi dengan CXCL12 atau CXCL13 menghasilkan pengayaan membran plasma pada PH-GFP dalam kontrol tetapi tidak pada sel yang mengekspresikan p66Shc (Gambar 4c). Oleh karena itu, p66Shc memisahkan CXCR4 / CXCR5 dari aktivasi Vav dengan merusak pensinyalan yang bergantung pada TK dan fosfoinositida.

Penghambatan pensinyalan yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 oleh p66Shc membutuhkan fosforilasi domain CH1-nya

Kemampuan p66Shc untuk memodulasi pensinyalan tergantung pada dua aktivitas pemetaan ke domain protein yang berbeda. p66Shc bertindak sebagai adaptor menggunakan dua domain pengikat fosfotyrosin dan domain homologi kolagen 1 (CH1) yang kaya proline yang merekrut protein melalui tiga residu tirosin yang dapat difosforilasi (YYY239 / 240/317). Selain itu, p66Shc memiliki aktivitas pro-oksidan yang memetakan keduanya ke residu serin yang dapat difosforilasi dalam domain CH2 (S36) dan dua residu asam glutamat (EE132 / 133) dalam domain pengikat sitokrom c . 12

Untuk memahami apakah penghambatan pensinyalan CXCR4 / CXCR5 oleh p66Shc tergantung pada adaptornya atau aktivitas pro-oksidannya, kami menggunakan panel transekstif MEC yang mengekspresikan mutan titik cacat p66Shc yang rusak untuk aktivitas ini. Ini termasuk p66Shc3F (YYY239 / 240 / 317FFF), p66ShcSA (S36A) dan p66ShcQQ (EE132 / 133QQ). Mutan-mutan ini diekspresikan oleh masing-masing transfectant pada tingkat yang sebanding dengan protein tipe liar dalam sel M66 p66 (Gambar 5a). Tidak ada perbedaan yang diamati dalam ekspresi LFA-1, VLA-4, CXCR4 atau CXCR5 dibandingkan dengan kontrol atau sel yang mengekspresikan p66Shc (Tambahan Gambar S1A).

Image

Penghambatan adhesi dan kemotaksis yang bergantung pada CXCR4 dan CXCR5 oleh p66Shc membutuhkan fosforilasi tirosin dari domain CH1-nya. ( a ) Analisis Immunoblot dari ekspresi Shc dalam sel-sel MEC B secara stabil ditransfeksi dengan vektor kosong (ctr) atau konstruksi ekspresi yang mengkode p66Shc tipe liar (MEC p66) atau S36A (p66SA), EE132 / 133QQ (p66QQ) atau YYY239 / 240 / 317FFF (p663F) mutan. Kontrol anti-aktin blot dari filter yang dilucuti ditunjukkan di bawah ini. Migrasi penanda massa molekul ditunjukkan. Struktur domain p66Shc yang menunjukkan lokalisasi residu asam amino yang tersubstitusi dalam mutan-skematis di bagian atas panel. ( B ) Migrasi transfectants MEC ctr, p66, p66SA, p66QQ dan p663F dirangsang selama 3 jam dengan 100 ng / ml CXCL12 (panel atas) atau 200 ng / ml CXCL13 (panel bawah). Data, diperoleh pada sampel duplikat dari setidaknya tiga percobaan independen, disajikan sebagai indeks migrasi rata-rata ± SD (rasio sel yang bermigrasi dalam sampel yang diobati dengan chemokine dibandingkan sampel yang tidak diobati). *** P ≤0.001. ( c ) Kuantifikasi dengan flow cytometry dari persentase sel ctr, p66, dan p663F yang melekat pada pelat 48 sumur yang dilapisi dengan 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc setelah perlakuan dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13 selama 10 menit. Data, yang merujuk pada sampel rangkap empat dari empat percobaan independen, disajikan sebagai% dari total sel input yang tetap melekat pada masing-masing sumur. Bilah galat, SD * P ≤0.05; *** P ≤0.001. Kuantifikasi persentase polarisasi ( d ) atau polimerisasi aktin ( e ) pada sel ctr, p66 dan p663F yang dilapisi pada slide yang dilapisi dengan 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc, distimulasi selama 5 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13 dan diberi label dengan antibodi Phalloidin-TRITC dan anti-aktin. Persentase sel terpolarisasi ( d ) dan intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) pewarnaan Phalloidin dalam sampel yang distimulasi dan tidak distimulasi ( e ) dihitung pada empat gambar bidang lebar yang berbeda dari masing-masing sumur dalam tiga percobaan independen. Pewarnaan phalloidin dihitung menggunakan perangkat lunak ImageJ dan dinormalisasi ke konten aktin intraseluler. Bilah galat, SD * P ≤0.05; *** P ≤0.001

