Represi ekspresi shp-1 oleh p53 menyebabkan fosforilasi tirosin trka dan penekanan proliferasi sel kanker payudara | onkogen

Represi ekspresi shp-1 oleh p53 menyebabkan fosforilasi tirosin trka dan penekanan proliferasi sel kanker payudara | onkogen

Anonim

Abstrak

Reseptor faktor pertumbuhan saraf (NGF), trkA, penekan tumor p53 dan fosfatase SHP-1 sangat penting dalam proliferasi dan diferensiasi sel. SHP-1 adalah trkA fosfatase yang mendeposforilasi trkA di tirosin (Y) 674 dan 675. p53 dapat menginduksi aktivasi trkA dan fosforilasi tirosin tanpa adanya stimulasi NGF. Pada kanker payudara tumor ekspresi trkA dikaitkan dengan peningkatan kelangsungan hidup pasien. Ekspresi protein TrkA lebih tinggi pada garis sel kanker payudara daripada pada epitel payudara normal. Dalam garis sel (tetapi tidak dalam epitel payudara normal) trkA fungsional dan dapat distimulasi NGF untuk meningkatkan proliferasi sel. Studi ini menyelidiki hubungan fungsional antara trkA, p53 dan SHP-1 pada kanker payudara, dan mengungkapkan bahwa pada tipe liar (wt) trkA mengekspresikan sel-sel kanker payudara baik wtp53 endogen, diaktifkan oleh agen terapeutik, dan ekspresi penindasan wtp53 yang ditransfusikan dari SHP-1 melalui urutan CCAAT proksimal dari promotor SHP-1-P1 dan faktor transkripsi NF-Y. Dalam sel-sel ini, fosforilasi trkA-Y674 / Y675 terdeteksi ketika kadar protein SHP-1 menurun dengan cara yang bergantung pada wtp53. Proliferasi dan tes siklus sel, dengan sel mengekspresikan wt-trkA endogen atau transfected dan p53 yang peka terhadap suhu tumbuh pada 32 ° C (ketika p53 dalam konfigurasi wt), menunjukkan proliferasi sel yang ditekan. Penindasan tidak terdeteksi ketika tumbuh pada 37 ° C (ketika p53 dalam konfigurasi mutan). Sebuah pelepasan dari penekanan diamati ketika sel-sel ini ditransfusikan secara sementara dengan wt-SHP-1 dan tumbuh pada suhu 32 ° C. Penindasan juga terdeteksi ketika, sebagai kontrol, sel yang mengekspresikan wt-trkA secara transien ditransfeksi dengan SHP-1-siRNA, tetapi tidak ketika trkA mutan dominan-negatif (DN) digunakan untuk menghapus aktivitas wt-trkA. Yang penting, penekanan tidak terlihat dengan mengontrol sel-sel kanker payudara negatif trkA (mengekspresikan wtp53, wt-SHP-1 dan trkA tidak terdeteksi), ditransfeksi dengan Y674F / Y675F mutan-trkA. Eksperimen-penggabungan BrdU mengungkapkan kurangnya penggabungan dalam sel-sel yang mengekspresikan wt-trkA dan wtp53, atau wt-trkA dan SHP-1-siRNA. Namun, BrdU tergabung dalam kehadiran Y674F / Y675F mutan trkA atau DN mutan trkA. Hasil ini menunjukkan bahwa represi p53 terhadap ekspresi SHP-1 mengarah pada fosforilasi trkA-Y674 / Y675 dan penindasan yang bergantung pada trkA terhadap proliferasi sel kanker payudara. Data ini memberikan penjelasan mengapa tingkat trkA tinggi dikaitkan dengan prognosis yang menguntungkan.

pengantar

Reseptor faktor pertumbuhan saraf (NGF), trkA, dan penekan tumor p53 penting dalam kelangsungan hidup, diferensiasi dan proliferasi sel epitel payudara neoplastik dan non-neoplastik. Stimulasi NGF dari trkA mendorong aktivasi trkA dan fosforilasi tirosin (Reichardt, 2006). Fosforilasi tyrosines 490 (Y490) dan 785 (Y785) memulai pensinyalan yang mempromosikan kelangsungan hidup, proliferasi atau diferensiasi dengan cara yang spesifik jaringan (Kaplan dan Miller, 2000; Reichardt, 2006). p75, reseptor NGF afinitas rendah, berinteraksi dengan trkA untuk membentuk reseptor pengikat NGF afinitas tinggi (Gentry et al., 2004). Analisis trkA, p75 dan NGF dalam karsinoma payudara manusia menunjukkan ekspresi trkA dan p75 yang terkait dengan peningkatan kelangsungan hidup, sedangkan tumor yang mengekspresikan NGF dan kadar p75 yang rendah memiliki prognosis yang buruk (Sakamoto et al., 2001; Descamps et al., 2001a; Reis-Filho et al., 2006). Ekspresi protein trkA lebih tinggi pada garis sel kanker payudara dibandingkan pada epitel payudara normal. Dalam garis sel kanker payudara (tetapi tidak pada epitel payudara normal) trkA fungsional dan dapat distimulasi NGF untuk meningkatkan proliferasi (Descamps et al., 1998, 2001b).

