Motif pengikatan peptida hla-dr8 memiliki fitur struktural yang penting dengan alel terkait diabetes tipe 1 lainnya gen & kekebalan

Motif pengikatan peptida hla-dr8 memiliki fitur struktural yang penting dengan alel terkait diabetes tipe 1 lainnya gen & kekebalan

Anonim

Subjek

  • Kecenderungan genetik terhadap penyakit
  • Imunogenetika
  • Diabetes tipe 1

Abstrak

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi motif pengikatan peptida dari kompleks histokompatibilitas utama (MHC) kelas II molekul HLA-DR8 yang termasuk dalam tipe 1 terkait diabetes haplotype DRB1 * 0801-DQA1 * 0401 / DQB1 * 0402 (DR8- DQ4), dan membandingkannya dengan alel MHC kelas II terkait diabetes lainnya; Peptida yang terikat DR8 dielusi dari garis sel limfoblastoid homozigot HLA-DR. Repertoar dikarakterisasi dengan pengurutan peptida menggunakan spektrometer massa perangkap ion LTQ yang digabungkan dengan sistem kromatografi cair multidimensi. Setelah validasi identifikasi spektra, definisi motif pengikatan peptida HLA-DR8 diperoleh dari analisis 486 ligan alami, berdasarkan pada penyejajaran serial semua inti yang mungkin mengikat HLA-DR. Motif DR8 menunjukkan kemiripan yang kuat dengan motif pengikat peptida alel terkait diabetes MHC kelas II lainnya, HLA-DQ8 dan H-2 IA g7 . Mirip dengan HLA-DQ8 dan H-2 IA g7, HLA-DR8 secara istimewa mengikat peptida dengan residu asam pada posisi P9 dari inti yang mengikat, menunjukkan bahwa DR8 adalah komponen kerentanan dari haplotype DR8-DQ4. Memang, beberapa peptida DR8 identik dengan peptida yang sebelumnya diidentifikasi sebagai ligan DQ8- atau IA g7, dan beberapa peptida spesifik diabetes yang terkait dengan DQ8 atau IA g7 secara teoritis dapat mengikat HLA-DR8. Data ini semakin memperkuat hubungan HLA-DR8 dengan diabetes tipe I.

pengantar

Molekul utama histokompatibilitas kompleks (MHC) kelas II (manusia HLA-II) adalah glikoprotein transmembran yang sebagian besar menyajikan peptida eksogen ke limfosit T CD4 + dan terdiri dari rantai α dan β, di mana rantai β sangat polimorfik. dan polimorfisme rantai α bervariasi antara isotipe. Dalam kasus molekul HLA-DR, rantai α pada dasarnya adalah monomorfik.

Peptida terikat ke MHC-II memiliki panjang variabel dan berinteraksi dengan kantong yang berbeda dalam alur pengikatan molekul. Kantung ini sebagian besar mengandung residu polimorfik, membuat alel yang berbeda untuk mengikat kelompok residu tertentu di setiap kantung. 1 Peptida mengikat dengan residu saku yang sesuai dari alur pengikatan melalui interaksi spesifik residu inti pada posisi relatif P1, 4, 6 dan 9 (residu jangkar). Untuk setiap alel MHC kelas II, setiap kantong memiliki kekhususan untuk residu yang berbeda, menentukan afinitas pengikatan peptida. 2

HLA-DR allele HLA-DR8 telah dikaitkan dengan kerentanan terhadap beberapa penyakit autoimun 3, 4, 5 dan DRB1 * 0801 (DR8) -DQA1 * 0401 / DQB1 * 0402 (DQ4) haplotype adalah, setelah risiko tinggi DR3 dan DR4, haplotipe paling predisposisi berikutnya untuk diabetes tipe 1 (T1D). 6 Alel kerentanan utama adalah HLA-DQ2 dan DQ8, masing-masing dari haplotipe DR3 dan DR4, serta homolog NOD mouse mereka, IA g7 (ref. 7, 8). Tikus IA g7 dan molekul MHC DQ2 dan DQ8 manusia diabetogenik kelas II, semuanya memiliki ekspresi asam amino non-Asp pada posisi 57 rantai β, sedangkan sebagian besar alel MHC kelas II lainnya mengandung residu Asp yang dilestarikan pada saat ini. posisi. Tidak adanya Asp di β57 terkait dengan preferensi alel-alel ini untuk pengikatan residu asam dalam kantong P9. 10, 11, 12, 13 Fitur umum ini, diketahui terlibat dalam penyakit klinis 14, 15 juga ditemukan dalam HLA-DR8, dengan Ser pada β57, tetapi tidak dalam molekul DQ4 (DQA1 * 0401 / DQB1 * 0402), dari haplotipe DR8 yang memiliki Asp di β57.