Gambar ukuran penuh

Ekspresi spesies oksigen reaktif (ROS) -mutan yang rusak mengakibatkan gangguan migrasi sel-B dan adhesi dibandingkan dengan sel kontrol, mirip dengan p66Shc (Gambar 5b dan Gambar Tambahan S4A), mengesampingkan peran aktivitas pro-oksidan p66Shc dalam fungsi ini. Sebaliknya, mutasi 3F membalikkan kemampuan p66Shc untuk menghambat chemotaxis sel-B (Gambar 5b), serta adhesi dan polarisasi (Gambar 5c dan d dan Angka Tambahan S4A dan B). Dengan demikian, LFA-1 membentuk pola punctate khas yang dihasilkan dari pengelompokan integrin dalam sel pengekspres p66Shc3F (Gambar Tambahan S2). Mutasi 3F juga sepenuhnya membatalkan kemampuan p66Shc untuk menghambat polimerisasi aktin yang bergantung pada CXCR4 / CXCR5 (Gambar 5e dan Gambar Tambahan S4C), fosforilasi Vav (Gambar 6a) dan pengayaan fosfav-Vav pada tonjolan yang kaya akan aktin (Gambar 6b ​​dan Gambar Tambahan S4D). Selain itu, tidak ada cacat dalam aktivasi kemokin yang bergantung pada Syk, Btk atau PI3-K (Gambar 6c dan d) diamati dalam sel pengekspres p66Shc3F, menunjukkan bahwa YYY239 / 240/317 diperlukan untuk efek penghambatan p66Shc pada jalur pensinyalan yang mengontrol aktivasi VAV dan reorganisasi aktin dalam sel-B.

Image

Penghambatan pensinyalan CXCR4 dan CXCR5 oleh p66Shc membutuhkan fosforilasi tirosin dari domain CH1-nya. ( a ) Analisis imunoblot dengan antibodi anti-fosfo-Vav supernatan postnuclear dari ctr, p66 dan p663F transfectants MEC baik tidak distimulasi atau distimulasi selama 1 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Kontrol imunoblot anti-aktin dari filter yang dilucuti ditunjukkan di bawah ini. Migrasi penanda massa molekul ditunjukkan. ( b, atas) Analisis mikroskopis konfokal dari fosforilasi Vav dalam ctr, p66 dan p663F transfectants MEC yang dilapisi pada slide yang dilapisi dengan 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc dan distimulasi selama 2 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Slide kemudian diberi label dengan antibodi anti-fosfo-Vav dan anti-Vav. Bagian optik rata-rata ditampilkan. Ukuran bar, 5 m. ( b, bawah) Kuantifikasi fosforilasi Vav pada empat gambar bidang-lebar yang berbeda dari tiga percobaan independen disajikan sebagai intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) pewarnaan fosfo-Vav dalam sampel yang distimulasi dibandingkan yang tidak distimulasi, diukur menggunakan perangkat lunak ImageJ dan dinormalisasi dengan konten intraseluler. dari Vav. Bilah galat, SD * P ≤0.05; ** P ≤0, 01; *** P ≤0.001. ( c ) Analisis Immunoblot dengan antibodi anti-fosfo-Syk supernatan postnuclear dari ctr, p66 dan p663F transfectants MEC baik tidak distimulasi atau distimulasi selama 1 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Kontrol imunoblot anti-aktin dari filter yang dilucuti ditunjukkan di bawah ini. Filter yang sama diperiksa dengan antibodi anti-fosfo-Btk. Migrasi penanda massa molekul ditunjukkan. ( d ) Analisis imunofluoresensi sel MTR, p66 dan p663F ditransfusikan secara transien untuk mengekspresikan fusi PH-GFP, diimobilisasi 24 jam setelah transfeksi pada slide yang dilapisi dengan 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc baik tidak distimulasi atau distimulasi dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13 dan diberi label dengan Phalloidin-TRITC (merah) dan antibodi anti-GFP (hijau). Bagian optik rata-rata ditampilkan. Ukuran bar, 5 m. ( e ) Analisis Immunoblot dengan antibodi anti-fosfotyrosin dari imunopresip p66Shc-spesifik dari lisat sel M66 p66 dan p663F baik tidak distimulasi atau diaktifkan selama 1 menit dengan 500 ng / ml CXCL12 atau 1, 25 μg / ml CXCL13. Filter yang dilucuti itu ditolak dengan antibodi anti-Shc

Gambar ukuran penuh

Dalam perjanjian dengan persyaratan untuk YYY239 / 240/317 fosforilasi dalam regulasi pensinyalan CXCR4 / CXCR5 oleh p66Shc, p66Shc ditemukan mengalami fosforilasi pada tirosin sebagai respons terhadap CXCL12 / CXCL13 (Gambar 6e).