p53 adalah anggota keluarga gen terkait ( p73 dan p63 ) yang memiliki fungsi yang sama (Moll dan Slade, 2004). p53 menginduksi penekanan tumor dengan mengaktifkan transkripsi atau menekan ekspresi gen dengan mengikat faktor transkripsi seperti NF-Y (Ho dan Benchimol, 2003; Imbriano et al., 2005). p53 memiliki sinyal lokalisasi dan eksklusi nuklir, dan menunjukkan lokalisasi nuklir atau sitoplasma (Shaulsky et al., 1991; Stommel et al., 1999). Meskipun kejadian mutasi p53 pada kanker payudara adalah 20-30% (Feki dan Irminger-Finger, 2004; Olivier et al., 2004), tumor payudara dan garis sel menunjukkan tipe liar yang terdeteksi (wt) p53 yang terletak istimewa di sitoplasma, menunjukkan bahwa sekuestrasi sitoplasma membatalkan aktivitas penekan tumornya (Moll et al., 1992, 1996).

Kami telah menunjukkan bahwa p53 terlibat dalam transduksi sinyal trkA. Pada PC12 sel p53 eksogen atau endogen dapat mengikat trkA. asosiasi trkA dan p53 hanya terjadi di hadapan tirosin kinase non-reseptor, c-abl (Montano, 1997; Brown et al., 2000; Browes et al., 2001). P53 terekspresi menginduksi aktivasi trkA dan fosforilasi tirosin bersama dengan kelangsungan hidup dan diferensiasi sel PC12 yang mengekspresikan trkA ketika tumbuh tanpa NGF, menunjukkan bahwa asosiasi p53 dan trkA, dan aktivasi trkA bergantung p53 dan fosforilasi tirosin meningkatkan sinyal yang mengarah ke diferensiasi sel PC12 di tidak adanya NGF (Montano, 1997; Brown et al., 2000).

Pemeliharaan homoeostasis fosforilasi tirosin diatur oleh protein tirosin kinase dan fosfatase. Fosfatase SHP-1 terutama merupakan protein sitosol, dan ekspresinya dalam sel hematopoietik dapat secara negatif mengatur pensinyalan dari reseptor seperti CSF-1, dengan defosforilasi tirosin dari reseptor target atau protein terkait-tyrosine-terfosforilasi terkait protein (Neel et al., 2003). SHP-1 juga dinyatakan dalam sel epitel normal dan ganas non-hematopoietik (Yip et al., 2000), sistem saraf (Horvat et al., 2001) dan sel PC12 (Vambutas et al., 1995).

SHP-1 adalah trkA fosfatase yang berikatan dengan trkA melalui Y490, dan mendeposforilasi tirosin 674 (Y674) dan 675 (Y675) dari loop aktivasi (Marsh et al., 2003). Fosforilasi Y674 / Y675 sangat penting untuk pengaturan aktivitas katalitik trkA dan transfosforilasi Y785 dan Y490 (Cunningham et al., 1997). Selain itu, SHP-1 berinteraksi dengan onkogen menyatu tiroid-TRK, TRK-T3 (Roccato et al., 2005).

Makalah ini melaporkan bahwa sel-sel kanker payudara yang mengekspresikan wt-trkA endogen atau transfected, wtp53 endogen yang diaktivasi oleh agen kemoterapi atau transfeksi wtp53 yang tertekan menekan ekspresi SHP-1 dan mempromosikan fosforilasi trkA-Y674 / Y675. Yang penting, ekspresi wt-trkA (tetapi tidak Y674F / Y675F mutan trkA) dan wtp53- SHP-1 -expression yang mengarah pada penangkapan siklus sel kanker payudara menunjukkan fungsi penting untuk wt-trkA dalam acara ini.

Hasil

Represi ekspresi melalui SHP-1-P1 oleh wtp53

Gen SHP-1 manusia memiliki dua promotor untuk transkripsi spesifik jaringan. Promotor P1 (SHP-1-P1) aktif dalam sel non-hematopoietik (Banville et al., 1995; Xu et al., 2001). SHP-1-P1 mengandung sekuens konsensus CCAAT proksimal (P) dan distal (D) yang diakui oleh faktor transkripsi NF-Y (Xu et al., 2001). Promotor yang mengandung CCAAT ditekan oleh p53 hingga NF-Y (Imbriano et al., 2005). Karena garis sel kanker payudara mengekspresikan sitosol SHP-1 (Yip et al., 2000), trkA tirosin fosforilasi yang diinduksi oleh ekspresi SHP-1 p53-tertekan oleh SHP-1-P1 diselidiki.