Struktur kristal IA g7 (ref. 16), DQ8 (ref. 17) dan DQ2, 18 bersama-sama dengan data pengikatan peptida dan studi peptida yang diproses secara alami dipilih oleh molekul-molekul yang berhubungan dengan T1D ini , memungkinkan untuk deskripsi peptida tersebut. Motif yang mengikat untuk alel ini. Namun, repertoar peptida HLA-DR8 hanya dijelaskan secara parsial 20 dan motif yang mengikat masih belum diketahui. Dalam laporan ini, kami mendefinisikan motif pengikatan peptida DR8 dari analisis 486 ligan alami yang unik, yang merupakan produk fisiologis dari pemrosesan dan penyajian antigen. 11 Serupa dengan molekul kelas II diabetogenik lainnya, fitur utama dari motif pengikat peptida HLA-DR8 adalah bahwa ia mengikat peptida dengan residu asam di kantong P9. Mengetahui apakah peptida akan berikatan dengan molekul MHC spesifik berguna untuk pengembangan vaksin atau antigen spesifik untuk secara cepat menunjukkan peptida pengikat MHC yang paling mungkin dan untuk menyaring peptida yang tidak akan mengikat.

Hasil

Deskripsi repertoar peptida terikat ke HLA-DR8 (DRA1 * 0101 / B1 * 0801)

Analisis repertoar peptida DR8 dilakukan dengan mengurutkan peptida terikat dengan MDLC-μESI-ITMS / MS, menggunakan spektrometer massa perangkap ion LTQ. Lebih dari 40.000 spektrum MS / MS diperoleh dari dua sampel dan data tersebut dicari berdasarkan database manusia target / umpan. 21 Strategi sasaran / umpan didasarkan pada prinsip bahwa kecocokan yang salah memiliki probabilitas yang sama untuk diperoleh dari target atau basis data umpan. 22, 23 Sebaliknya, spektrum dengan informasi urutan yang relevan akan cocok dengan urutan yang sesuai di basis data target tetapi tidak dalam basis data umpan. Sebagian besar peptida hadir sebagai 'keluarga peptida' atau 'set bersarang', di mana semua anggota berbagi urutan yang sama dengan berbagai residu mengapit di sepanjang C- dan N-termini, seperti biasa untuk peptida MHC kelas II. Sebagai kontrol kualitas, pemeriksaan manual setidaknya satu spektrum dari setiap keluarga peptida dan semua spektrum tunggal dilakukan, setelah itu total 486 ligan DR8 alami yang berbeda diidentifikasi (Tabel Tambahan 1, Data Tambahan). Peptida yang dielusi dari DR8 dikelompokkan menjadi 230 set yang berbeda, 124 di antaranya disusun oleh peptida tunggal dan 106 mengandung 2-34 peptida berbeda. Distribusi ukuran peptida normal (Gambar 1), dengan ukuran mulai dari 9 hingga 43 panjang asam amino, sebagian besar (88, 7%) dalam kisaran ukuran standar kelas II, 12 hingga 22 asam amino. 20, 24 Peptida berasal dari 192 sumber protein yang berbeda dari beberapa kompartemen seluler. Untuk menghindari redundansi, lokalisasi protein yang paling umum digunakan untuk protein yang memiliki lebih dari satu kompartemen sel. Seperti yang diharapkan, protein sumber mengikuti pola umum untuk repertoar garis sel-B lainnya; 25, 26 yang sebagian besar adalah protein membran eksogen atau penghuni jalur endositik, tetapi ada juga sejumlah besar protein dari sitosol (30, 7%), serta nukleus dan organel seluler lainnya (Gambar 1).

Image

Analisis lokalisasi dan ukuran peptida diurutkan dari garis sel DR8 homozigot. ( a ) Distribusi ukuran peptida (jumlah asam amino) dari semua peptida. ( B ) Distribusi seluler protein sumber peptida, menurut jalur pemrosesan mereka, E: jalur endositik (batang hitam); C, jalur sitosolik (batang kosong). ( c ) Masing-masing dari dua kelompok dalam panel b dipisahkan, sesuai dengan lokalisasi intraseluler mereka. Bilah hitam, peptida E; batang kosong, peptida C. M, membran seluler; Lys / End, lisosom atau endososom; E, eksogen; EM, matriks ekstraseluler; g, golgi; C, sitosol; mit, mitochondria; ER, retikulum endoplasma; N, nuklir.

Gambar ukuran penuh

Definisi motif pengikat HLA-DR8

Metode kami memprediksi motif pengikatan DR8 didasarkan pada hipotesis bahwa kantong yang berbeda tidak tergantung dari sisa alur pengikatan peptida. 27, 28 Dengan demikian, setelah spesifisitas pengikatan kantung telah ditentukan, ini dapat menjadi umum untuk alel HLA-DR lainnya dengan residu identik yang berkontribusi pada kantung. 25, 27 Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, urutan domain β1 dari HLA-DR8 dan -DR1 berbeda dalam 15 residu, tidak ada di wilayah di mana posisi 1 (P1) peptida berlabuh. Akibatnya, peptida terikat ke DR1 dan DR8 harus mengandung residu aromatik atau hidrofobik yang sama di P1 (Tyr, Phe, Trp, Leu, Ile, Ala, Val atau Met) (//www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/ FindYourMotif.htm). Oleh karena itu, kami mendefinisikan inti peptida yang memberikan residu aromatik atau hidrofobik ke P1. Jadi, tergantung pada jumlah residu ini dan pada panjang urutan, masing-masing peptida dapat memiliki inti yang berbeda. Menurut model ini, hanya 4 dari 228 sekuens yang dianalisis tidak memiliki residu P1 yang diizinkan.