p66Shc merekrut SHIP-1 dan SHP-1 ke CXCR4 dan CXCR5

Hasil yang diperoleh dengan mutan p66Shc menunjukkan bahwa p66Shc dapat mengganggu kopling CXCR4 / CXCR5 ke Vav dengan bertindak sebagai adaptor untuk merekrut regulator negatif dari jalur dependen TK atau PI3-K yang dipicu oleh reseptor ini. Untuk mengatasi masalah ini, p66Shc / p66Shc3F di imunopresipitasi dari transfectants MEC yang mengekspresikan protein yang ditandai dengan GFP dan mencari keberadaan CXCR4 dan CXCR5. Kedua reseptor ditemukan terlibat dalam interaksi konstitutif dengan p66Shc serta p66Shc3F (Gambar 7a). Dengan demikian, analisis imunofluoresensi menunjukkan bahwa proporsi p66Shc, serta p66Shc3F, terlokalisasi pada membran plasma dalam kondisi basal (Gambar 7b).

Image

p66Shc merekrut phosphatases SHIP-1 dan SHP-1 ke CXCR4 dan CXCR5. ( a ) Analisis Immunoblot dengan antibodi anti-CXCR4, CXCR5, SHIP-1 atau SHP-1 dari imunopresipf GFP spesifik dari lisat transfants MF GFP-p66 dan GFP-p663F baik distimulasi atau distimulasi selama 1 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Kontrol imunoblot anti-GFP dari filter yang dilucuti ditunjukkan di bawah ini. Migrasi penanda massa molekul ditunjukkan. ( B ) Analisis mikroskopis confocal dari SHIP-1 di ctr, p66 dan p663F transfectants MEC berlapis pada slide dilapisi dengan 10 μg / ml rhICAM-1 / Fc dan distimulasi selama 1 menit dengan baik 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Slide kemudian diberi label dengan antibodi anti-KAPAL-1. Bagian optik rata-rata ditampilkan. Ukuran bar, 5 m. ( c ) Analisis mikroskopis konfokal dari GFP dan SHIP-1 dalam GFP-p66 dan GFP-p663F transfectants MEC yang dilapisi slides yang dilapisi dengan 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc dan distimulasi selama 1 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Slide kemudian diberi label dengan antibodi anti-KAPAL-1. Bagian optik rata-rata ditampilkan. Ukuran bar, 5 m

Gambar ukuran penuh

PIP 3 secara cepat mengalami defosforilasi oleh fosfatase SHIP-1 (inositol 5'-fosfatase-1 yang mengandung domain SH2 23 ) yang secara negatif mengatur kemotaksis B-sel B yang bergantung pada CXCR4. 24 Eksperimen Co-imunopresipitasi menunjukkan hubungan basal SHIP-1 dengan p66Shc yang sangat ditingkatkan sebagai respons terhadap CXCL12 / CXCL13 (Gambar 7a). Sebagian besar SHIP-1 diamati pada membran plasma di bawah kondisi basal dalam sel MEC yang mengekspresikan p66Shc, dengan kolokasi yang signifikan dengan p66Shc yang ditandai GFP (Gambar 7c). Meskipun asosiasi basal SHIP-1 dengan p66Shc3F juga diamati, itu tidak ditingkatkan dengan pengobatan kemokin (Gambar 7a). Selain itu, SHIP-1 sebagian besar adalah sitosol dengan tidak adanya stimulasi pada sel yang mengekspresikan p66Shc3F, dan kumpulan sitosol yang substansial juga diamati setelah pengobatan kemokin (Gambar 7b). Oleh karena itu, p66Shc menghambat pensinyalan PI-3K dengan merekrut SHIP-1 ke CXCR4 / CXCR5 melalui domain CH1-nya.

Fakta bahwa p66Shc secara negatif mengatur kaskade TK yang dipicu oleh CXCR4 / CXCR5 menunjukkan bahwa hal itu dapat menangkal TK dengan merekrut tirosin fosfatase ke reseptor ini. Tirosin fosfatase SHP-1 (Src homology phosphatase-1) terlibat dalam pensinyalan negatif oleh berbagai reseptor dalam sel hematopoietik. 25 Probing imunopresipit spesifik p66Shc mengungkapkan adanya SHP-1 dalam kondisi basal yang ditingkatkan sebagai respons terhadap CXCL12 / CXCL13 (Gambar 7a). Interaksi basal, yang bagaimanapun tidak meningkat sebagai respons terhadap stimulasi kemokin, diamati dalam sel yang mengekspresikan p66Shc3F (Gambar 7a), menunjukkan bahwa penghambatan p66Shc pada pensinyalan TK melibatkan perekrutan SHP-1 ke CXCR4 / CXCR5 melalui YYY239 / 240 / Y317.