SHP-1-P1 (nukleotida −469 hingga +1) dari sel MCF7 dikloning ke pGL2 untuk mendapatkan reporter luciferase SHP-1-P1 (pSHP-1-P1-lu). Sel MCF7 yang mengekspresikan sel wtp53 dan wt-trkA endogen, dan sel Saos2 (garis sel osteosarkoma tanpa ekspresi trkA dan p53), ditransfusikan secara transien secara transien dengan pSHP-1-P1-lu dan wtp53. Hasil menunjukkan 30, 3 - dan 13, 9 kali lipat represi aktivitas luciferase oleh wtp53, masing-masing, bila dibandingkan dengan transeksi pSHP-1-P1 saja (Gambar 1A1–2). Kontrol ko-transfeksi dengan pSHP-1-P1-lu dan p53-R273H atau p53-R175H mutan, dan transfeksi sel MCF7 yang mengekspresikan p53-DD mutan dominan-negatif (DN) (Shaulian et al., 1992) dengan pSHP- 1-P1-lu menunjukkan represi rendah (Gambar 1A1–2). Hasil serupa diperoleh dengan co-transeksi pSHP-1-P1-lu dan pCMV (data tidak ditampilkan). Perbandingan antara pSHP-1-P1-lu dan wtp53 dengan pSHP-1-P1-lu dan ko-transeksi p53 mutan, dan transeksi dengan SHP-1-P1 saja, menunjukkan represi tergantung wtp53 yang sangat tinggi ( t -test, p <0, 001). Temuan bahwa represi lebih tinggi pada MCF7 daripada sel Saos2 mungkin karena efek aditif wtp53 endogen dan transfected.

Image

( A ) Represi ekspresi luciferase yang digerakkan oleh SHP-1-P1 oleh wtp53. Sel MCF7 atau Saos2 ditransfusikan secara transien dengan 1, 5 μg pSHP-1-P1-lu, pGL2, pG13-lu, pM15-lu atau pCDC2-P-lu atau co-transfected dengan 1, 5 μg pSHP-1-P1-lu, pGL2, vektor pG13-lu, pM15-lu atau pCDC2-P-lu dan 2 μg pCMV-wtp53-, p53-R175H- atau p53-R273H yang mengandung. Sel-sel MCF7 yang mengekspresikan sel-sel p53-DD atau MCF7-trkA-tsp53 transien secara transien dengan 1, 5 pGHP-1-P1-lu. Untuk semua transeksi 0, 3 μg dari vektor yang mengandung Renilla digunakan sebagai kontrol internal. Sel ditanam selama 48 jam pada 32 ° C (32) atau 37 ° C (37) dan lisat diuji untuk ekspresi luciferase. Aktivitas luciferase yang dinormalisasi dalam ekstrak sel ditentukan dalam rangkap tiga dan diekspresikan relatif terhadap aktivitas sel yang ditransfusikan secara transien dengan vektor kosong pCMV. Baris kesalahan menunjukkan penyimpangan standar. (1) sel MCF7, sel MCF7 yang mengekspresikan sel p53-DD (p53-DD) dan MCF7-trkA-tsp53. (2) sel Saos2 (percobaan dinilai dalam rangkap tiga). ( B ) Ekspresi murine tsp53 dan wt-trkA di MCF7. Sel MCF7 secara stabil ditransfeksi dengan wt-trkA dan koloni yang mengekspresikan 2- hingga 3 kali lipat lebih banyak wt-trkA, bila dibandingkan dengan wt-trkA endogen, dipilih dan ditransfeksi dengan mutan tsp53 murine, kemudian sebuah koloni yang mengekspresikan kadar tsp53 yang sama dengan wtp53 endogen dalam sel MCF7 (MCF7-trkA-tsp53) diperoleh. Jumlah yang serupa dari (1) MCF7-trkA-tsp53 dan (2) lisat sel MCF7 di imunopresipitasi dengan anti-p53 PAb-DO1 (yang hanya mengenali antibodi p53 manusia) atau PAb248 (yang hanya mengenali murine p53) dan mengalami 7.5% SDS –Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Kehadiran p53 ditentukan oleh immunoblotting dengan antibodi anti-p53 domba yang mengenali manusia dan murine p53. Imunopresipitasi dengan PAb-DO1 dan PAb248 masing-masing menunjukkan adanya isoform p53 dan p53 dan p53β (Bourdon et al., 2005). Seperti yang dipublikasikan human dan murine p53, ketika ko-diekspresikan, heteroligomisasi dan co-imunopresipitat (Milner dan Medcalf, 1991), dengan demikian, p53 manusia dan murine dapat dilihat pada immunoprecipitates PAb248 dan PAb-DO1. (3) Jumlah yang sama dari lisat sel MCF7-trkA-tsp53 dan MCF7 diimunisasi dengan antibodi anti-trkB3 dan mengalami 7.5% SDS-PAGE. Kehadiran trkA ditentukan oleh immunoblotting dengan antibodi anti-trk203. ( C ) Represi ekspresi luciferase yang digerakkan oleh SHP-1-P1 oleh actinomycin D- atau cisplatin endogen wtp53 yang diaktifkan. Sel MCF7, T47D atau MDA-MB-231 ditransfusikan secara transien dengan 0, 5 μg pSHP-1-P1-lu, pGL2, pG13-lu, pM15-lu atau pCDC2-P-lu atau co-transfected dengan 0, 5 μg pSHP-1- P1-lu dan 1 μg dari p53-R175H yang mengandung vektor. Dalam semua kasus, 0, 3 μg vektor yang mengandung Renilla digunakan sebagai kontrol internal. Sel dibiarkan tumbuh selama 24 jam setelah transfeksi dan kemudian diinkubasi dengan 20 m M cisplatin selama 12 jam atau 15 n M actinomycin D selama 16 jam. Lisis sel diuji seperti yang dijelaskan dalam ( A ). Sangat penting untuk menunjukkan bahwa untuk menunjukkan sensitivitas uji, konsentrasi plasmid yang lebih rendah, daripada yang digunakan untuk analisis dalam ( A ), dipilih untuk percobaan ini. (1) sel MCF7, (2) sel T47D, (3) sel MDA-MB-231 (percobaan dinilai dalam rangkap tiga). ( D ) P-CCAAT dari promotor SHP-1-P1 terlibat dalam represi oleh wtp53. Diagram skematik dari promotor SHP-1-P1 wt menunjukkan situs NF-κB, CCAAT (D-CCAAT) distal, SP1 dan sekuens CCAAT (P-CCAAT) proksimal, dan mutan penghapusan bersarang pada 5 positions posisi nukleotida −410, −343, −315, −282, −240 dan −96. pSHP-1-P1-D-CCAAT dan pSHP-1-P1-CCAAT masing-masing menunjukkan kurangnya sekuens D-CCAAT dan P-CCAAT. Sel MCF7 ditransfusikan secara transien dengan 1, 5 μg pSHP-1-P1-lu, 5 del penghapusan bersarang SHP-1-P1 mutan, pSHP-1-P1-D-CCAAT atau pSHP-1-P1-CCAAT yang mengandung vektor mutan dan 2 μg pCMV-wtp53 atau ditransfeksi bersama dengan 1, 5 μg pSHP-1-P1-lu atau pSHP-1-P1-lu mutan bersama dengan vektor kosong 2 μg pCMV. Renilla yang mengandung vektor (0, 3 μg) digunakan sebagai kontrol internal. Sel ditanam selama 48 jam dan lisat diuji untuk ekspresi luciferase. Aktivitas luciferase yang dinormalisasi dalam ekstrak sel ditentukan dalam rangkap tiga. Efek represi lipat dihitung dengan membagi relatif luciferase di hadapan pCMV dengan yang diperoleh di hadapan pCMV-wtp53 (percobaan dinilai dalam rangkap tiga). ( E ) Deteksi NF-Y dan wtp53 yang berikatan dengan wt-P-CCAAT dengan tes chromatin imunopresipitasi (ChIP). Sel MCF7 diinkubasi dengan 15 n M actinomycin D selama 24 jam dan lisat menjadi sasaran CHIP dengan 2 μg antibodi anti-NF-YB, anti-p53 PAb-DO1 atau kontrol IgG. Cyclin B2 dan BACE promotor masing-masing berperan sebagai kontrol positif dan negatif. PCR dilakukan dengan primer oligonukleotida yang ditunjukkan. Di jalur input hanya sepertiga dari volume sampel yang dimuat ke gel (ini mewakili enam percobaan).

