Internalisasi fotokimia kemoterapi mempotensiasi pembunuhan sel kanker payudara dan kandung kemih yang resistan terhadap berbagai obat | jurnal kanker Inggris

Internalisasi fotokimia kemoterapi mempotensiasi pembunuhan sel kanker payudara dan kandung kemih yang resistan terhadap berbagai obat | jurnal kanker Inggris

Anonim

Artikel ini telah diperbarui

Abstrak

Multidrug resistance (MDR) adalah faktor pembaur utama dalam kemoterapi tumor adjuvant padat. Peningkatan jumlah kemoterapi dalam intraseluler untuk menghindari MDR dapat dicapai dengan metode pengiriman baru, internalisasi fotokimia (PCI). PCI terdiri dari pemberian bersama obat dan fotosensitiser; setelah aktivasi ringan yang terakhir menginduksi pelepasan obat yang diikat organel secara intraseluler. Kami menyelidiki apakah pemberian bersama hypericin (photosensitiser) dengan mitoxantrone (MTZ, chemotherapeutic) plus iluminasi meningkatkan potensi sitotoksisitas pada sel kanker MDR. Kami memetakan sejauh mana co-lokalisasi obat / fotosensitiser intraseluler. Kami menentukan apakah PCI mengubah ekspresi P-glikoprotein (Pgp) pompa ekskresi obat yang diekskresikan atau berfungsi dalam sel MDR. Sel-sel kandung kemih dan kanker payudara dan subclone MDR yang diekspresikan berlebih Pgp (MGHU1, MGHU1 / R, MCF-7, MCF-7 / R) diberikan kombinasi hypericin / MTZ, dengan / tanpa penerangan cahaya biru. Percobaan percobaan menentukan dosis sublethal yang tepat untuk masing-masing. Viabilitas ditentukan dengan uji 3- [4, 5-dimethylthiazolyl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide. Lokalisasi intraseluler dipetakan oleh mikroskop confocal. Ekspresi Pgp terdeteksi oleh immunofluorescence dan fungsi Pgp diselidiki oleh Rhodamine123 eflux pada mikroskop confocal. MTZ saja (0, 1-0, 2 μ g ml- 1 ) membunuh hingga 89% sel yang peka terhadap obat; Sel-sel MDR menunjukkan lebih sedikit sitotoksisitas (6-28%). Efek hypericin (0, 1-0, 2 μ M) serupa untuk semua sel; iluminasi cahaya tidak menyebabkan toksisitas minimal. Dalam kombinasi, MTZ / hypericin plus iluminasi, potensi pembunuhan sel MDR, vs hypericin atau MTZ saja. (MGHU1 / R: 38, 65 dan peningkatan 36, 63%, P <0, 05; MCF-7 / R: 80, 2 dan peningkatan 46, 1%, P <0, 001). Penerangan kombinasi MTZ / hypericin meningkatkan pembunuhan sebesar 28, 15% ( P <0, 05 MGHU1 / R) dibandingkan dengan kontrol gelap. Ko-lokalisasi vesikular intrasitoplasma MTZ / hiperisin terbukti sebelum iluminasi dan pada waktu-waktu serial pasca iluminasi. MTZ selalu ditemukan di inti sel sensitif, tetapi tidak di inti sel yang resistan gelap. Dalam sel-sel resisten yang diterangi ada beberapa mobilisasi MTZ ke dalam nukleus. Ekspresi Pgp tetap tidak berubah, terlepas dari paparan obat. Efflux Pgp diblokir oleh verapamil inhibitor Pgp (kontrol positif) tetapi tidak terhambat oleh hiperisin. Peningkatan pembunuhan sel kanker MDR yang ditunjukkan konsisten dengan PCI. PCI adalah teknik yang menjanjikan untuk meningkatkan kemanjuran pengobatan.

Utama

Resistensi terhadap beberapa agen kemoterapi antineoplastik membatasi kemanjuran terapi kanker (Leslie et al, 2005). Perkembangan kanker umumnya terkait dengan pembentukan subkoloni di dalam tumor heterogen. Bergantung pada tekanan seleksi, hanya subpopulasi elit fenotipik yang akan bertahan. Paparan obat-obat kemoterapi adalah contoh dari tekanan seleksi semacam itu dari mana hanya beberapa sel tumor yang akan bertahan hidup dengan mengekspresikan fenotip multidrug-resistant (MDR), yang menjadikannya bias untuk pengobatan. Dua mekanisme yang mendasarinya adalah (1) pompa berlebih P-glikoprotein (Pgp) yang mengeluarkan obat dari sitosol dan (2) aksi lisosom dalam menurunkan obat yang diambil oleh endosom.

Mekanisme yang dipelajari dengan baik untuk MDR adalah penurunan akumulasi obat seluler yang dimediasi oleh keluarga transporter kaset pengikat ATP. Pengangkut ABC, misalnya, pompa penghabisan membran Pgp, diekspresikan dalam jaringan normal termasuk epitel usus, hati, tubulus ginjal, dan paru-paru, di mana mereka memediasi penghabisan racun dan obat-obatan (Han dan Zhang, 2004; Leslie et al, 2005) . Ekspresi transporter yang berlebihan oleh koloni sel tumor menyebabkan pengusiran dari sitoplasma obat anti-kanker sebelum mereka mencapai tempat kerjanya dan menghasilkan MDR seluler dan klinis. Meskipun awalnya hanya dikaitkan dengan peningkatan Pgp (Ambudkar et al, 1999), MDR dapat dihasilkan dari berbagai transporter ABC yang diekspresikan secara berlebihan, misalnya, protein yang tahan kanker dan protein yang terkait MDR (Shepard et al, 2003; Lepper et al, 2005).

Sejumlah obat makromolekul dan berat molekul rendah tidak mengikat reseptor permukaan sel tetapi ditargetkan ke kompartemen intraseluler. Seringkali tidak dapat secara bebas berdifusi melintasi membran lipid, obat diambil oleh endositosis sebelum dapat dilepaskan secara intraseluler untuk mencapai target mereka. Obat endositosis dapat terdegradasi dalam lisosom dan ini menghentikan aktivitas biologisnya. Salah satu mekanisme MDR pada kanker adalah peningkatan proses ini untuk secara signifikan membatasi kemanjuran obat (Høgset et al, 2004).

Photochemical internalisation (PCI) adalah perpanjangan dari terapi fotodinamik. Prinsip PCI adalah melokalisasi fotosensitiser bersama dengan obat atau gen pilihan dalam vesikel endositik di dalam sel target, dengan fotosensitiser yang secara lokal terlokalisasi pada membran vesikular (Høgset et al, 2004; Ndoye et al, 2004; Dietze et al, 2005). Iradiasi sel dengan cahaya dengan panjang gelombang tertentu akan merangsang fotosensitiser untuk menghasilkan spesies oksigen reaktif yang kemudian mengangkat membran (Gambar 1), yang menghasilkan pelepasan obat. (Høgset et al, 2004; Ndoye et al, 2004; Dietze et al, 2005). Akibatnya, PCI memungkinkan pengiriman obat yang lebih efisien ke target intraseluler mereka (Berg et al, 1999; Selbo et al, 2001; Høgset et al, 2004). Dalam pengobatan kanker, PCI sebagai prosedur yang lebih selektif daripada kemoterapi sistemik akan mengurangi efek sistemik dan aktivitasnya dapat dibatasi pada jaringan yang diradiasi.