Diskusi

Meskipun pemahaman mekanistik kita yang terbatas tentang pensinyalan CXCR4 dan CXCR5 dalam sel-B, beberapa mediator pensinyalan telah diidentifikasi. Pergeseran konformasi afinitas tinggi-afinitas yang dipicu oleh CXCR4 melibatkan Ras-proximate-1 (Rap1), protein tirosin kinase 2 (Pyk2) dan aktivasi focal adhesion kinase (FAK). Selain itu, CXCR4 memicu aktivasi GTPase Rho yang bergantung pada Lyn, Syk, dan PI3-K melalui kaskade yang melibatkan Btk dan fosfolipase C, γ (PLC γ ). 27 Kurang diketahui tentang CXCR5, meskipun mediator pensinyalan yang diidentifikasi dalam jalur ini, seperti Rap1, PI3-K dan Pyk2, 27, 28, 29 menyarankan bahwa ia dapat merekapitulasi jalur CXCR4. Peran adaptor yang bertindak sebagai perancah untuk mempromosikan aktivasi dan fungsi molekul-molekul ini di jalur yang dipicu oleh AGR telah ditangani hanya untuk beberapa kasus. SLP-76 (protein leukosit yang mengandung domain SH2 dari 76 kDa), yang mengontrol aktivasi Rap1-dependen TCR, 30 dan LAT, yang memasangkan TCR ke Vav dan Rho GTPases, 31 dapat digunakan untuk pensinyalan CXCR4 dalam sel T, 32, 33 menyarankan bahwa adaptor yang berbeda dapat terlibat dalam perakitan signalosome terkait reseptor kemokin. Namun, SLP-76 baru-baru ini diidentifikasi sebagai target umum TCR dan CXCR4 dalam generasi mikroklaster pensinyalan; Selain itu, peran untuk SLP-76 dalam adhesi sel-T yang bergantung pada LFA-1 telah dievaluasi kembali dalam pengaturan aliran geser. 35 Adaptor CrkL dan Cbl-b direkrut dalam kompleks multimolekul sebagai respons terhadap keterlibatan CXCR4 dalam garis limfoma pra-B, 36 tetapi peran mereka dalam migrasi sel B belum ditangani secara langsung. Hasil yang disajikan di sini berkontribusi untuk mengisi kesenjangan ini dengan mengidentifikasi p66Shc, yang berpartisipasi sebagai regulator negatif dalam pensinyalan sel-B (BCR) pensinyalan, 37 sebagai komponen sentral dari jalur yang memasangkan CXCR4 / CXCR5 untuk mengintegrasikan aktivasi dan dinamika aktin dalam B -cells. Meskipun tingkat fisiologis ekspresi p66Shc dalam sel B primer relatif rendah, mereka jelas cukup untuk mengurangi respons yang dipicu oleh reseptor ini, seperti yang disorot oleh peningkatan signifikan mereka dalam sel p66Shc - / - B.

p66Shc tampaknya berfungsi hilir aktivasi Gi pada langkah-langkah awal pensinyalan CXCR4 / CXCR5 di jalur yang memasangkan Lyn dan PI3-K ke Vav, tetapi tidak di jalur Jak Gi-independen, yang didukung oleh eksaserbasi cacat chemotaxis di p66Shc-expressing B-cells ketika dirawat dengan PTX atau PP2 atau wortmannin, tetapi tidak AG490. Perbandingan aktivasi Lyn, Syk dan Btk dalam sel-B berbeda dalam ekspresi p66Shc memetakan p66Shc di hilir Lyn. Aktivasi Lyn diyakini terjadi melalui rekrutmen ke rakit lipid dengan reseptor kemokin teraktivasi. 38 Bahwa p66Shc tidak memengaruhi aktivasi Lyn menunjukkan bahwa interaksi konstitutifnya dengan CXCR4 / CXCR5 tidak menimpa baik pada pengelompokan rakit mereka atau kemampuan mereka untuk merekrut Lyn. Suatu mekanisme dimana p66Shc melemahkan pensinyalan TK di hilir Lyn dapat diusulkan berdasarkan temuan kami bahwa itu berinteraksi dengan SHP-1 yang mengikat dan mendeposforilasi Syk dalam sel-B. 39 Ini tidak mengesampingkan kemungkinan penghambatan p52Shc transdominant yang berpartisipasi dalam transaktivasi TCR oleh CXCR4 dalam sel T. 15 Namun demikian, kemungkinan ini tampaknya tidak mungkin, karena fungsi penghambatan p66Shc ini bergantung pada fosforilasi S36, 12 sedangkan data yang disajikan di sini menunjukkan bahwa penentu molekul ini dapat diabaikan untuk regulasi negatif pensinyalan CXCR4 / CXCR5 oleh p66Shc dalam sel-B.