Gambar ukuran penuh

Untuk menilai apakah represi SHP-1-P1 terdeteksi dengan p53 dan trkA eksogen, sel MCF7 secara stabil ditransfeksi bersama dengan mutan yang peka terhadap suhu (ts) p53val135 murine (Michalovitz et al., 1990) dan wt-trkA manusia (MCF7) -trkA-tsp53), dan sebuah koloni yang mengekspresikan 2- hingga 3 kali lipat lebih banyak wt-trkA daripada wt-trkA endogen dan tsp53 serupa dengan level wtp53 endogen dipilih (Gambar 1B). Sel MCF7-trkA-tsp53 transiently ditransfeksi dengan pSHP-1-P1-lu yang tumbuh pada 32 ° C (konfigurasi w p53) menunjukkan represi 6 kali lipat (Gambar 1A1). Karena tsp53val135 adalah mutan 'bocor' (Montano, 1997), kurangnya tingkat represi yang sama dengan wtp53 dan sel MCF7 co-transfected pSHP-1-P1 bisa disebabkan oleh beberapa ekspresi p53 mutan dalam sel yang tumbuh pada suhu 32 ° C. Sebagai kontrol untuk aktivasi dan represi, pG13-lu (dengan 13 situs pengikatan ttem wtp53) dan promotor CDC2, yang ditransfeksi bersama dengan wtp53, digunakan. wtp53 ekspresi diaktifkan atau ditekan (el-Deiry et al., 1992; Yun et al., 1999) dari pG13-lu atau pCDC2-P-lu masing-masing (Gambar 1A1–2). Co-transfeksi wtp53 dengan pM15-lu (dengan 15 situs pengikatan p53 tandem mutan) atau pGL2 menunjukkan aktivitas yang sangat rendah (Gambar 1A1–2). Aktivitas tidak terlihat dengan ko-transeksi pGL2, pG13-lu, pM15-lu atau pCDC2-P-lu dan p53-R273H atau p53-R175H (data tidak ditampilkan).