Image

Representasi diagram PCI. (1) Fotosensitiser (PS) dan obat sitotoksik () bergabung ke dalam lapisan dalam membran fosfolipid sel target. (2) Endocytosed PS lebih disukai melokalisasi ke membran vesikuler endositik dengan obat sitotoksik yang terletak di lumen. Setelah iradiasi dengan cahaya dari panjang gelombang tertentu, fotosensitiser bersemangat, yang di hadapan oksigen molekuler menghasilkan spesies oksigen reaktif, oksigen singlet menjadi sangat penting. (3) Ini menurunkan dan memecah membran yang melepaskan obat sitotoksik langsung ke dalam sitosol.

Gambar ukuran penuh

PCI telah terbukti mempotensiasi aktivitas biologis dari berbagai makromolekul (Berg et al, 2003), misalnya, protein I tipe-ribosom-inaktivasi Gelonin (Barbieri et al, 1993). Polipeptida rantai tunggal ini tidak dapat mengikat permukaan sel atau memfasilitasi pelepasannya sendiri dari vesikel endositik (Stirpe et al, 1980). Meskipun merupakan penghambat kuat sintesis protein dalam sistem bebas sel, ia memiliki toksisitas rendah dalam sel utuh dan atau in vivo (Barbieri dan Stirpe, 1982; Scott et al, 1987). Gelonin terlokalisasi dalam kompartemen intraseluler yang sama dengan fotosensitiser aluminium phthalocyanine yang didulphonated (Selbo et al, 2000); yang terakhir telah terbukti melokalisasi dalam vesikel endositik baik in vitro (Moan et al, 1989) dan in vivo (Høgset et al, 2004). Penerangan sel yang mengandung dua agen menghasilkan pelepasan obat ke dalam sitoplasma (Høgset et al, 2004). PCI gelonin menghasilkan pengurangan 300 kali lipat sintesis protein dibandingkan dengan paparan gelonin saja atau cahaya plus fotosensitiser (PDT) saja.

Glucosylated polyethylenimine (PEI) bersamaan dengan PCI meningkatkan transfer yang dimediasi nonviral dari wt-p53 ke p53 -deleted PANC3 (pankreas karsinoma) dan p53 -mutated FaDu (karsinoma faring). PCI menghasilkan peningkatan ekspresi p53 mRNA sebesar 2, 3 kali lipat dalam sel PANC3, dibandingkan dengan PEI saja (Ndoye et al, 2004). PCI juga meningkatkan apoptosis pada kedua lini ke tingkat yang serupa dengan yang dicapai dengan kemoterapi. Dengan demikian dengan memfasilitasi pelepasan p53 tipe liar dari vesikel endositik, PCI meningkatkan ekspresi p53 dan aktivitasnya (apoptosis spontan) dibandingkan dengan PEI saja dalam garis sel kanker manusia. Temuan mendukung PCI sebagai prosedur alternatif untuk pengiriman gen ke dalam sitosol sel target (Berg et al, 1999).

Dalam penelitian sebelumnya yang melibatkan departemen kami, fotosensitiser disulfonasi meso-tetraphenylporphyrin (TPPS 2a ) diberikan bersama dengan obat antikanker doxorubicin, ke garis sel kanker payudara yang peka terhadap obat dan mitra resistannya (MCF-7 / S, MCF- 7 / R). Dosis yang digunakan untuk kedua agen adalah yang menghasilkan 50% sitotoksisitas seluler. Secara mengejutkan, administrasi dan iradiasi TPPS 2a, diikuti oleh inkubasi doxorubicin, menghasilkan peningkatan pembunuhan yang signifikan untuk sel-sel MDR. Setelah pelacakan mikroskop confocal, penulis menyarankan bahwa ini adalah karena fakta bahwa vesikel endolysosomal yang telah memasukkan TPPS 2a dihancurkan pada saat iluminasi dan oleh karena itu tidak menjebak obat doxorubicin (Lou et al, 2006).

Oleh karena itu kami memutuskan untuk mengeksplorasi penggunaan PCI dalam menghindari resistansi obat pada dua pasang garis sel kanker manusia, yang terdiri dari kedua garis orangtua yang peka terhadap obat dan subklon MDR, khususnya jalur sel kanker kandung kemih dan payudara, MGHU1 / S dan MGHU1 / R, dan MCF-7 / S dan MCF-7 / R. Kami juga memutuskan untuk menyelidiki efek sitotoksik dari konsentrasi obat sublethal, menggunakan mitoxantrone kemoterapi (MTZ) dan sebagai fotosensitiser ekstrak hypericin ekstrak St John's Wort. Antrakuinon, hiperisin, disintesis oleh genus tanaman hypericum dan mungkin merupakan fotosensitiser paling kuat yang ditemukan di alam. Hypericin menunjukkan karakteristik yang mendasar untuk penerapan PDT, termasuk fluoresensi cerah, hasil kuantum oksigen singlet tinggi pada penerangan dan toksisitas gelap minimal (Agostinis et al, 2002). Studi PDT sebelumnya tentang efek hiperisin pada fibroblast yang dikultur atau muratin keratinosit telah menunjukkan konsentrasi dan fototoksisitas yang bergantung pada cahaya (Yu et al, 1996; Theodossiou et al, 2004). Baru-baru ini, mekanisme fototoksik hiperisin tambahan terhadap mitokondria telah diidentifikasi. Ini tidak tergantung pada homeostasis glutathione / H2O2 (Theodossiou et al, 2006). Hypericin juga telah terbukti menginduksi PDT dalam sel kanker in vitro (Assefa et al, 1999). Namun, belum ada penelitian yang meneliti hiperisin dalam konteks PCI.

Kami pertama-tama menentukan efek relatif dari hypericin-PDT dan kedua kami memeriksa apakah PCI yang menggunakan hypericin dosis rendah mampu mempotensiasi sitotoksisitas MTZ pada lini sel ini.

material dan metode

Persiapan kultur sel

Dua set garis sel kanker manusia digunakan: (1) kanker kandung kemih MGHU1 / S (Masters et al, 1986) dan mitranya MDR MGHU1 / R (tumbuh dalam peningkatan konsentrasi adriamycin (ADR), Govern et al, 1988); (2) kanker payudara MCF-7 / S (Koleksi Eropa dari Kultur Sel Hewan, Porton Down, Inggris) dan mitra MDR-nya MCF-7 / R. Semua, kecuali MCF-7, disumbangkan oleh Profesor Masters, Pusat Penelitian Kanker Prostat, UCL. Kami sebelumnya menunjukkan ekspresi berlebih Pgp oleh MGHU1 / R dan MCF-7 / R (Davies et al, 1999). Sel-sel secara rutin ditanam dalam medium Eagle's Dulbecco yang dimodifikasi (DMEM) dengan serum betis janin (FCS) 10% ( v / v ) dan gentamisin 0, 1% ( v / v ), pada suhu 37 ° C. Sel-sel adalah trypsinised (1 mg ml- 1 dalam 0, 2% salin-dapar fosfat (PBS) / EDTA), disentrifugasi (× 2, 400 g, 5 menit) dan digunakan untuk perjalanan atau kerja eksperimental lebih lanjut. Untuk pelapisan ke dalam 96-well plate (100 μl well −1 ), sel ditangguhkan pada 100 000 sel / 100 μl (MGHU1 / S & R) atau 200 000 sel / 100 μl (MCF-7 / S & R). Angka-angka plating yang berbeda mencerminkan tingkat pertumbuhan dan memastikan pertumbuhan yang setara. (Reagen dari Sigma, Dorset, Inggris, kecuali dinyatakan lain).