Image

( a ) Perbandingan urutan domain β1 dari HLA-DRB1 * 0101 dan * 0801. Residu variabel ditunjukkan untuk urutan DR8, dan asam amino yang berpartisipasi dalam masing-masing kantong pengikat peptida ditunjukkan dalam warna: P1 (merah), P4 (oranye), P6 (hijau) dan P9 (biru). ( B) Representasi pita dari molekul DR8. Struktur tulang belakang (berwarna hijau), dan lokalisasi residu dalam alur pengikat peptida yang menampung posisi P1 (merah), P4 (oranye), P6 (hijau) dan P9 (biru) dari peptida.

Gambar ukuran penuh

Analisis frekuensi residu asam amino yang menempati masing-masing dari sembilan posisi inti dilakukan, mendefinisikan matriks frekuensi yang mencakup semua core yang mungkin untuk setiap urutan tanpa urutan berulang. Dengan demikian, dari 486 peptida, 228 sekuens sentral berbeda didefinisikan (selalu menggunakan urutan umum dalam keluarga peptida). Dari sekuens sentral ini, 789 inti P1-P9 yang berbeda (bukan-bukan) diperoleh untuk membangun matriks frekuensi. Frekuensi eksperimental ini dinormalisasi atas frekuensi rata-rata residu yang sama di antara protein manusia.

Matriks pertama ini menunjukkan preferensi yang jelas untuk residu asam di P9 (28% dari nonamers) (Gambar Tambahan 1). Oleh karena itu, ketika lebih dari satu inti didefinisikan untuk urutan tunggal dan hanya satu yang memiliki Asp atau Glu di P9, ini dipilih dan matriks baru dihasilkan, membatasi jumlah non-inti menjadi 512. Preferensi yang jelas untuk Lys di posisi P6 atau P4 kemudian diamati, dan inti dengan fitur ini kemudian dipilih untuk peptida dengan lebih dari satu inti, untuk menghasilkan matriks baru. Peptida multi-inti yang tersisa kemudian dipersempit berdasarkan kecocokan terbaik mereka dengan matriks sebelumnya. Pada akhirnya, matriks final dihasilkan dengan hanya satu inti yang mungkin untuk setiap urutan (Gambar 3).

Image

Motif pengikat peptida dari DR8. ( a ) Matriks akhir (lihat teks). ( B ) Representasi skematis dari persentase masing-masing asam amino dalam setiap posisi P1 ke P9, dinormalisasi terhadap frekuensi setiap residu dalam proteom manusia. ( c ) Motif pengikat peptida DR8. Residu jangkar utama adalah yang secara signifikan meningkat setelah koreksi Bonferroni. Juga ditunjukkan residu sekunder, meningkat secara signifikan hanya sebelum koreksi Bonferroni.

Gambar ukuran penuh

Gambar 4 menunjukkan frekuensi setiap residu asam amino pada setiap posisi inti dan peningkatan atau penurunan relatifnya sehubungan dengan kelimpahannya dalam proteom manusia. Data menunjukkan bahwa frekuensi peningkatan paling signifikan berhubungan dengan posisi P1, P4, P6 dan P9. P1 terutama ditempati oleh Phe dan Tyr (peningkatan 7, 2 dan 10 kali lipat); Lys lebih disukai di P4 dan P6 (peningkatan 3, 6 dan 4, 3 kali lipat); dan Asp dan Glu dalam P9 (peningkatan 9, 3 dan 3, 8 kali lipat). Selain itu, beberapa residu meningkat di posisi lain: Ile meningkat sebesar 2, 2 kali lipat di P3 dan Ala di P7 memiliki peningkatan 2, 5 kali lipat, menunjukkan residu yang lebih disukai untuk posisi non-jangkar. Beberapa asam amino menurun secara signifikan, seperti Ser dalam P4, Leu di P6 dan Ala, Lys dan Leu di P9. Residu hanya meningkat secara signifikan sebelum koreksi Bonferroni (Gambar 3) dianggap residu sekunder.