Pengobatan sel yang mengekspresikan wtp53 endogen dengan obat kemoterapi meningkatkan aktivasi dan meningkatkan kadar p53 sebagai respons fisiologis (Meek, 2004). Untuk menilai apakah wtp53 endogen menekan aktivitas SHP-1-P1, sel MCF7, MDA-MB-231 dan T47D ditransfusikan secara transien dengan pSHP-1-P1-lu, pG13-lu, pG13-lu, pM15-lu atau pGL2, atau co-transfected dengan pSHP-1-P1-lu dan p53-R175H atau pCMV, dan diinkubasi dengan actinomycin D (ActD) atau cisplatin (Cis). Perawatan sel MCF7 dengan 15 n M ActD selama 16 jam atau 20 m M Cis selama 12 jam diinduksi aktivasi wtp53 endogen untuk mempromosikan represi masing-masing 4, 2 dan 3, 8 kali lipat (Gambar 1C1). Inkubasi dengan 15 n M ActD selama 24 jam menginduksi represi 7, 5 kali lipat (data tidak ditampilkan). Represi sangat rendah pada koinfeksi pSHP-1-P1-lu dan p53-R175H dan aktivasi terdeteksi dengan pG13-lu (Gambar 1C1). Represi atau aktivasi tidak terlihat dengan sel yang mengekspresikan p53 MDA-MB-231- dan T47D (Gambar 1C2-3); Namun, aktivitas pSHP-1-P1-lu tidak setinggi sel MCF7. Metilasi promotor SHP-1 menekan ekspresi SHP-1 dalam sel MDA-MB-231 (Ostman et al., 2006) dan menurunkan ekspresinya dalam sel T47D (Wu et al., 2003). Karena mereka mengekspresikan p53 mutan (Concin et al., 2003), ada kemungkinan bahwa aktivitas SHP-1-P1 eksogen yang lebih rendah disebabkan oleh mekanisme p53-independen seperti metilasi promotor. Bersama-sama hasil ini menunjukkan bahwa wtp53 ekspresi endogen eksogen dan diaktifkan dari SHP-1-P1.

P-CCAAT dan NF-Y terlibat dalam represi oleh wtp53 melalui SHP-1-P1

Untuk mengidentifikasi sekuens DNA yang terlibat dalam represi yang bergantung pada p53, mutan penghapusan bersarang SHP-1-P1 pada posisi 5 ′ nukleotida −410, −343, −315, −282, −240 atau −96, dan SHP-1-P1 dengan P-CCAAT bermutasi dan sekuens yang berdekatan (−72 hingga −59) atau D-CCAAT bermutasi (−332 hingga −328) diproduksi, disubkloning menjadi pGL2 dan ditransfusikan secara transien dengan pCMV atau wtp53 ke dalam sel MCF7. Meskipun perbandingan antara aktivitas luciferase yang tertekan p53 versus yang tidak tertekan menunjukkan beberapa represi dengan −410, −343, −315, −282, −240 atau −96 mutan SHP-1-P1, represi rendah signifikan 4, 9 kali lipat dengan mutan pSHP-1-P1-P-CCAAT bila dibandingkan dengan 35, 1 kali lipat dengan wt SHP-1-P1 diamati (Gambar 1D), menunjukkan bahwa terutama P-CCAAT dan urutan yang berdekatan terlibat dalam represi tergantung p53 melalui SHP-1 -P1.

Faktor transkripsi NF-Y, yang terdiri dari subunit NF-YA, NF-YB dan NF-YC (Mantovani, 1999), terlibat dalam represi yang bergantung pada p53. Untuk menilai apakah p53 dan NF-Y mengenali P-CCAAT dari SHP-1-P1, pengujian kromatin imunopresipitasi (ChIP) dilakukan menggunakan lisat sel MCF7 yang diobati dengan ActD. Hanya antibodi anti-p53-DO-1 atau anti-NF-YB yang mengendapkan DNA promotor SHP-1 seperti yang ditunjukkan setelah amplifikasi PCR (Gambar 1E). Seperti yang diharapkan (Wasner et al., 2003; Spiesbach et al., 2005), p53 dan NF-Y mengakui promotor cyclin B2 tetapi bukan promotor BACE (Gambar 1E). Jadi p53 menekan ekspresi yang digerakkan oleh SHP-1-P1 melalui P-CCAAT, dan NF-Y terlibat dalam aktivitas ini.