Kurva dosis-respons mitoksantron dan hiperisin

Mitoxantone

Konsentrasi yang akan digunakan dalam percobaan kombinasi selanjutnya ditentukan dengan mengekspos sel pada konsentrasi MTZ dari 0, 1 hingga 2 μg ml- 1 . Sel-sel diunggulkan dalam 96 pelat sumur (lihat persiapan kultur sel) selama 24 jam, diinkubasi dengan MTZ selama 24 jam lebih lanjut pada suhu 37 ° C, dalam atmosfer 5% CO 2 yang dilembabkan dan dibiarkan pulih selama 24 jam. Sumur dicuci dua kali (PBS) setelah paparan obat dan limbah dihilangkan menggunakan pompa hisap pada setiap tahap. Viabilitas diuji dengan uji MTT.

Hypericin

Kondisi eksperimental untuk konsentrasi hypericin dan waktu penerangan untuk percobaan kombinasi lebih lanjut ditentukan sebagai berikut.

Waktu terpapar hiperisin

Sel terkena hiperisin selama 4 jam, yang merupakan waktu yang cukup untuk agen diinternalisasi (Theodossiou et al, 2004).

Respon dosis

Sel-sel disepuh seperti dijelaskan pada Gambar 2, dibungkus dengan aluminium foil dan dibiarkan mengendap dan tumbuh selama 24 jam pada suhu 37 ° C, 5% CO 2 . Pada saat ini, media dalam sumur diganti dengan media segar selama 20 jam lebih lanjut dan kemudian media diganti lagi dengan hypericin pada 0, 1, 0, 2, 0, 4, atau 1, 0 μ M selama 4 jam pada 37 ° C, 5% CO 2 . Sel-sel dicuci dan plat-plat diterangi selama 1, 2, atau 5 menit. Sel-sel dibiarkan pulih selama 24 jam lebih lanjut, dicuci dalam PBS dan diuji dengan MTT (Gambar 2). Semua langkah eksperimental, terlepas dari iluminasi, dilakukan dalam gelap untuk menghindari fotoaktivasi hypericin yang tidak pantas; piring dibungkus dengan aluminium foil saat berada di inkubator dan lampu mati di kabinet aliran laminar selama kerja sel. Pelat kontrol 'gelap' tidak pernah menyala atau terkena cahaya.

Image

Timeline eksperimental untuk PCI pada sel. Cuci salin PBS dilakukan setelah setiap inkubasi obat untuk memastikan penghapusan obat dari kultur sel.

Gambar ukuran penuh

Percobaan kombinasi

Percobaan kombinasi dilakukan dalam kondisi gelap (lihat Mitoxantrone dan kurva respons dosis hypericin). Sel-sel disepuh dalam pelat 96-sumur selama 24 jam, 37 ° C, 5% CO 2, di mana media titik dikeluarkan dan diganti dengan salah satu dari yang berikut: (1) MTZ sendiri selama 24 jam; (2) MTZ selama 20 jam, diikuti dengan pencucian (2 × PBS) dan inkubasi dengan media yang mengandung MTZ / hypericin selama 4 jam; (3) media segar selama 20 jam diikuti oleh media yang mengandung hypericin selama 4 jam; dan (4) media sendirian di sumur kontrol. Semua sumur non-kombinasi dicuci pada 20 jam dan media yang mengandung agen yang sesuai diganti, untuk mengontrol perubahan media dan agen segar dalam kelompok kombinasi (Gambar 2). Pada akhir inkubasi 24 jam, sel-sel dicuci bersih dan media segar diganti dalam sumur. Pelat diterangi selama 2 menit dengan cahaya biru, Lumisource (output maksimum pada 420 nm 7 mW cm −2 ; PCI Biotech, Oslo, Norwegia) (120 s × 7 mW cm equivalent2 setara dengan 840mJ cm −2 ), dan kemudian diinkubasi selama 24 jam, 37 ° C, 5% CO 2 . Viabilitas dinilai menggunakan MTT. Konsentrasi obat yang digunakan adalah 0, 1 dan 0, 2 μg ml − 1 MTZ, 0, 1 μ M dan hiperisin 0, 2 μM, sendirian, atau dalam kombinasi. Kontrol pelat 'gelap' tidak terpapar cahaya atau menyala. Kontrol pelat 'normal light' tidak tertutup aluminium foil atau disiapkan dalam gelap atau menyala.

Uji MTT

Uji 3- [4, 5-dimethylthiazolyl] -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) digunakan untuk menentukan kelayakan seluler. Kelangsungan hidup sel dihitung dengan menilai aktivitas mitokondria, yaitu pengurangan oleh mitokondria dehidrogenase dari garam tetrazonium hidrofilik menjadi turunan ungu formazan yang tidak larut. Kepadatan yang terakhir ini diukur dengan penyerapan cahaya tampak (570 nm). MTT (1 mg ml − 1 ) ditambahkan ke setiap sumur (100 μl ) dan sel diinkubasi selama 3 jam, 37 ° C, 5% CO 2 (Uehlinger et al, 2000). MTT diganti dengan dimetil sulfoksida (100 μl / well) untuk melarutkan kristal formazan. Absorpsi dibaca pada pembaca plat (MR 700 Dynatech; 570 nm bandpass filter).

Penyerapan seluler hiperisin

Empat garis sel disepuh seperti yang dijelaskan. Setelah inkubasi (24 jam, 37 ° C, 5% CO 2 ), media diganti dan sel diinkubasi selama 20 jam. Pada saat ini medium diganti dengan 1 μM hypericin (100 μl / well) dan diinkubasi ulang selama 4 jam. Hiperisin dicuci, diganti dengan PBS dan fluoresensi hiperisin intraseluler yang diukur menggunakan pembaca fluoresensi (LS50B Perkin-Elmer spektrometer fluoresensi, Beaconsfield, Inggris).

Protokol untuk percobaan pencitraan menggunakan MTZ dan hypericin

Ekspresi Pgp (lihat pewarnaan Immunofluoresensi untuk ekspresi Pgp) dan lokalisasi MTZ dan hiperisin intraseluler diselidiki dengan menumbuhkan sel pada kaca untuk visualisasi mikroskopis. Sel ditanam pada penutup kaca 13 mm dalam pelat 24-sumur (100 000/100 μ l untuk MCF-7, MCF-7 / R dan 50 000/100 μ l untuk MGHU1 / S, MGHU1 / R; 37 ° C, 5% CO 2 ). Setelah menetap selama 24 jam, sel-sel ditunjuk untuk menerima MTZ, hypericin, atau kombinasi keduanya. Waktu inkubasi yang diikuti dijelaskan pada 2.5. Konsentrasi yang digunakan adalah 1 atau 2 μg ml −1 MTZ dan 1 atau 2 μM hiperisin baik tunggal atau dalam kombinasi. Setelah inkubasi obat (24 jam), sel-sel dicuci dan diterangi selama 2-4 menit untuk memastikan fotoaktivasi penuh dan kemudian diganti dalam inkubator selama 1, 4, 16, 20, atau 24 jam. Eksperimen dilakukan dalam kondisi gelap, terlepas dari iluminasi. Sel dilihat hidup untuk memetakan lokalisasi obat intraseluler dengan mendeteksi fluoresensi alami mereka atau mereka ditetapkan untuk Pgp immunofluorescence.

Mikroskopi konfokal untuk MTZ dan lokalisasi hiperisin

Pencitraan digital sel hidup untuk mendeteksi lokalisasi MTZ fluoresen alami dan hiperisin dilakukan menggunakan mikroskop confocal Zeiss (Carl Zeiss Ltd, Welyn Garden City, Inggris) yang dilengkapi dengan lensa objektif perendaman air × 63.