Penghambatan pensinyalan fosfoinositida oleh p66Shc cenderung berkontribusi pada cacat aktivasi Vav sebagai respons terhadap CXCR4 / CXCR5, karena Btk dan Vav disediakan dari domain yang mengikat fosfoinositida. 21 Kemampuan p66Shc untuk mengurangi akumulasi fosfoinositida juga dapat berkontribusi pada gangguan pensinyalan dari dalam ke luar dengan integrin dengan memengaruhi perakitan kompleks yang mendorong aktivasi Rap1 yang dalam sel-B termasuk adaptor yang mengandung domain Sr Sr kinase-related phosphoprotein terkait -Homology (SKAP-hom). 40 Meskipun modulasi aktivitas PI3-K oleh p66Shc tidak dapat dikesampingkan, penghambatan akumulasi fosfoinositida yang bergantung pada CXCR4 / CXCR5 oleh p66Shc bermula, setidaknya sebagian, dari kemampuannya untuk meningkatkan perekrutan SHIP-1 ke membran plasma, mirip dengan apa yang telah kami jelaskan untuk pensinyalan Fc ɛ RI dalam sel mast. 41 SHIP-1 bergabung dengan p52Shc melalui interaksi bidentat yang melibatkan pengikatan domain SHIP-1 SH2 ke YYY239 / 240/317 yang difosforilasi, serta pengikatan motif SHIP-1 NPXY yang difosforilasi ke domain Shc PTB. 42, 43 Hubungan dasar p66Shc dengan CXCR4 / CXCR5 menunjukkan bahwa p66Shc dapat merekrut kumpulan awal SHIP-1 ke reseptor tanpa adanya stimulasi, sebagaimana didukung oleh pelokalan membran konstitutif dari SHIP-1 dalam sel yang mengekspresikan p66Shc. Setelah pengikatan chemokine, CXCR4 / CXCR5 dapat mempromosikan fosforilasi p66Shc dan SHIP-1, dengan demikian menstabilkan kompleks p66Shc-SHIP-1 di membran plasma, sebagaimana didukung oleh peningkatan ketergantungan chemokine dalam pengapalan SHIP-1 ke p66Shc, tetapi tidak p66Shc3F. Patut dicatat bahwa sel-sel B-SHIP-1 - / - menampilkan adhesi dan kemotaksis yang mirip dengan yang dijelaskan di sini untuk p66Shc - / - B-sel, 24 yang mendukung gagasan bahwa p66Shc secara negatif mengatur proses ini melalui SHIP-1.

Kemampuan p66Shc untuk menghasilkan ROS muncul berbeda dengan efek penghambatannya pada adhesi dan migrasi sel B, karena proses ini diatur oleh oksidan. Selama migrasi EC, subunit NOX2 dan p47 phox NADPHox (nicotinamide adenine dinucleotide fosfat) ditargetkan ke ujung tombak di mana mereka menghasilkan superoksida 44, 45 yang mempromosikan migrasi sel melalui penghambatan oksidasi yang bergantung pada protein fosfatase. 46 ROS juga mempromosikan adhesi leukosit pada ECs dengan meningkatkan ekspresi ICAM-1 dan P-selectin, 47, 48 dan dengan menginduksi turnover protein persimpangan EC. 49 p66Shc mempromosikan akumulasi ROS dengan menghambat faktor transkripsi forkhead yang mengontrol ekspresi enzim anti-oksidan 50 dan mengganggu rantai pernapasan mitokondria. 51 Kompartementalisasi subseluler dari generasi ROS telah muncul sebagai fitur penting dari pensinyalan ROS. 52 Kita dapat berhipotesis bahwa p66Shc dapat menghasilkan ROS di lokasi yang tidak relevan dengan jalur pensinyalan yang memediasi migrasi sel B yang bergantung pada CXCR4 / CXCR5. Untuk mendukung gagasan ini, penghambatan NADPHox tidak mempengaruhi kemampuan p66Shc untuk meningkatkan ROS intraseluler dalam sel T (A Nuccitelli dan CT Baldari, tidak dipublikasikan). Perlu dicatat bahwa p66Shc memediasi anoikis dalam fibroblast dengan mempromosikan aktivasi RhoA dan pembentukan adhesi fokus 53 dan mempromosikan produksi ROS yang bergantung pada VEGF dalam ECs dengan mengaktifkan Rac1 dan NAPDHox. 54 Oleh karena itu, efek p66Shc pada kemotaxis dan peran aktivitas pro-oksidannya dalam proses ini tampaknya spesifik-jenis sel.