Ekspresi protein SHP-1 ditekan oleh wtp53

Untuk menentukan apakah wtp53 teraktivasi menginduksi represi ekspresi protein SHP-1, kadar protein wtp53 dan wt-SHP-1 endogen dari sel MCF7 yang diobati dengan ActD atau UV dinilai. Peningkatan 2, 5 dan 4, 5 kali lipat pada p53 dan penurunan 45-50% dan 80-85% pada level SHP-1 diamati setelah perlakuan masing-masing ActD atau UV (Gambar 2a). Sel MCF7-trkA-tsp53 yang tumbuh pada suhu 32 ° C menunjukkan penurunan 45-50% pada ekspresi SHP-1 (Gambar 2a). Penurunan tidak terlihat pada T47D (mengekspresikan wt-SHP-1), MDA-MB-231 (tanpa ekspresi SHP-1), sel MDA-MB-157 (tanpa ekspresi p53 dan SHP-1) (Yip et al., 2000) atau dalam sel MCF7-trkA-tsp53 tumbuh pada suhu 37 ° C. Penurunan ekspresi CDC2 kontrol terdeteksi dalam sel MCF7, tetapi tidak pada sel T47D, MDA-MB-231, MDA-MB-157 atau sel MCF7-trkA-tsp53 yang tumbuh pada suhu 37 ° C (Gambar 2a). Peningkatan p53 dan penurunan kadar SHP-1 juga terlihat pada sel ZR75-1 yang diobati dengan ActD atau UV (mengekspresikan wt-trkA dan wtp53 endogen), tetapi tidak pada sel MCF7-p53-RNAi (Berns et al., 2004) dengan ekspresi p53 siRNA-ablated (Gambar Tambahan 1).

Image

( A ) Represi ekspresi protein SHP-1 oleh wtp53 endogen diaktifkan oleh actinomycin D (ActD), UV dan p53 diekspresikan. Sel MCF7, T47D, MDA-MB-231, MDA-MB-157 tidak diinkubasi (-), diinkubasi dengan 15 n M ActD selama 24 jam atau terkena 15 kJ UV (UV). Jumlah lisat sel yang sama mengalami elektroforesis gel poliakrilamid 8, 5% SDS, dianalisis dengan immunoblotting, dan bila perlu, blot stripping dan re-probing untuk keberadaan SHP-1 dengan antibodi kelinci anti-SHP-1, p53 dengan PAb- DO1 (yang hanya mengenali p53 manusia), CDC2 dengan antibodi anti-CDC2 kelinci atau aktin dengan antibodi anti-aktin kelinci. Ekstrak sel MCF7-trkA-tsp53 tumbuh pada 32 ° C (32) atau 37 ° C (37) menjadi sasaran analisis yang sama (ini adalah perwakilan dari tiga percobaan). Setelah inkubasi dengan antibodi anti-aktin, aktin dideteksi oleh paparan yang lebih pendek (panel kiri). ( B ) Represi ekspresi mRNA SHP-1 dinilai dengan transkripsi terbalik (RT) -PCR. RNA total dari MCF7, sel ZR75-1 dan murine p53 - / - fibroblas diinkubasi (+) atau tidak diinkubasi (-) dengan 15 n M ActD selama 24 jam disiapkan dan dilakukan analisis RT-PCR menggunakan primer oligonukleotida yang diindikasikan. Tingkat distandarisasi untuk ekspresi gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH; ini merupakan perwakilan dari enam percobaan).

Gambar ukuran penuh

Represi juga terdeteksi pada level mRNA. RNA dari MCF7, ZR75-1 sel dan murine yang diobati dengan ActD dan tidak diobati, p53 - / - fibroblas yang mengalami transkripsi balik (RT) –PCR menunjukkan penurunan ekspresi mRNA SHP-1 pada MCF7 dan ZR75-1 tetapi tidak pada p53− / - sel setelah pengobatan ActD (Gambar 2b). Sebagai kontrol, peningkatan p21 dan penurunan level mRNA CDC25 oleh wtp53 diamati (ukuran produk yang diamplifikasi SHP-1, p21 dan CDC25 RT-PCR lebih kecil dari mouse daripada dari sel manusia). Jadi represi protein SHP-1 dan ekspresi mRNA hanya terdeteksi di hadapan wtp53.

Represi ekspresi SHP-1 oleh wtp53 menyebabkan fosforilasi wt trkA-Y674 / Y675

Obat kemoterapi mengaktifkan reseptor tirosin kinase melalui mekanisme seperti stres oksidatif atau dengan mengaktifkan protein kinase (Benhar et al., 2002; El-Abaseri et al., 2006). Untuk menguji apakah ActD mempromosikan fosforilasi tirosin trkA, dengan tidak adanya p53, trkA diimunisasi secara resipien dari NGF yang distimulasi atau yang diobati dengan non-transfeksi atau fib -blast yang sttA ditransksi secara stabil p53 - / - fibroblast, dan dianalisis dengan immunoblotting dengan antibodi 4G10. ActD tidak menginduksi fosforilasi tirosin trkA. Fosforilasi hanya terdeteksi di hadapan NGF (Gambar 3a1). Lisat dari p53 - / - sel yang diobati dengan ActD menunjukkan kurangnya represi SHP-1 (Gambar 3a2), sedangkan kontrol NIH3T3 sel yang diperlakukan dengan ActD menunjukkan peningkatan p53 dan penurunan level SHP-1 masing-masing.