Hiperisin yang sangat berfluoresensi sering menimbulkan 'crosstalk' ketika pencitraan di hadapan pewarna fluoresens lain, misalnya, probe organel seperti lysotracker, menghasilkan pengamatan yang menyesatkan (Theodossiou et al, 2004; Taroni et al, 2005). Oleh karena itu, kami melakukan pemindaian emisi dan eksitasi fluoresensi untuk menentukan eksitasi dan spektrum emisi yang paling ideal untuk setiap obat dengan minimum atau tidak ada tumpang tindih emisi dalam spektrum dua obat saat terdeteksi. Tiga laser diuji (488, 568, dan 633 nm) untuk menggairahkan spesimen dalam semua kombinasi dan perintah bersamaan. Khususnya, ketika sel yang diobati dengan hypericin bersemangat dengan laser 488 nm, puncak emisi utama adalah 595 nm dengan puncak sekunder pada 650 nm, tetapi masih dapat dideteksi pada 690 nm (di mana MTZ dapat dideteksi). Gambar 3 menyoroti efek 'crosstalk' ini dari hypericin. Ketika bersemangat dengan laser 633 nm, tidak ada fluoresensi yang terdeteksi pada 660 nm dan 690 nm. Pada gilirannya, MTZ ditemukan memiliki sinyal kuat di dua saluran, terutama ketika bersemangat dengan 633 nm. Dari dua saluran, 660 nm dan 690 nm, yang terakhir terdeteksi dengan jelas baik MTZ intranuklear maupun intracytoplasmic. Karena itu kami memutuskan untuk mengeluarkan dua obat secara terpisah dengan dua laser yang berbeda; Spesimen terkena laser 488 nm untuk merangsang hiperisin; emisi terdeteksi pada 590 nm. Sel kemudian bersemangat dengan 633 nm laser untuk MTZ dan terdeteksi pada 690 nm. Gambar ditata untuk gambar kombinasi akhir.

Image

Sel diperlakukan dengan hypericin (HYP) dan bersemangat dengan laser 488 nm (16 jam pasca-iluminasi). Deteksi fluoresensi pada ( A ) 590 nm, ( B ) 660 nm dan ( C ) 690 nm. Gambar-gambar tersebut menyoroti sifat HYP yang sangat berfluoresensi dan masalah 'limpahan' yang dihadirkan ketika mencoba mengisolasi pendeteksiannya dalam satu saluran.

Gambar ukuran penuh

Selain itu, lysotracker green DnD-26 (50 n M; Invitrogen Ltd, Paisley, UK) ditambahkan ke beberapa penutup obat hiperisin setengah jam sebelum penerangan dan diinkubasi pada suhu 37 ° C, untuk menyelidiki lokalisasi bersama dalam lisosom. Untuk deteksi, sel-sel bersemangat dengan laser 488 nm (kedua agen); Emisi lysotracker terdeteksi pada 510 nm sementara hypericin terdeteksi pada 590 nm, tanpa crosstalk. Eksperimen dilakukan dengan / tanpa penerangan, dan lysotracker hanya mengendalikan.

Pewarnaan imunofluoresensi untuk ekspresi Pgp

Ekspresi P-glikoprotein terdeteksi oleh imunofluoresensi tidak langsung, menggunakan antibodi anti-Pgp monoklonal anti-manusia tikus (IgG 1 ) dan antibodi sekunder IgG1 anti-tikus kambing (terkonjugasi fluorescein) (Oxford Biotechnology Ltd, Kidlington, Oxon, UK), dideteksi oleh mikroskop fluoresen (Carl Zeiss Ltd, Welyn Garden City, UK).

Sel-sel ditumbuhkan pada penutup bibir 13 mm dan diperlakukan dengan MTZ dan / atau hiperisin seperti yang dijelaskan (2.6). Bibir penutup dicuci dalam PBS, difiksasi dalam aseton: metanol (50: 50) (suhu kamar, 6 menit), dicuci (3 × PBS) dan disimpan (PBS, 4 ° C). Untuk imunofloresensi, coverlips diinkubasi dengan antibodi primer (1: 20 dalam PBS, 1 jam, suhu kamar), dicuci dalam PBS (3 ×), diinkubasi dengan antibodi sekunder (1: 50 dalam PBS, 1 jam, 4 o C, gelap). Setelah pencucian BPS terakhir (3 ×), penutup dibuka ke slide menggunakan citifluor dan disimpan pada suhu 4 ° C dalam gelap, hingga visualisasi di bawah mikroskop.

Metode pemasangan lainnya lebih rendah (aseton 100%, paraformaldehyde, gluteraldehyde).

Penentuan fungsi Pgp

Untuk menyelidiki apakah hypericin merusak fungsi Pgp, kami membandingkannya dengan verapamil, penghambat Pgp yang dikenal. Percobaan percobaan menentukan bahwa, dalam sel MGHU1 / R, 24 jam co-inkubasi MTZ (0, 1 μ g ml − 1 - yang dengan sendirinya membunuh <5% sel resisten) dengan verapamil (0, 1-10 μ M) membalikkan fenotip resisten dalam dosis yang tergantung (peningkatan pembunuhan: <5% untuk 0, 1 μ M verapamil; 18% peningkatan pembunuhan untuk 1 μ M verapamil; 40% untuk 5 μ M; hasil terperinci tidak ditampilkan). Untuk membandingkan efek hypericin pada fungsi Pgp dengan verapamil, kami menggunakan kondisi inkubasi yang tepat dari hypericin dan verapamil yang meningkatkan pembunuhan (yaitu, 0, 1 μM HYP diinkubasi selama 4 jam dan verapamil diinkubasi selama 24 jam) dan menyelidiki perubahan dalam Pgp efflux menggunakan Rhodamine123, agen efflux Pgp standar. Metode kami adalah adaptasi dari metode seminal untuk penilaian eflux Pgp menggunakan flow cytometry yang dijelaskan oleh Wang et al (2000, 2004).

Sel resisten ditanam pada kaca 13 mm seperti di atas selama 48 jam. Pada 24 jam sel menerima verapamil (0, 1, 1, 10 μ M) selama 24 jam atau pada 42 jam sel menerima hiperisin (0, 1 μ M) selama 4 jam lainnya (dihilangkan dengan mencuci, ditambah iluminasi). Sel-sel dicuci dan Rhodamine123 (200 ng ml- 1 dalam medium penuh) 'dimuat' ke dalam sel selama inkubasi 30 menit (37 ° C, 5% CO 2, kelembaban). Sel dicuci segera sebelum visualisasi confocal dan dibiarkan dalam PBS. Rhodamine123 bersemangat pada 488 nm dan sinyal fluoresen dikumpulkan pada 500-550 nm (tidak ada gangguan oleh hypericin crosstalk yang terdeteksi). Gambar diambil setiap 30 detik, selama 20 menit. Penyerapan fluoresensi adalah heterogen dalam sel yang berbeda dengan sinyal selalu terlokalisasi di sitoplasma. Perubahan intensitas sinyal dari waktu ke waktu dihitung untuk setiap sel dengan menggambar daerah sitoplasmik yang menarik (dalam sekitar delapan sel per penutup) dan menghitung persen penurunan intensitas untuk setiap sel setelah 20 menit eflux.