Image

Deskripsi motif jangkar peptida HLA-DR8. Untuk setiap posisi inti peptida (P), persentase frekuensi dari masing-masing asam amino (frekuensi residu (RF)) dihitung. Nilai-nilai yang dinormalisasi dihitung sebagai berapa kali setiap RF meningkat atau menurun relatif terhadap frekuensi rata-rata residu yang sesuai di antara protein manusia (penyimpangan dari rata-rata dalam proteome (DMP)). Nilai DMP juga disajikan sebagai histogram. Bilah hijau menunjukkan nilai DMP yang meningkat secara signifikan atau bilah merah menurun ( P <0, 01) setelah koreksi Bonferroni, bilah hijau muda menunjukkan nilai DMP yang meningkat secara signifikan sebelum, tetapi tidak setelahnya, koreksi, dan bilah hitam menunjukkan nilai DMP yang tidak signifikan.

Gambar ukuran penuh

Hasil kami juga menunjukkan bahwa posisi pembatas utama alur pengikat DR8 adalah saku yang menampung residu P9. Dari sekuens total yang dianalisis, 71% memiliki inti dengan P1 yang benar dan residu asam pada P9, seperti yang diamati untuk alel MHC terkait T1D lainnya, IA g7 (ref. 10) dan DQ8. 12 Sedangkan untuk IA g7 dan DQ8, saku ini juga menerima Gln, Asn dan Gly. 12, 27 Penurunan Arg, Lys dan Pro di P9 mengkonfirmasi data sebelumnya untuk alel non-Asp β57, 27 menunjukkan bahwa asam amino ini pada P9 akan secara negatif mengganggu peptida yang mengikat DR8. Hasil yang menarik menyangkut posisi P4 dan P6, dengan preferensi yang jelas untuk Lys: 46% dari peptida memiliki Lys di P4 atau P6. Dari jumlah tersebut, 45% (21% dari total) memiliki Lys pada P4 dan 55% (25% dari total) memiliki Lys pada P6. Menariknya, kehadiran Lys di salah satu dari dua posisi muncul untuk mengecualikan keberadaan Lys di posisi lain; tidak ada peptida dengan Lys pada P4 dan P6 yang diidentifikasi. Analisis lebih lanjut tentang frekuensi kombinasi residu pada posisi P4, P6 dan P9 menunjukkan bahwa, meskipun posisi P4 dan P6 tampaknya saling terkait satu sama lain, P9 tampaknya tidak mempengaruhi residu yang terikat pada dua posisi lainnya. Dengan demikian, persentase peptida dengan Lys pada P4 atau P6 serupa dalam peptida dengan atau tanpa Asp atau Glu pada P9.

Hasil pemodelan

Gambar 5 menunjukkan model yang dipilih dari kompleks DR8-peptida dengan energi interaksi terendah. Peptida melanotransferrin FTV Y GL L D K AQ D LF, sesuai dengan motif DR8 (Tyr di P1, Leu di P4, Lys di P6 dan Asp di P9) dengan afinitas pengikatan teoritis yang baik dan karenanya harus menjadi pengikat yang baik. Model kedua, dibuat dengan bahan pengikat baik lainnya, peptida DEE F LI K I A AI D N dari phosphatidylinositol 4-kinase tipe 2-beta, memiliki energi interaksi terendah dengan Lys di P4. Docking dilakukan untuk secara otomatis menghitung kemungkinan persatuan DR8 dengan peptida, mengkonfirmasi hipotesis kami, yaitu, serikat paling stabil yang melokalisasi peptida di dalam alur pengikatan memiliki residu P1-P9 yang diprediksi. Interaksi ini antara peptida dan molekul DR8 kemudian dihitung dengan perangkat lunak kalkulator interaksi protein (PIC). Ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik dan ionik tambahan terdeteksi yang mampu mempertahankan ikatan peptida dan karenanya, menstabilkan kompleks (data tidak ditunjukkan).

Image

Model HLA-DR8 dikomplekskan dengan dua peptida. Permukaan potensial elektrostatik dari DR8 (wilayah merah, negatif; wilayah biru, positif) dengan peptida yang tertambat oleh residu yang memberikan lebih sedikit energi interaksi. ( a ) DR8 mengikat melanotransferrin peptida IFTV Y GL L D K AQ D LF (mengandung K pada P6) dan ( b ) DR8 dengan peptida 4-kinase fosfatidlinositol 4-kinase DEE F LI K I A AI D N (mengandung K pada P4) . Jaringan ikatan hidrogen putatif (oranye) antara peptida (abu-abu), dan residu yang tersusun dari alur pengikat peptida dari HLA-DR8 ditunjukkan. Residu Lys di P4 dan P6, masing-masing, ditandai dengan warna kuning.

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Studi ini memberikan karakterisasi pertama dari motif pengikat peptida untuk HLA-DR8 (DRA1 * 0101 / DRB1 * 0801), bagian dari haplotipe HLA yang terkait dengan kerentanan terhadap T1D. Kami telah menetapkan metode analisis yang andal berdasarkan pada proteomik yang sangat sensitif untuk mengidentifikasi sejumlah besar peptida dan berdasarkan pada alat bioinformatika untuk menganalisis urutan peptida secara efisien.