Image

( a ) Actinomycin D (ActD) tidak mempromosikan fosforilasi tirosin trkA atau represi ekspresi SHP-1 tanpa p53. (1) Jumlah lisat yang serupa dari sel-sel fibroblas p53 - / -, dan p53 - / - secara stabil ditransfeksi dengan wt-trkA (p53 - / - trkA) diinkubasi dengan ada atau tidaknya (-) dari 15 n M ActD selama 24 h, atau distimulasi dengan 100 ng / ml NGF selama 5 menit, diimunisasi dengan antibodi anti-trkB3, mengalami 7, 5% SDS-poliakrilamida gel elektroforesis (PAGE) dan dianalisis dengan immunoblotting diikuti dengan pengupasan dan pengelompokan ulang, untuk Kehadiran tyrosine-phosphorylated trkA dengan antibodi 4G10 dan keberadaan trkA dengan antibodi anti-trk203 kelinci (ini adalah perwakilan dari tiga percobaan). (2) NIH 3T3 dan p53 - / - sel diinkubasi di hadapan (+) atau tidak ada (-) dari 15 n M ActD selama 24 jam. Jumlah lisat sel yang serupa di imunopresipitasi dengan anti-SHP-1 atau anti-p53 PAb248 (yang hanya mengenali antibodi murine p53), mengalami 7.5% SDS-PAGE dan dianalisis dengan immunoblotting. Kehadiran SHP-1 dan p53 ditentukan masing-masing dengan antibodi kelinci anti-SHP-1 atau Domba anti-p53 (ini merupakan perwakilan dari tiga percobaan). (B) wtp53 endogen atau overexpressed ActD diaktifkan menyebabkan represi ekspresi protein SHP-1 dan fosforilasi trkA Y674 / Y675. Sel MCF7 atau sel MCF7 yang ditransfeksi dengan wt-trkA (MCF7-trkA) diperlakukan sebagai berikut: (a) non-stimulated (−NGF) atau (b) distimulasi (+ NGF) dengan 100 ng / ml NGF selama 5 menit, ( c) diinkubasi dengan 15 n M ActD (ActD) selama 24 jam, (d) diinkubasi dengan 15 n M ActD dan 100 n M K252a selama 24 jam atau (e) diinkubasi dengan 100 n M K252a selama 24 jam dan distimulasi dengan 100 ng / ml NGF selama 5 menit. Sel MCF7-trkA-tsp53 ditanam pada suhu 32 ° C (32) atau 37 ° C (37) selama 48 jam. Sel MCF7-trkA ditransfusikan secara transien dengan pCMV-Δ-SHP-1, SHP-1-siRNA atau control-siRNA diperlakukan dan tumbuh seperti dijelaskan. MCF7-trkA-tsp53 ditransfusikan secara transien dengan pCMV-Δ-SHP-1, SHP-1-siRNA atau control-siRNA dan tumbuh pada suhu 32 atau 37 ° C selama 48 jam. Jumlah lisat sel yang sama dikenakan 7.5% SDS-PAGE dan dianalisis dengan imunoblotting, dan bila perlu, blot stripping dan re-probing untuk keberadaan trkA terfosforilasi dengan antibodi anti-pY674 / pY675, trkA dengan anti-trk203, SHP- 1 dengan antibodi anti-SHP-1 kelinci, p53 dengan PAb-DO1 atau aktin dengan antibodi anti-aktin. (1) sel MCF7, (2) sel MCF7-trkA dan MCF7-trkA-tsp53, (3) sel MCF7-trkA atau MCF7-trkA-tsp53 ditransfusikan secara transien dengan pCMV-Δ-SHP-1, (4) MCF7-trkA atau sel MCF7-trkA-tsp53 transiently ditransfeksi dengan SHP-1-siRNA atau control-siRNA. Hasilnya dikuantifikasi oleh densitometri (ini mewakili empat percobaan).

Gambar ukuran penuh

Untuk menilai apakah represi SHP-1 mengarah pada fosforilasi tirosin trkA, ActD digunakan. Lisat dari sel MCF7 yang diobati dengan NGF, ActD dan trkA inhibitor, K252a, diimunoblot dengan antibodi anti-trkA-phospho-Y674 / Y675. 35% Y674 / Y675 fosforilasi diamati pada sel yang diobati dengan ActD bila dibandingkan dengan sel yang distimulasi NGF. Fosforilasi tidak terdeteksi di hadapan K252a. Peningkatan p53 dan penurunan level SHP-1 diamati di hadapan ActD (Gambar 3b1). Sel MCF7 secara ekspresif mengekspresikan 2 hingga 3 kali lipat lebih banyak wt-trkA daripada wt-trkA endogen (MCF7-trkA) (Gambar Tambahan 2) atau sel MCF7-trkA-tsp53 yang tumbuh pada 32 ° C menunjukkan Y674 / Y675-terfosforilasi ketika ActD- diperlakukan atau tumbuh pada 32 ° C pada 26 dan 27% masing-masing (Gambar 3b2). Fosforilasi tidak terlihat pada sel MCF7-trkA yang diinkubasi K252a atau sel MCF7-trkA-tsp53 yang tumbuh pada suhu 37 ° C. Peningkatan p53 dan penurunan kadar SHP-1 diamati pada sel yang diobati dengan ActD atau sel yang tumbuh pada suhu 32 ° C (Gambar 3b2). Oleh karena itu, wt-trkA eksogen atau endogen adalah Y674 / Y675-terfosforilasi ketika p53 menekan ekspresi SHP-1.