Analisis statistik

Eksperimen agen tunggal dan kombinasi viabilitas diulang 6–12 kali. Data mentah menjalani ANOVA satu arah diikuti oleh analisis post hoc yang sesuai, Tukeys (beberapa perbandingan simultan), atau Dunnets (kurva dosis-respons untuk agen tunggal). Ketika semua cahaya vs semua data gelap dibandingkan (untuk mengidentifikasi perbedaan dalam efek membunuh kombinasi HYP + MTZ yang diterangi dan gelap), data kontrol gelap secara konsisten sedikit lebih rendah daripada data kontrol cahaya (<10%) dan yang sebelumnya dinormalisasi berdasarkan perbedaan cara dari dua kelompok kontrol yang tidak diobati. Analisis dilakukan pada data yang dinormalisasi oleh ANOVA satu arah diikuti oleh beberapa uji perbandingan Bonferroni, yang memperhitungkan ukuran kelompok yang tidak setara. Meskipun data bersifat parametrik dan dianalisis secara statistik, mayoritas digambarkan secara grafis atau dijelaskan dalam persentase, untuk kejelasan. Percobaan confocal diulang minimal delapan kali. Pengukuran conflux eflux pgp juga parametrik, namun serapan fluorescent Rhodamine123 heterogen dan nilai penurunan yang dihasilkan memiliki kisaran yang cukup luas, tidak seperti percobaan yang dilakukan pada 96-well plate. Oleh karena itu, data diserahkan kepada analisis non-parametrik Mann-Whitney.

Hasil

Kurva dosis-respons mitoksantron dan hiperisin

Mitoxantrone

Viabilitas sel dinilai setelah inkubasi MTZ diikuti oleh periode pemulihan 24 jam. Tingkat pembunuhan sekitar 6 dan 28% terdeteksi untuk MGHU1 / R dan 80 dan 89% terdeteksi untuk MGHU1 / S masing-masing untuk 0, 1 dan 0, 2 μg ml −1 MTZ. Dengan 2 μ g ml- 1 MTZ, pembunuhan meningkat menjadi 60% untuk sel-sel resisten dan 95% untuk sel-sel sensitif. Sebaliknya, kedua garis sel MCF7 lebih tahan terhadap MTZ dosis rendah daripada garis sel MGHU1. MTZ pada 0, 1 dan 0, 2 μg ml- 1 membunuh 6 dan 13% MCF-7 / R dan 16 dan 26% dari MCF-7 / S. Dengan 2 μ g ml- 1, MTZ masing-masing membunuh 60 dan 83% sel resisten dan sensitif. Dosis MTZ yang dipilih untuk digunakan pada percobaan kombinasi adalah 0, 1 dan 0, 2 μg ml- 1 ; dengan dosis ini viabilitas sel masih jelas dan oleh karena itu ditambahkan toksisitas lebih lanjut dari hypericin dapat dideteksi.

Hypericin

Sel diinkubasi dengan hypericin selama 4 jam, sebelum iluminasi dengan cahaya biru (1, 2, atau 5 menit); viabilitas sel dinilai 24 jam kemudian. Secara umum, semakin lama durasi cahaya, semakin jelas efek fototoksik hiperisin pada dosis yang lebih rendah: Menggunakan MGHU1 / R sebagai contoh, dengan 1 menit pencahayaan hypericin memiliki efek fototoksik yang jelas dari 0, 4 μM . (viabilitas dikurangi hingga 60% dari kontrol); dengan 2 menit iluminasi hiperisin memiliki efek dari 0, 2 μM (viabilitas dikurangi menjadi 64%); dan dengan 5 menit efek efek hypericin terbukti pada 0, 1 μ M (viabilitas berkurang menjadi 21, 2%).

Secara umum, garis sel orang tua kurang rentan terhadap hiperisin dibandingkan dengan MDR. Gambar 4A dan B menggambarkan toksisitas hiperisin 'gelap' dan teraktivasi cahaya (2 menit) dalam sel MGHU1 / R dan MGHU1 / S. Berbeda dengan pola dalam sel yang peka terhadap obat, sel yang resisten menunjukkan beberapa sitotoksisitas 'gelap' terhadap hiperisin (0, 1 μ M, 0, 2 μ M). Pembunuhan sel rata-rata 13% lebih banyak pada sel-sel MDR yang diterangi dibandingkan dengan kontrol 'gelap' ( P <0, 05), menunjukkan fototoksisitas langsung. Pengamatan menarik dibuat dengan garis sel MCF-7: Baik sel MCF-7R dan MCF-7 / S tampak berkembang biak sebagai respons terhadap hiperisin plus iluminasi ( P <0, 05 terang vs gelap, MCF-7 / S pada 0, 2 μ M HYP; MCF-7 / R pada 0, 1 μ M HYP). Pada dosis yang lebih tinggi, sel-sel menyerah pada efek toksik hiperisin ditambah iluminasi, dengan sel MCF-7 / S yang rentan dari 0, 4 μM (tidak ditampilkan) dan MCF-7 / R dari 0, 2 μM hiperisin. Mirip dengan MGHU1 / R, MCF-7 / R menunjukkan beberapa sitotoksisitas gelap (Gambar 4C dan D). Perbedaan yang diamati antara empat garis sel tampaknya independen dari tingkat serapan hiperisin seperti yang ditunjukkan pada tingkat fluoresensi yang dipancarkan pada 605 nm. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam pengambilan hiperisin awal, dengan rata-rata 3, 6-3, 9 (dipancarkan fluoresensi) di semua empat baris sel.

Image

Sel-sel kanker kandung kemih ( A ) MGHU1 / S dan ( B ) MGHU1 / R dan sel-sel kanker payudara ( C ) MCF-7 / S dan ( D ) MCF-7 / R diinkubasi dengan hypericin (HYP, 0, 1 μ M -0, 2 μ M) selama 4 jam, kelompok yang dicuci dan percobaan diterangi selama 2 menit dengan cahaya biru sementara kontrol gelap tidak terkena cahaya. Sel dibiarkan pulih selama 24 jam lebih lanjut dan menjadi sasaran uji MTT. Absorbansi pada 570 nm sesuai dengan viabilitas dan dinyatakan sebagai persentase absorbansi oleh sel yang tidak diobati (sumbu y ). P <0, 05 untuk: MGHU1 / R terang vs gelap, 0, 2 μM HYP; MCF-7 / S terang vs gelap, 0, 2 μ M HYP; Lampu MCF-7 / S vs gelap, 0, 1 μ M HYP.

Gambar ukuran penuh

Dosis hypericin yang dipilih untuk digunakan dalam percobaan kombinasi adalah 0, 1 dan 0, 2 μM . Pada konsentrasi ini, efek membunuh (dengan atau tanpa iluminasi) minimal atau tidak ada, sehingga dimungkinkan untuk menentukan apakah hypericin memiliki efek aditif dan / atau sinergis ketika dikombinasikan dengan MTZ. Durasi iluminasi yang dipilih untuk percobaan kombinasi adalah 2 menit, yang merupakan kompromi antara tingkat minimal sitotoksisitas dalam garis sel MGHU1 dan mengurangi fenomena proliferasi sel, pada dosis yang lebih rendah, pada garis sel MCF-7.

Efek kombinasi mitoxantrone dan hypericin pada viabilitas sel

Sel diinkubasi dengan MTZ selama 20 jam, kemudian kombinasi hiperisin dan MTZ (4 jam), sebelum diterangi (2 menit). Viabilitas dinilai 24 jam kemudian.