Kami baru-baru ini menunjukkan bahwa p66Shc memodulasi ekspresi reseptor yang mengontrol masuknya sel-B (CCR7) dan keluar (reseptor sphingosine-1-fosfat 1 (S1P1)) melalui aktivitas pro-oksidannya, 14 menunjukkan implikasinya dalam perdagangan mereka ke SLO. . Hasil yang disajikan di sini menunjukkan bahwa p66Shc juga dapat berpartisipasi dalam homing sel B dengan melemahkan pensinyalan ke sitoskeleton aktin oleh CXCR4 / CXCR5, yang bertindak sebagai adaptor untuk merekrut regulator negatif. Secara kolektif, data mengidentifikasi p66Shc sebagai regulator multifungsi dari perdagangan sel-B.

Material dan metode

Garis sel, plasmid, antibodi, dan reagen

Panel transekstabil stabil sel-B B-MEC yang mengekspresikan p66Shc (p66) atau p66ShcSA (p66SA) atau mutan titik p66ShcQQ (p66QQ), serta transfectant vektor kosong (ctr), telah dijelaskan sebelumnya. 14 Transfectant MEC-1 dihasilkan menggunakan konstruk yang mengkode mutan titik p66Shc yang tidak memiliki tiga residu tirosin yang dapat difosnori (YYY239 / 240/317) dalam domain CH1 (p66Shc3F). 55 Pengkodean cDNA p66Shc dan p66Shc3F diklon ke pEGFP-C3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) dan secara stabil ditransfusikan ke dalam sel MEC-1 seperti yang dijelaskan sebelumnya. 14 Sebuah vektor yang mengkodekan domain PH Akt PH yang ditandai GFP transiently ditransformasikan ke kontrol yang stabil, transfectants p66 dan p663F. Murine OP9 57 dan sel stroma HS-5 58 manusia digunakan untuk eksperimen pseudoemperipolesis.

Antibodi fosfospesifik yang mengenali bentuk aktif terfosforilasi dari Syk, Btk dan Lyn berasal dari Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) dan anti-phospho-Vav berasal dari Biosource (Camarillo, CA, USA). Antibodi anti-Erk2, anti-SHIP-1 dan anti-Shc berasal dari Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), anti-actin berasal dari Chemicon Int. (Temecula, CA, USA), dan antibodi anti-phosphotyrosine, anti-Vav dan anti-Shc berasal dari Millipore (Billerica, MA, USA). Antibodi anti-CXCR5 dan anti-SHP-1 berasal dari Abcam (Cambridge, UK), antibodi poliklonal anti-CXCR4 berasal dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), mAb anti-CXCR4 berasal dari Abnova (Aachen, Jerman ), poliklonal anti-GFP dan mAb berasal dari Invitrogen. Antibodi anti-CXCR4 (12G5) disediakan oleh J Hoxie, Leukosite Inc. dan Proyek Reagen MRC AIDS (Cambridge, MA, USA). p66Shc di imunopresipitasi menggunakan antiserum poliklonal kelinci yang dibesarkan melawan protein fusi CH2-glutathione S -transferase (GST). 59 Antibodi berlabel peroksidase sekunder berasal dari GE Healthcare (Fairfield, CT, USA). Anti-CD11a, anti-manusia CD3 dan CD19, anti-mouse CD3 dan CD22 dan antibodi berlabel fluorochrome sekunder berasal dari eBioscience (San Diego, CA, USA); antibodi sekunder anti-GFP dan Alexa Fluor 488- dan 555 berlabel berasal dari Invitrogen (Leek, Belanda). Manusia dan tikus, CXCL12 dan CXCL13, FN, AG490, PP2, AMD3100, IBMX, f-MLP, dan Phalloidin berlabel TRITC dibeli dari Sigma-Aldrich. PTX dibeli dari Sigma-Aldrich. rhICAM-1 / Fc dibeli dari R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Kit deteksi chemiluminescence berasal dari Pierce (Rockford, IL, USA). Pewarna fluorescent DiO dan Dil dibeli dari Molecular Probe (Invitrogen).

Tikus

p66Shc - / - / 129 tikus (p66Shc - / - ) telah dijelaskan sebelumnya. 59 Analisis dilakukan pada tikus jenis liar berusia 129 tahun dan jenis kelamin yang cocok yang berusia 2-9 bulan. Semua percobaan dilakukan sesuai dengan Prinsip Panduan untuk Penelitian yang Melibatkan Hewan dan Manusia dan disetujui oleh komite etika lokal. Eksperimen dilakukan pada limpa, kelenjar getah bening dan suspensi sumsum tulang, atau sel B limpa yang dimurnikan secara negatif dengan penyortiran imunomagnetik menggunakan Kit Isolasi Negatif CD43 Dynabeads Mouse (Invitrogen) (Invitrogen) (kemurnian> 85%).