Meskipun belum ditetapkan alel haplotipe mana yang terlibat (DRB1 * 0801 (DR8) -DQA1 * 0401 / DQB1 * 0402 (DQ4)) memberikan kerentanan terhadap penyakit, hasil kami menunjukkan bahwa daripada DQ4, yang paling mungkin terjadi. alel kerentanan adalah DR8. Memang urutan HLA-DR8 berisi fitur struktural yang umum untuk alel manusia terkait T1D lainnya (DQ8, DQ2) atau tikus (IA g7 ), tidak adanya Asp pada posisi 57 dari rantai β, tidak ditemukan dalam molekul DQ4. Selain itu, hasilnya menunjukkan kesamaan yang mencolok antara motif pengikat peptida untuk HLA-DR8 dan alel T1D lainnya, dominasi residu asam pada posisi P9 dari inti peptida. Fitur ini juga tidak ada pada motif pengikat peptida HLA-DQ4. 29

Garis sel HLA-DR8 homozigot yang diabadikan membawa haplotype 6 yang berhubungan dengan HLA-DR8-DQ4 yang terkait dengan T1D digunakan untuk analisis. Ada sedikit informasi tentang DR8 mengikat peptida dan tidak ada informasi konkret tentang motif mengikat peptida. Hingga saat ini hanya 50 sekuens termasuk kelompok kumpulan bersarang 20 dan dua epitop sel-T yang telah diterbitkan. 30, 31 Penggunaan peptida yang diproses secara alami alih-alih peptida sintetik atau pustaka tampilan fag untuk identifikasi motif pengikatan peptida pada molekul MHC II memiliki keuntungan utama bahwa peptida telah dipilih oleh sel-sel penyaji antigen selama pemrosesan antigen, di mana sejumlah peristiwa seluler memengaruhi pemilihan peptida. 32 Kami mengurutkan 486 peptida terikat DR8 yang diproses secara alami secara unik oleh MDLC-μESI-ITMS / MS. Seperti yang diharapkan, sebagian besar protein yang menghasilkan ligan berasal dari kompartemen membran, termasuk membran plasma, alat golgi, endosom, lisosom, retikulum endoplasma dan sekresi vesikel. Beberapa peptida muncul dari protein sitosol, konsisten dengan temuan sebelumnya untuk alel lainnya. 25, 26

Meskipun polimorfisme tinggi rantai MHC kelas II β, wilayah yang terdiri dari β81-β92 adalah umum di antara kebanyakan alel HLA-DR, termasuk DR8. Wilayah ini membentuk kantung di mana posisi P1 peptida berlabuh, memungkinkan asumsi bahwa DR8 akan mengikat residu hidrofobik dan tidak bermuatan pada posisi ini, seperti yang dilakukan oleh semua alel yang berbagi wilayah ini. Semua, kecuali empat, dari sekuens mengandung setidaknya satu residu hidrofobik atau aromatik yang dapat dipilih sebagai P1. Dengan demikian, fitur ini digunakan untuk mendefinisikan inti peptida, seperti yang kami miliki dalam definisi motif pengikatan peptida RA-terkait HLA-DR10. 25

Molekul kelas II memiliki dimorfisme yang telah dikonservasi melalui evolusi, ditentukan oleh ada atau tidaknya Asp pada posisi 57 rantai DR atau DQ β. Dimorfisme ini telah ditunjukkan memiliki peran utama dalam pengikatan molekul pada peptida tertentu, menunjukkan preferensi untuk residu asam dalam P9 oleh alel non-Asp57, termasuk DR8. 33 Tiga alel terkait T1D pada tikus dan manusia, H-2I-A g7 DQ2 dan DQ8, berbagi polimorfisme ini, dengan Ser atau Ala yang mengganti Asp pada β57, seperti pada HLA-DR8 (Tabel Tambahan 2). Dengan demikian, karakteristik kantong P9 dari DR8, DQ8 dan homolog tikusnya IA g7 adalah serupa dan, sebagai konsekuensinya, semuanya mengikat peptida dengan residu asam pada posisi ini. Mirip dengan DQ8 dan IA g7, tidak ada asam amino bermuatan positif pada P9 yang ditemukan dalam peptida DR8. HLA-DQ2, juga terkait dengan T1D, mengandung alur pengikatan bermuatan sangat positif di mana residu asam disukai tidak hanya pada P9 tetapi juga pada hampir semua posisi. 19 Di sisi lain, molekul DQ4 (DQA * 0401 / DQB * 0402) dari haplotipe DR8 memiliki Aspβ57, oleh karena itu ia tidak akan memiliki preferensi untuk residu asam pada P9. Oleh karena itu, kerentanan terhadap T1D dari haplotipe DR8-DQ4 harus diberikan oleh molekul DR. Fitur lain yang menarik dari motif pengikat DR8 adalah preferensi untuk Lys di posisi P4 atau P6, tidak dibagi oleh alel terkait T1D lainnya. Preferensi itu dibatasi, karena keberadaan Lys di salah satu posisi muncul untuk mencegah lokasi asam amino yang sama di tempat lain. Dengan demikian, hanya satu Lys yang diizinkan di tengah alur, yang terkait dengan kantong 4 dan 6. Dalam laporan sebelumnya, afinitas pengikatan peptida ke DQ8 terbukti menurun jika ada Lys di posisi 6 atau 4, 12 yang mengindikasikan bahwa ini adalah fitur spesifik peptida DR8 yang dapat membatasi kemungkinan berbagi repertoar.