Sel MGHU1 / R menunjukkan peningkatan pembunuhan ketika terpapar dengan kombinasi hypericin + MTZ, dibandingkan dengan hypericin atau MTZ saja (Gambar 5A). Ada penurunan 38, 65 dan 36, 63% dalam viabilitas sel sel MGHU1 / R ketika terpapar dengan hypericin (0, 1 μ M) + MTZ (0, 1 μ g ml- 1 ) kombinasi, dibandingkan dengan hypericin (PDT) atau MTZ saja ( P <0, 05 ), masing-masing (Gambar 5A). Ada juga penurunan yang signifikan dalam viabilitas sel (sebesar 34%) dari sel-sel MGHU1 / R ketika terkena hiperisin (0, 2 μ M) + kombinasi MTZ (0, 1 μ g ml- 1 ), dibandingkan dengan MTZ saja ( P <0, 05) ( Gambar 5A). Demikian pula, sel MCF-7 / R menunjukkan peningkatan pembunuhan yang signifikan (80, 20%, P <0, 001; 46, 10%, P <0, 001) dengan kombinasi hypericin (0, 1 μ M) + MTZ (0, 1 μ g ml − 1 ), dibandingkan dengan hypericin atau MTZ sendiri, masing-masing. Sel MCF-7 / R juga menunjukkan peningkatan pembunuhan sel yang signifikan, penurunan 37, 60% dalam viabilitas sel ( P <0, 01) (Gambar 5B), dengan kombinasi hypericin (0, 2 μ M) + MTZ (0, 1 μ g ml −1 ) dibandingkan dengan MTZ sendiri.

Image

Sel-sel kanker kandung kemih ( A ) MGHU1 / S dan MGHU1 / R dan sel-sel kanker payudara ( B ) MCF-7 / S dan MCF-7 / R diinkubasi dengan hypericin saja (HYP, 0, 1 atau 0, 2 μM) selama 4 jam atau dengan mitoxantrone (MTZ, 0, 1 atau 0, 2 μ g ml − 1 ) sendiri selama 24 jam atau dengan mitoxantrone (0, 1 atau 0, 2 μ g ml − 1 ) selama 20 jam, diikuti oleh inkubasi 4 jam dengan mitoxantrone + hypericin (MTZ 0, 1 atau 0, 2 g) ml −1 + HYP 0, 1 μ M atau 0, 2 μ M) dan menyala (2 menit) dengan cahaya biru (pada kelompok kombinasi, angka pertama menunjukkan konsentrasi HYP; angka kedua menunjukkan konsentrasi MTZ). Sel dibiarkan pulih selama 24 jam lebih lanjut dan menjadi sasaran uji MTT. Absorbansi pada 570 nm sesuai dengan viabilitas dan dinyatakan sebagai persentase absorbansi oleh sel yang tidak diobati (sumbu y ). * 38, 65%, 36, 63% peningkatan pembunuhan vs hiperisin atau MTZ saja, masing-masing, P <0, 05; ** 34% peningkatan pembunuhan vs MTZ saja, P <0, 05; *** 80, 2, 46, 1% peningkatan pembunuhan vs hiperisin atau MTZ saja, masing-masing, P <0, 001; **** 37, 6% peningkatan pembunuhan vs MTZ saja, P <0, 01.

Gambar ukuran penuh

Pelat kontrol gelap dijalankan secara bersamaan untuk menyelidiki efek iluminasi terhadap viabilitas ketika sel diperlakukan dengan hiperisin dan MTZ. Hasilnya disajikan dalam grafik komposit (Gambar 6). Sel MGHU1 / R yang terpapar kombinasi hiperisin dan MTZ (0, 1 μ M +0.1 μ g ml −1 ) dan diterangi menunjukkan pembunuhan yang secara signifikan lebih banyak daripada rekan-rekan gelap mereka (28, 15%, P <0, 05). Meskipun ada juga perbedaan antara terang dan gelap pada dua kombinasi obat lain, mereka tidak cukup mencapai signifikansi. Hasil serupa ditemukan untuk sel MCF-7 / R (tidak ditampilkan).

Image

Viabilitas sel kanker kandung kemih MDR dalam kondisi terang dan gelap. Sel diinkubasi dengan hypericin saja (HYP, 0, 1 atau 0, 2 μ M) selama 4 jam atau dengan mitoxantrone saja (MTZ, 0, 1 atau 0, 2 μg ml- 1 ) selama 24 jam atau dengan mitoxantrone (0, 1 atau 0, 2 μg ml- 1 ) for 20 h, followed by 4 h incubation with mitoxantrone+hypericin (MTZ 0.1 or 0.2 μ g ml −1 +HYP 0.1 μ M or 0.2 μ M ) and illuminated (2 min) with blue light (on the combination groups, the first number denotes the HYP concentration; the second number denotes the MTZ concentration). Parallel experiments were conducted in the dark. Cells were allowed to recover for a further 24 h and were subjected to the MTT assay. Absorbance at 570 nm corresponds to viability and was expressed as a percentage of absorbance by untreated cells ( y axis). Statistical significance presented only for dark vs light combinations. * 28.15% increased killing light vs dark, P <0.05.

Gambar ukuran penuh

Intracellular imaging of mitoxantrone and hypericin

Cells were incubated with drugs either alone or in combination for the desired time and illuminated. Cells were left to recover for different time points (from 1 to 24 h) and typical images are presented here. Throughout all imaging experiments hypericin was localised only to the cytoplasm, whereas MTZ was also found in the nucleus of sensitive cells or some illuminated MDR cells. Where co-localisation was observed, the two agents often appeared to co-exist as cytoplasmic vesicles. Early after illumination (1 h), all cell lines showed some cytoplasmic co-localisation of hypericin and MTZ, as illustrated in Figure 7. At this time, both drug-sensitive cell lines showed clear nuclear localisation of MTZ as expected; illumination does not alter this pattern (Figure 7A). At the same time MDR cell lines, which were not illuminated (dark controls), showed no nuclear MTZ localisation, which is typical of Pgp-overexpressing cells (Figure 7B). Interestingly, the pattern of green fluorescence changed when resistant cells were illuminated, with MTZ appearing to re-localise nearer to or within the nucleus of some, but not all, cells. Hypericin localisation, which was evident throughout the cytoplasm, did not appear to change on illumination (Figure 7C). Parallel experiments where MDR cells were treated with MTZ alone (and illuminated) did not show any nuclear drug localisation (image not shown).

Image

( A ) MGHU1/S cells (low magnification), ( B ) and ( C ) MGHU1/R cells treated with 2 μ g ml −1 MTZ for 20 h followed by 4 h of incubation with 2 μ g ml −1 MTZ+2 μ M HYP. Specimens ( A ) and ( C ) were illuminated for 2 min, specimen ( B ) is a dark control. Images were taken at 1 h post-illumination. The white arrows indicate nuclear MTZ in the MGHU1/S cell line. The red arrows show the nuclei of MGHU1/R cells (dark control) with no nuclear MTZ localisation. The blue arrows show nuclear MTZ in some MGHU1/R cells (illuminated). (MTZ=green; HYP=red; co-localisation=yellow).

Gambar ukuran penuh

Figure 8 shows MCF-7 cell lines treated with both drugs, 4 h after illumination. Again there was clear nuclear MTZ localisation in MCF-7/S cells, as expected (Figure 8A). In the equivalent illuminated MCF-7/R cells (Figure 8B) there was MTZ present in the nucleus of some cells. There was clearer co-localisation of the drugs compared to the sensitive cells. At 16 h post-illumination, the intranuclear MTZ fluorescence increased in some MDR cells, with a striking example of MCF-7/R cells shown in Figure 8C. The same patterns of drug and photosensitiser localisation over time were seen for MGHU1 cell lines.