Aktivasi dan imunopresipitasi

Sel kelaparan selama 2 jam di RPMI / 1% BSA. Aktivasi dengan CXCL12 atau CXCL13 (masing-masing 10–500 ng / ml, 0, 1–1, 25 μg / ml, tergantung pada konsentrasi sel) dilakukan pada suhu 37 ° C dalam RPMI / 1% BSA. Sel dilisiskan dalam 1% Triton X-100 dalam 20 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl (dengan adanya koktail protease inhibitor, Invitrogen), diselesaikan dengan SDS-PAGE dan ditransfer ke nitroselulosa (Whatman, GE Healthcare) . Sebagai alternatif, supernatan postnuclear dari 2, 5-5x10 sel / sampel diimunisasi dengan menggunakan antibodi dan protein A-Sepharose (GE Healthcare) yang sesuai.

Aliran sitometri dan uji kemotaksis

Tes migrasi Transwell dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. 15 Sel yang dimigrasi dihitung dengan flow cytometry. Sel-sel tikus diwarnai dengan antibodi anti-CD3 / anti-CD22 sebelum dianalisis. Indeks migrasi dihitung dengan menentukan rasio sel yang dimigrasi dalam sampel yang dibandingkan dengan sampel yang tidak diobati.

Uji adhesi

Pelat 48 sumur dilapisi o / n pada suhu 4 ° C dengan 10 μ g / ml FN atau 10 μ g / ml rhICAM-1 / Fc, dicuci dengan PBS dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ° C dengan RPMI / 1 % BSA. Kemudian, 2 × 10 5 sel / sel B yang kekurangan serum serum ditambahkan. Pelat diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 10 menit, kemudian ditambahkan dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13 selama 10 menit. Sel-sel yang tidak melekat (pulih dalam medium dan mencuci) diresuspensi dalam 0, 2 ml RPMI. Sel-sel yang tetap melekat setelah 3 kali pencucian dipulihkan dengan inkubasi 1 menit dengan trypsin / EDTA, segera ditambahkan dengan RPMI-10% BCS, dicuci dan diresuspensi dalam 0, 2 ml RPMI. Sel dihitung dengan flow cytometry. Sel-sel tikus diwarnai dengan antibodi anti-CD3 / CD22 sebelum aliran sitometri. Persentase sel penganut dihitung sebagai berikut:

Image

di mana 'total' adalah jumlah dari sel adherent dan nonadherent / well.

Uji pseudoemperipolesis

Sel-sel stromal diunggulkan pada 48-well plate (1, 5 × 10 5 sel / well) dalam RPMI / 10% BCS dan dikultur untuk pertemuan. Kemudian, 2 × 10 5 sel / sel B yang kekurangan serum serum ditambahkan. Pelat diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 10 menit, kemudian ditambahkan dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13 selama 40 menit. Sumur dicuci dengan kuat tiga kali dengan RPMI dan sel-sel yang tidak melekat (pulih dalam medium dan mencuci) diresuspensi dalam media 0, 2 ml. Lapisan sel stroma yang mengandung sel-sel yang dimigrasi telah dicobakan seperti yang dijelaskan di atas dan sel-sel ditangguhkan dalam media 0, 2 ml. Sel dihitung dengan flow cytometry. Semua sampel diwarnai dengan antibodi anti-CD19 (sel manusia) atau anti-CD3 / CD22 (sel tikus) sebelum aliran sitometri untuk mengecualikan sel stroma. Persentase sel yang dimigrasi dihitung seperti di atas.

Imunofluoresensi, mikroskop confocal dan uji polarisasi

Slide mikroskop diagnostik dilapisi dengan FN atau rhICAM-1 / Fc dan sel (1 × 10 5 / sampel) diizinkan untuk melekat selama 5 menit sebelum stimulasi selama 2-5 menit dengan 100 ng / ml CXCL12 atau 200 ng / ml CXCL13. Sel yang ditransfusikan secara transien dengan vektor pengekspresikan PH-GFP digunakan 24 jam setelah transfeksi. Slide segera diperbaiki dalam paraformaldehyde 4% pada RT selama 20 menit seperti yang dijelaskan sebelumnya. 60 Untuk pewarnaan SHIP-1 dan SHP-1, sel disalut selama 15 menit pada slide yang dilapisi pollysine dan kemudian distimulasi seperti di atas. Setelah fiksasi, sampel dicuci 5 menit dalam PBS dan diinkubasi dengan antibodi primer atau Phalloidin berlabel TRITC pada 4 ° C atau 1 jam di RT. Setelah dicuci di PBS, sampel diinkubasi selama 1 jam di RT dengan Alexa Fluor 488- dan 555 berlabel antibodi sekunder.