MHC menyumbang sekitar 50% dari risiko yang sudah diketahui untuk T1D. 34 Identitas residu β57 penting baik untuk kerentanan dan perlindungan penyakit: Ala, Ser atau Val di β57 mendefinisikan alel predisposisi seperti DQ2, DQ8, IA g7 dan DR8, sedangkan Asp ditemukan dalam alel pelindung DQ6. Penjelasan struktural untuk pentingnya β57 diperoleh dari struktur kristal IA k dan IA d di mana ditunjukkan bahwa Asp pada β57 membentuk jembatan garam dengan Arg pada posisi 76 dari rantai-α (homolog ke posisi 79 pada Rantai DQα). Interaksi ini penting untuk menstabilkan kompleks rantai αβ dan berkontribusi pada integritas alur pengikatan peptida kelas II. 35 Tidak adanya Asp di β57 mengakibatkan hilangnya jembatan garam β57-α76, memodifikasi jaringan ikatan hidrogen. Tanpa residu asam, Arg di α76 bergeser sedikit untuk membentuk ikatan hidrogen dengan Leu di β53 dan Ser di β57 melalui molekul air yang terkubur. Hasilnya adalah pembentukan kantong P9 yang lebih luas, memungkinkan kebebasan lateral yang lebih besar ke rantai samping residu peptida. Kurangnya Asp57 tidak hanya memberikan potensi untuk berinteraksi dengan peptida yang mengandung residu asam pada P9 tetapi juga dengan reseptor sel T dengan loop CDR3β bermuatan negatif. 36

Hubungan antara DR8 dan alel-alel ini lebih jauh dikonfirmasi dengan menganalisis kapasitas teoritis peptida DR8 untuk mengikat DQ8, IA g7 dan DQ2, menggunakan alat MHC2Pred untuk prediksi pengikat MHC kelas II yang tidak pasti (//www.imtech.res.in/ raghava / mhc2pred /). Dari 216 urutan DR8 yang dianalisis, 59 dan 51%, masing-masing, berpotensi merupakan pengikat yang baik untuk DQ8 dan I-Ag7, menggunakan ambang batas yang sangat ketat dari 1. Ditemukan tidak ada pengikatan teoritis dari setiap peptida ke DQ2 yang ditemukan (data tidak ditampilkan). Selain itu, sejumlah ( n = 30) peptida yang terdefinisi dengan baik dari T1D autoantigens GAD65, HSP60, proinsulin dan ICA69, dibatasi oleh IA g7 DQ8 dan DR4 (B1 * 0401), dianalisis secara sama. Setengah dari peptida (15/30), termasuk 6/12 dibatasi oleh DR4, menunjukkan kesesuaian sempurna dengan motif DR8 (Tabel Tambahan 3). Di sisi lain, beberapa peptida yang diisolasi dari DR8 sebelumnya telah diidentifikasi sebagai ligan DQ8 atau IA g7 (5/486, lihat Tabel Tambahan 1, Data Tambahan) (//www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dll/ FindYourMotif.htm).

Polimorfisme pada β57 berlaku untuk DR, DQ dan rantai beta kelas tikus II, tetapi hubungannya dengan risiko T1D pada manusia lebih jelas dalam seri alel DQ. Efek dosis polimorfisme ini dalam kaitannya dengan risiko T1D belum ditetapkan, meskipun hubungan tertinggi sesuai dengan haplotipe tanpa Asp57 dalam rantai DR dan DQ β (DRB1 * 0405 / DQA1 * 0301-DQB1 * 0302) ( ref. 6) dan perlindungan tertinggi terhadap haplotipe DR15, dengan Asp57 di rantai DR dan DQ β (DRB1 * 15 / DQA1 * 0102-DQB1 * 06). Namun, keberadaan hanya satu alel DQ yang kekurangan Asp57 tampaknya cukup untuk kerentanan, seperti halnya DR3 dan haplotipe DR4 terkait lainnya (Tabel Tambahan 2). Selain itu, dua haplotip pelindung (DRB1 * 0701 / DQA1 * 0201-DQB1 * 0303 dan DRB1 * 1401 / DQA1 * 0101-DQB1 * 0503) membawa DR non-Asp dan Asp DQ. Haplotipe HLA-DR8 yang terkait dengan penyakit, DR8-DQ4, berperilaku berbeda. Dalam penelitian ini, tidak adanya Asp pada posisi 57 dari molekul DR tampaknya cukup untuk risiko penyakit. Pentingnya relatif DR vs DQ untuk presentasi peptida di setiap haplotype tidak diketahui, tetapi dua alel DR pelindung non-Asp memiliki kantong P9 yang sama sekali berbeda, sedangkan kantong DR8 P9 hampir identik dengan DQ8. Oleh karena itu, urutan spesifik peptida yang terikat pada molekul-molekul inilah yang tampaknya paling penting dalam mendefinisikan risiko penyakit yang dihasilkan dari kapasitas unik dari beberapa alel DQ dan DR non-Asp untuk mengikat peptida dengan motif urutan yang sangat spesifik. Tidak ada bukti struktural lain yang umum untuk risiko haplotipe dan tidak ada yang melindungi ditemukan dalam residu saku P9.