Image

Cells were treated with 2 μ g ml −1 MTZ for 20 h followed by 4 h of incubation with 2 μ g ml −1 MTZ+2 μ M HYP. Specimens were then illuminated for 2 min. Images were taken post-illumination at 4 h for ( A ) MCF-7/S and ( B ) MCF-7/R; at 16 h for ( C ) MCF-7/R; at 24 h for ( D ) MGHU1/S and ( E ) MGHU1/R. The white arrow ( A ) shows nuclear MTZ in an MCF-7/S cell. The blue arrows show nuclear localisation in MCF-7/R cells at 4 h ( B ) and 16 h ( C ) post-illumination. At 24 h ( D, E ) MGHU1/R cells appear to have more red fluorescence than MGHU1/S cells. (MTZ=green; HYP=red; co-localisation=yellow).

Gambar ukuran penuh

Images at 24 h post-illumination showed more sparsely distributed cultures with cells appearing stressed, especially sensitive cells. Figure 8D is an image of MGHU1/S cells. Here there was lack of significant localisation of MTZ to the nucleus. This is not surprising, given that the majority of cells in these cultures would have been successfully assaulted by treatment and had already died. The remaining cells imaged here must have evaded MTZ-mediated killing. The equivalent MGHU1/R cells (Figure 8E) show increased hypericin retention compared to the parental cells and this is a recurrent feature for resistant cells by 24 h.

Co-incubation experiments with lysotracker green DND-26 showed some localisation between hypericin and lysotracker in cytoplasmic vesicles (lysosomes, Figure 9). Illumination resulted in some relocalisation of both lysotracker and hypericin (time lapse observation 10 min for lysotracker (signal bleached), 20 min for hypericin), without the signal disappearing dramatically or dispersing.

Image

MGHU1/R cells treated with HYP 2 μ M according to the described timeline. Lysotracker green DND-26 (50 n M ) was added for half an hour (end of incubation) (dark experiment). ( A ) hypericin signal, ( B ) lysotracker green DND-26, ( C ) overlay, showing co-localisation. White arrows point out examples of areas of co-localisation. (hypericin=red, Lysotracker green DND-26=green, co-localisation=yellow).

Gambar ukuran penuh

Pgp expression on the addition of hypericin and mitoxantrone

We used indirect immunofluorescence to investigate any changes in Pgp expression upon the addition of the drugs, either alone or in combination, over a 24 h period. Overall, Pgp immunoflorescence showed no difference in protein expression, in either illuminated specimens or in dark controls when imaged at a variety of time intervals up to and including 24 h post-illumination. Figure 10 shows the results of Pgp staining on the MGHU1/R cell line treated with (1) hypericin, (2) MTZ, and (3) both agents. Visually, the Pgp immunofluorescence is very similar, regardless of drug exposure. Results for MCF-7/R were similar (not shown). Furthermore, there was no apparent difference in Pgp expression between dark or illuminated slides, at any time post-incubation either (Figure 10D and E). Immunofluorescence of the sensitive parental cell lines showed virtually no Pgp expression and therefore no further drug incubation experiments were carried out in these cell lines.

Image

MGHU1/R cells treated with ( A, D, E ) 2 μ M HYP, ( B ) 2 μ g ml −1 MTZ and ( C ) 2 μ g ml −1 MTZ+2 μ M HYP, according to the described timeline. Cells ( A, B, C ) were illuminated for 2 min and the experiment was terminated 4 h post-illumination. To determine the effect of light, cells were either illuminated for 2 min ( E ) or were kept as dark controls ( D ) and the experiment terminated at 24 h. P-glycoprotein, detected by indirect immunofluorescence (white), is situated mostly in the cellular membrane.

Gambar ukuran penuh

Pgp function

The integrity of Pgp function was investigated by measuring Pgp-mediated Rhodamine123 efflux over 20 min on confocal microscopy, after the resistant cells were pre-incubated either with hypericin or increasing concentrations of verapamil, the classical Pgp inhibitor. Hypericin pre-incubated cells lost 74% of fluorescent Rhodamine123 signal after 20 min of efflux compared to initial amounts taken up (Table 1). This was similar to control untreated cells, which lost 72.4%. In contrast, verapamil pre-incubated cells lost fluorescence in a dose-related manner: the cells which received the smallest verapamil concentration (0.1 μ M ) lost 35.4% of signal, for 1.0 μ M verapamil the decrease was 20%, while for 10 μ M verapamil the decrease was 13.5%. For the latter group, the range (−14.8 to 25.9) indicates that during general efflux some cells were taking up and retaining Rhodamine123, which was present in their immediate environment, presumably effluxed by neighbouring cells. Per cent decrease values for all verapamil doses were significantly different from controls ( P <0.01, Mann–Whitney).

Tabel ukuran penuh

Diskusi

Hypericin-induced photodynamic therapy

The first aim of this study was to determine the doses and duration of illumination at which hypericin (PDT) resulted in minimal or no killing for both resistant cell lines. Previous PDT studies on the effect of hypericin on cultured fibroblasts or murine keratinocytes have shown concentration- and light-dependent phototoxicity starting at 1.25 or 5 μ M, depending on cell type. The main line of investigation of the light dependency of hypericin-induced PDT on murine keratinocytes had centred on varying doses (joules) of light (0.1–10 J cm −2 ) (Yu et al, 1996; Theodossiou et al, 2004). We observed the effect of a concentration range of hypericin (0.1–1.0 μ M ) over light exposure of 1, 2, or 5 min. Generally, the paternal drug-sensitive cell lines were more resistant to hypericin than their MDR counterparts. A concentration- and light duration-dependent cell killing of the MGHU1 cell lines was observed, with longer exposure and higher concentrations resulting in higher toxicity, in line with previous work in the field (Adreoni et al, 1994; Yu et al, 1996; Kamuhabwa et al, 2004; Theodossiou et al, 2004). Hypericin at 0.2 μ M was the lowest concentration at our chosen duration of illumination (2 min), which resulted in significant cytotoxicity in MGHU1/R cells, but this dose did not affect MGHU1/S growth.

The MCF-7 cell lines, exhibited a more complex response, succumbing to phototoxic effects at higher hypericin doses (from 0.4 μ M for sensitive cells and from 0.2 μ M for resistant cells, 2 min illumination), but exhibiting apparent proliferation at lower doses. Previous reports show that, in response to physical or chemical stress, cells can activate signalling pathways, including the mitogen-activated protein kinase (MAPK) and phosphotidylinositol-3-kinase pathways (Oleinick and Evans, 1998; Moor, 2000; Agostinis et al, 2002). Specifically in HeLa cells photosensitisation with hypericin resulted in the rapid and sustained activation of Jun N-terminal kinase-1 and MAPK (Assefa et al, 1999). These molecules are capable of propagating a proliferation signal and this may be the mechanism triggered in the MCF-7 cell lines in response to low-dose hypericin photosensitisation. The differences observed between the four cell lines appear to be independent of the level of hypericin uptake as shown the level of fluorescence emitted at 605 nm. There was no significant difference in initial hypericin uptake, with an average fluorescence intensity of 3.6–3.9 (arbitrary units) across all four cell lines.