Mikroskopi konfokal dilakukan pada Zeiss LSM700 (Carl Zeiss, Jena, Jerman) menggunakan tujuan × 63. Gambar untuk diukur diperoleh dengan lubang kecil yang dibuka untuk mendapatkan bagian setebal 0, 8 m. Detektor diatur untuk mendeteksi sinyal optimal di bawah batas saturasi. Gambar diproses dengan perangkat lunak gambar Zen 2009 (Carl Zeiss) dan analisis dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak ImageJ (diunduh dari //www.embl-heidelberg.de/eamnet/).

Untuk pengujian polarisasi, slide diwarnai dengan Phalloidin berlabel TRITC dan anti-aktin mAb, empat gambar bidang lebar yang berbeda / sumur (setidaknya 25 sel / bidang) diambil dan persentase sel terpolarisasi (dengan tonjolan atau dengan morfologi tidak teratur) ; lihat gambar yang representatif pada Gambar 1a) terhadap total sel yang dihitung. Dalam gambar yang sama, intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) dari Phalloidin dan pewarnaan aktin dihitung menggunakan perangkat lunak ImageJ. Untuk setiap pewarnaan Phalloidin dinormalisasi dengan pewarnaan aktin.

Pemurnian RNA dan PCR waktu-nyata

Total RNA diekstraksi dari transfectant MEC atau limfosit B tikus dan ditranskripsikan seperti yang dijelaskan sebelumnya. 37 PCR waktu-nyata dilakukan dalam rangkap tiga di atas pelat PCR optik 96-sumur (Sarstedt AG, Nümbrecht, Jerman) seperti yang telah dijelaskan sebelumnya menggunakan SSoFast EvaGreen SuperMix (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) dan CFX96 Real -Time system (Laboratorium Bio-Rad, Waltham, MA, USA). Tingkat transkrip dinormalisasi ke gen rumah tangga HPRT1 .

Analisis statistik

Nilai rata-rata, uji SD dan Student (tidak berpasangan) dihitung menggunakan Microsoft Excel (Redmont, WA, USA). A P <0, 05 dianggap signifikan secara statistik.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Angka Tambahan

Glosarium

AGR

reseptor antigen

BCR

Reseptor sel-B

Btk

Tirosin kinase Bruton

kamp

siklik adenosin monofosfat

CCR7

Reseptor kemokin CC tipe 7

Cdc42

pembelahan sel mengontrol protein 42 homolog

CH1

homologi kolagen 1

CLL

leukemia limfositik kronis

Csk

C-terminal Src kinase

CXCL12

Kemokin motif CXC 12

CXCL13

Kemokin motif CXC 13

CXCR4

Reseptor kemokin CXC tipe 4

CXCR5

Reseptor kemokin CXC tipe 5

EC

sel endotel

FAK

adhesi kinase fokus

FN

fibronektin

GFP

protein fluoresen hijau

IBMX

3-isobutyl-1-methylxanthine

ICAM-1

molekul adhesi antar-1

JAK

Janus kinase

LFA-1

fungsi limfosit terkait antigen-1

mAb

antibodi monoklonal

NADPHox

nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase

PH

periksa homologi

PIP 2 / PIP 3

phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate / (3, 4, 5) -trisphosphate

PI3-kinase

phosphatidylinositide 3-kinase

PKA

protein kinase A

PLC γ

fosfolipase C, γ

PTX

racun pertusis

Pyk2

protein tirosin kinase 2

Rac1

Substrat toksin botulinum C3 terkait ras 1

Rap1

Ras-proximate-1

ROS

spesies oksigen reaktif

Shc

Src homology 2 mengandung domain

KAPAL-1

SH2 yang mengandung inositol 5'-phosphatase-1

SHP-1

Src homology phosphatase-1

SKAP-hom

Src kinase-terkait fosfoprotein-homologi

SLO

organ limfoid sekunder

SLP-76

Protein leukosit yang mengandung domain SH2 sebesar 76 kDa

Syk

limpa tirosin kinase

S1P1

reseptor sphingosine-1-fosfat 1

TK

tirosin kinase

VEGF

faktor pertumbuhan endotel vaskular

VLA-4

sangat terlambat antigen-4

Informasi Tambahan menyertai makalah ini di situs web Kematian dan Penyakit Sel (//www.nature.com/cddis)