Data kami menekankan pentingnya peptida yang disajikan oleh molekul kelas II yang terkait dengan penyakit autoimun dan menunjukkan bahwa peptida yang sama dapat disajikan oleh alel terkait T1D yang berbeda untuk dikenali oleh sel T yang berhubungan dengan penyakit.

material dan metode

Garis sel dan antibodi

FN86 adalah garis sel limfoblastoid homozigot HLA-DR8. Itu dihasilkan di laboratorium kami oleh transformasi virus Epstein-Barr limfosit B dari darah segar donor homozigot DRB1 * 0801 dengan mengikuti prosedur standar. 37 Pengetikan HLA lengkap untuk sel FN86 adalah: HLA-A * 0301, * 1101; B * 0702, * 4402; Cw * 0102, * 0702; DRB1 * 0801; DQB1 * 0402. Sel-sel yang ditransformasi ditanam dalam botol roller di RPMI (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) dengan 10% serum janin sapi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), dicuci dua kali dalam larutan salin fosfat dingin dan disimpan sebagai pelet beku pada suhu −80 ° C sampai digunakan. IgG2b mAb B8.11.2 tikus Anti-HLA-DRβ disediakan oleh Dr F Koning, Departemen Imunohematologi, Universitas Leiden, Belanda, digunakan untuk kromatografi afinitas.

Pemurnian imununoaffinitas dari kompleks HLA-DR-peptida

Kompleks Peptide – HLA-DR dimurnikan sebagaimana dijelaskan, 38, 39 dengan beberapa modifikasi. Secara singkat, 10 (ref. 9) sel dilisiskan dalam 50 m M TrisHCl, pH 7, 6, 150 m M NaCl, 0, 5% Nonidet P40 (Surfact-Amps NP40, Pierce, Rockford, IL, USA) dengan protease inhibitor (Complete Protease Inhibitor) Cocktail, Roche Diagnostics, Basel, Swiss) pada 4 ° C selama 1 jam. Lisat disentrifugasi selama 15 menit pada 1500 g , dan supernatan disentrifugasi selama 1 jam pada 100.000 g dan didahului dengan menggunakan manik-manik sepharose yang diblokir Tris. Kompleks HLA-II-peptida dari lisat dimurnikan dengan kromatografi afinitas menggunakan 1 ml kolom manik sepharose dengan 5 mg mAb B8.11.2 yang dimurnikan.

Kompleks HLA-II-peptida dielusi dengan asam trifluoroasetat 0, 1%, mengikuti prosedur standar. 26 Campuran peptida kelas II yang dielusi diputar melalui filter ultrafiltrasi cutoff 10.000 Da (Centricon 10; Amicon, Beverly, MA, USA) dan dikumpulkan dari flow-through.

Analisis kromatografi cair-spektrometri massa

Sampel diuapkan hingga kering, dilarutkan dalam 1 ml asam trifluoroasetat 1% dan dihilangkan garamnya menggunakan kartrid ekstraksi fase padat C18 (3 ml, dukungan 15 mg, Varian, Lake Forest, CA, USA). Campuran yang dihilangkan garamnya dipekatkan sampai 5 μl dan diencerkan sampai 40 μl dengan asam format 1%. Sampel dianalisis dengan kromatografi cair multidimensi electrospray tandem spektrometri massa (MDLC-μESI-ITMS / MS), menggunakan perangkap ion LTQ linier yang dilengkapi dengan sumber ion microESI (ThermoFisher, San Jose, CA, USA). Pemisahan peptida dilakukan pada sistem Agilent 1200 HPLC (Agilent Technologies, Barcelona, ​​Spanyol) yang terdiri dari pompa kapiler, pompa biner, microinjector termostasi dan katup microswitch. Kolom pertukaran Zorbax Bio-SCX II (3, 5 μm, 35 × 3 mm) digunakan untuk dimensi LC pertama. Peptida terserap dielusi menggunakan tujuh langkah garam 0, 10, 25, 50, 100, 500 dan 2000 mM amonium asetat. Kartrid prekonsentrasi Zorbax 300SB-C18 (5 μm, 5 × 0, 3 mm, Agilent Technologies) digunakan untuk memusatkan dan menghilangkan garam setiap fraksi peptida sebelum dimensi LC kedua. Kromatografi cair fase terbalik kapiler dilakukan dengan menggunakan kolom Vydac C18 panjang 10 cm, 150-id id (Vydac, Deerfield, IL, USA). Pemisahan dilakukan pada 1 μl min- 1 menggunakan gradien asetonitril linier dari 3 hingga 40% dalam 120 menit (asam format: 0, 1% pelarut, larutan B: asetonitril dengan asam format 0, 1%). Rentang pemindaian untuk MS penuh adalah 400-2000 m / z . Pemindaian penuh diikuti oleh delapan MS / MS untuk sinyal yang paling melimpah diperoleh dengan menggunakan mode bergantung-data otomatis instrumen. Untuk meminimalkan pemilihan ion prekursor yang berlebihan, pengecualian dinamis ditetapkan ke 1 pemindaian MS / MS untuk setiap jendela waktu 5 menit.