Photochemical internalisation

The potentiating effects of PCI have previously been demonstrated in vitro (Engesaeter et al, 2006) and in vivo (Selbo et al, 2001; Dietz et al, 2005) and these results have been reviewed by Høgset (Høgset et al, 2004). While most studies have been carried out using amphiphilic photosensitisers (eg, TPPS 2a ) PCI has also been demonstrated using a membrane localising sensitiser, ALA-induced photoporphyrin IX. Selbo et al, 2001 administered the photosensitiser aluminium disulphonated phthalocyanine by intraperitoneal injection into athymic mice, followed (48 h later) by a single intratumoural injection of the protein toxin gelonin. The findings indicated that the photosensitiser could become localised in endosomes, in vivo , within the tumour cells and that upon illumination it could be relocalised to the cytoplasm. Furthermore, the treatment regime demonstrated that PCI of gelonin significantly potentiated its inhibition of tumour growth: 67% of mice administered PCI treatment became completely tumour free, compared to 10% of those treated with PDT alone, and none of those treated with gelonin alone.

In this study, illumination of MDR cancer cells which had been pre-incubated with a combination of the photosensitiser hypericin and the chemotherapeutic MTZ resulted in increased killing compared to unilluminated dark controls. The effect was pronounced at low concentrations of the two agents, 0.1 μ M hypericin and 0.1 μ g ml −1 MTZ, using a 2 min illumination period. These particular concentrations of hypericin and MTZ were not significantly cytotoxic when cells were exposed to each agent alone (with or without light); on the contrary hypericin, when photoactivated, appeared to stimulate MCF-7/R proliferation. Furthermore, under light conditions (Figure 5A and B), there was a 38.65% increase in killing of MGHU1/R cells when the drugs were combined and illuminated compared to cells that received PDT alone (ie, hypericin plus illumination) and a 36.63% increase compared to MTZ alone. A similar pattern was observed in MCF-7/R cells. These findings are consistent with PCI. Consequently, by potentiating the cytotoxicity of MTZ, hypericin plus illumination appear to circumvent the MDR phenotype; since hypericin by itself at the doses used does not affect cellular viability, the combined effect is probably due to synergism. Furthermore, hypericin potentiated the killing activity of MTZ on the sensitive cell lines but this was minimal and not significant. Similarly, Canti et al (1998) demonstrated that when antiblastic drugs, ADR and cisplatinum (CDDP) were combined with the photosensitiser aluminium disulphonated phthalocyanine it resulted in a significant additive effect on the killing of murine leukaemia and lymphoma lines, compared to ADR or CDDP alone.

Confocal imaging experiments explored the intracellular localisation of the two agents. The findings indicate that hypericin and MTZ colocalised in cytoplasmic vesicles of both sensitive and MDR cells both prior and following illumination. MTZ was present in the nucleus of sensitive cells, as expected, at all experimental end-times apart from those cells that survived the cytotoxic insult at 24 h. MDR cells when not illuminated excluded MTZ from the nucleus (in the presence or absence of hypericin). However, when illuminated in the presence of hypericin, some MTZ became nuclear (4 and 16 h post-illumination) and this was apparent in a proportion of cells. Hypericin was cytoplasmic throughout and appeared to be retained better by resistant cells compared to sensitive cells at 24 h (compared to the initial uptake of hypericin which appeared equivalent in all cell lines, as determined by fluorescent plate reading). The distribution of hypericin was similar for dark and illuminated cells in our experiments. Furthermore, as reported in previous work by colleagues, we showed hypericin partly co-localising with lysotracker green DND-26, a marker known to bind to acidic membranes (eg, lysosomal vesicles) (Theodossiou et al, 2004). This work is supplemented by another study which highlighted that the presence of serum during hypericin incubation favours endocytic uptake (Siboni et al, 2002). We also showed co-localisation between hypericin and MTZ, the latter may be taken up by endocytosis and is retained inpart by lysosomes. Furthermore, following illumination, part of the MTZ fluorescence appears to move towards and into the nucleus of resistant cells. This suggests that co-localisation takes place in endolysosomal compartments and that illumination liberates MTZ, consequently facilitating the drug reaching its nuclear target. Since MTZ is a weak base, then liberation from an acidic vesicle, such as a lysosome (where MTZ is 'ion-trapped') would increase the availability of this drug to intracellular targets (Mahoney et al, 2003). The fact that the hypericin signal did not undergo major changes upon illumination is not surprising since in an effort to detect clear fluorescent signals the amounts used for our confocal experiments were 10-fold greater than those used for the cell viability experiments. Consequently, hypericin was detected throughout the cell cytoplasm. Lou et al (2006) also showed nuclear localisation of MTZ in MDR cells, however the underlying mechanisms differ in that the photosensitiser (plus illumination) was administered before chemotherapeutic insult. The latter probably resulted in the destruction of endosomes and therefore their unavailability to transport chemotherapeutic drug (Prasmickaite et al, 2002).

Whether increased killing effects were the result of changes in Pgp efflux pump expression or function due to the addition of hypericin was also investigated. The addition of either agent by itself or in combination (+/− illumination) resulted in no changes in Pgp expression by MDR cell lines, as shown by immunofluorescent staining. Efflux of Rhodamine123 via Pgp pumps was detected by confocal microscopy. The method we used was based on the seminal work by Wang et al (2000) where the authors presented a flow cytometric method for investigating inhibition of Pgp efflux. In our work, cells which were pre-incubated with 0.1 μ M hypericin (plus illumination) did not interfere with Rhodamine123 efflux, unlike cells pre-incubated with verapamil (0.1 to 10 μ M ). Doses for both agents were those that resulted in increased killing in 'drug-combination' experiments, therefore the amounts of both agents were pharmacologically active in our model system. The concentrations of agents used are of prime consideration since previous reports have presented superficially conflicting results on the action of St John's Wort constituents (hyperforin and hypericin) on Pgp expression and function. St John's Wort may alter the expression of various membrane pumps and result in decreased bioavailability of a variety of drugs. Hypericin at a concentration of 10 μ M induced mRNA expression of the Pgp gene MRD1 in the human colorectal carcinoma line LS180 (Gutmann et al, 2006). In contrast, Tian et al (2005) reported that only hyperforin and not hypericin (at 0.1 μ M, 24–48 h treatment) caused a time-/dose-dependent induction of Pgp protein by the same cell line. Furthermore, hypericin at the same concentration did not interfere with either digoxin efflux or Pgp-mediated transcellular transport of digoxin. However, Wang and his colleagues (2004) demonstrated that hypericin inhibited Pgp-mediated efflux at high concentrations (10 μ M ).

The present study demonstrates that the cytotoxic efficacy of MTZ, against MDR cancer cell lines is increased when in combination with hypericin under illuminated (light) compared to dark conditions. Our experiments indicate that the two drugs do co-localise within the cytoplasm and that upon illumination some MTZ is mobilised to the nucleus. These observations appear to be independent of any effect on Pgp expression and/or function and are not mirrored under dark conditions. Taken collectively the findings of this study are consistent with PCI. PCI has the potential to have a wide impact in clinical practice, including (1) reducing the systemic side effects of anti-cancer cytotoxic agents, for two reasons, first by reducing the dose of drug required for a given killing effect and second by conferring an increased level of treatment selectivity as the cytotoxic effect will be greatest in areas that are illuminated and minimised systemically; (2) widening the therapeutic index of anti-cancer agents giving clinicians and patients a wider scope of drug dosing and effect; (3) reversing MDR, thus overcoming the major limiting factor in conventional anti-cancer chemotherapy regimens; and (4) providing a potential delivery mechanism for gene therapy (Høgset et al, 2004; Engesaeter et al, 2006). Thus this potentially versatile technique may provide a driving force for improving the delivery mechanisms in many drug-mediated treatment regimens.

Ubah Sejarah