Pencarian basis data

Spektrum fragmentasi MS / MS dicari menggunakan SEQUEST (Bioworks v3.3, ThermoFisher) terhadap database target / umpan gabungan yang terdiri dari basis data Human UniProt (rilis SwissProt 08/04/2008), yang salinannya dibalik atau dibalik semu adalah ditambahkan. Basis data umpan dibangun dengan membalik urutan protein dalam database SwissProt manusia. Parameter pencarian adalah: toleransi massa peptida, 2 Da; toleransi fragmen, 0, 8 Da; tidak ada batasan enzim; modifikasi statis, sistein karbamidometilasi (+57 Da); modifikasi dinamis, oksidasi metionin (+16 Da). Identifikasi urutan peptida yang benar dievaluasi menggunakan skor Xcorr dari SEQUEST dan nilai D , yang dihitung seperti yang dijelaskan. 21 Identifikasi yang benar adalah yang memiliki skor di dalam area yang mendefinisikan tingkat penemuan palsu <1%.

Generasi matriks

Urutan inti peptida diidentifikasi menggunakan program perangkat lunak Motif 09, dibuat oleh Dr Joaquin Abian (perangkat lunak tersedia online di //code.google.com/p/mhc-laia-motifs/). Memperbaiki asam amino pada P1 (berdasarkan kesamaan kantong P1 dari sebagian besar alel DR), perangkat lunak mengidentifikasi semua inti yang mungkin dalam daftar peptida. Urutan inti yang selaras menghasilkan matriks 20 × 9 dengan persentase setiap asam amino pada setiap posisi. Analisis statistik kemudian dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya. 40 Secara singkat, frekuensi setiap residu asam amino dalam posisi peptida yang diberikan dinormalisasi terhadap frekuensi rata-rata residu di antara protein manusia (//www.ebi.ac.uk/integr8/StatsAminoPage.do?orgProteomeId=25), menggunakan χ 2 -test dengan koreksi Yates '. Koreksi Bonferroni ( P- nilai × 20) kemudian diterapkan. Nilai P <0, 01 sebelum dan sesudah koreksi dianggap signifikan.

Pemodelan HLA-DR8 dengan peptida

Model HLA-DR8-CLIP dihasilkan oleh homologi dengan perangkat lunak PHYRE 41 dan MODELLER 42, menggunakan struktur CLIP-MHC kelas II (1MUJ) lain sebagai templat. Untuk mengidentifikasi daerah yang berinteraksi dari dua peptida yang dipelajari dalam penelitian ini (DEEFLIKIAAIDN dari manusia phosphatidylinositol 4-kinase dan FTVYGLLDKAQDLF dari manusia melanotransferrin), peptida dibagi menjadi sembilan fragmen panjang asam amino. Dengan menggunakan perangkat lunak FoldX 43, 44, 45, posisi inti peptida CLIP dimutasi untuk mereproduksi setiap dari sembilan sekuens asam amino ini. FoldX menghasilkan 10 model yang berbeda mempertimbangkan rotamers residu putatif yang berbeda untuk masing-masing dari urutan asam amino sembilan. Energi dari masing-masing model dihitung dengan FoldX, dan yang paling hemat energi dipilih dan diminimalkan dengan menggunakan perangkat lunak NAMD. 46 Akhirnya, sembilan urutan asam amino terbaik dipilih. Kandidat terakhir untuk masing-masing dari dua peptida tersebut digambarkan menggunakan perangkat lunak CHIMERA. 47

Informasi tambahan

File gambar

  1. 1.

    Gambar Tambahan 1

Dokumen Word

  1. 1.

    Legenda Gambar Tambahan

  2. 2.

    Tabel Tambahan 1-3

    Informasi Tambahan menyertai makalah di situs Genes and Immunity (//www.nature.com/gene)