Sebagai kontrol positif, sel MCF7-trkA dan MCF7-trkA-tsp53 secara transien ditransfeksi dengan DN mutan SHP-1 (Δ-SHP-1; Timms et al., 1998) atau SHP-1-siRNA. Di hadapan Δ-SHP-1, 24 dan 22% trkA adalah Y674 / Y675-terfosforilasi dengan tidak adanya NGF dan kehadiran ActD, masing-masing, dan 28 dan 26% diamati ketika tumbuh pada 32 atau 37 ° C. Di hadapan SHP-1-siRNA, 18 dan 20% fosforilasi terdeteksi dengan tidak adanya NGF atau kehadiran ActD, masing-masing, dan 20 dan 16% ketika tumbuh pada 32 atau 37 ° C (Gambar 3b3-4). Fosforilasi tidak terlihat pada sel yang tidak ditransfusikan, di hadapan K252a, kontrol-siRNA atau wt-SHP-1 (Gambar Tambahan 3). SHP-1-siRNA menginduksi penurunan level SHP-1 (Gambar 3b3). Transeksi Δ-SHP-1 atau wt-SHP-1 diekspresikan secara berlebih Δ-SHP-1 atau wt-SHP-1 (Gambar 3b4; Gambar Tambahan 3).

Ketika, sebagai kontrol negatif, Y674 / Y675 mutan trkA (trkA-Y674F / Y675F) secara sementara ditransfungsikan menjadi sel kanker payudara MDA-MB-361 (mengekspresikan wt-SHP-1 dan wtp53 tetapi tidak ada trkA (Tagliabue et al., 2000; Concin et al., 2003)), fosforilasi Y674F / Y675F tidak diamati (Tambahan Gambar 4a). Namun, fosforilasi terdeteksi ketika ditransfusikan dengan wt-trkA di hadapan pengobatan ActD (Gambar 4b tambahan). Hasil ini menunjukkan bahwa represi wtp53 ekspresi protein SHP-1 mengarah ke trkA-Y674 / Y675 fosforilasi.

Represi ekspresi SHP-1 oleh wtp53 menekan proliferasi sel kanker payudara di hadapan wt-trkA

Erb-2 dan reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) terlibat dalam kanker payudara (Mosesson dan Yarden, 2004). SHP-1 mendeposforilasi EGFR pada tirosin 1173 (Keilhack et al., 1998), tetapi tidak ada bukti bahwa dephosphorylates Erb-2 (Vadlamudi et al., 2002). Untuk menilai apakah represi SHP-1 memengaruhi fosforilasi tirosin EGFR endogen, sel MCF7 dan ZR75-1 ditransfeksi dengan SHP-1-siRNA atau control-siRNA. Immunoprecipitates EGFR dari sel-sel yang distimulasi dan non-stimulasi EGF, immunoblotted dengan 4G10, menunjukkan EGF-stimulasi EGFR yang dipacu fosforilasi tirosin dalam sel-sel yang ditransfusikan SHP-1-siRNA, ke level-level yang serupa dengan sel-sel yang tidak ditransfusikan (Gambar 4a dan b), menunjukkan bahwa represi ekspresi SHP-1 tidak mempengaruhi fosforilasi tirosin EGFR penuh.

Image

Kehadiran reseptor faktor pertumbuhan epidermal tirosin-terfosforilasi (EGFR) selama represi ekspresi SHP-1. Sel MCF7 dan ZR75-1 ditransfusikan secara transien dengan SHP-1-siRNA atau control-siRNA dan non-stimulated (-) atau distimulasi dengan 100 ng / ml EGF selama 10 menit. Jumlah lisat sel yang serupa adalah imunopresipitasi dengan antibodi EGFR Ab-1 dan mengalami 7, 5% SDS-poliakrilamida gel elektroforesis. Protein dianalisis dengan immunoblotting untuk keberadaan EGFR tyrosine-phosphorylated menggunakan antibodi anti-phosphotyrosine 4G10. Kemudian bercak-bercak bergaris dan diperiksa kembali untuk keberadaan EGFR dengan antibodi anti-EGFR domba (ini merupakan perwakilan dari tiga percobaan). ( a ) sel MCF7 ( b ) ZR75-1 sel.

Gambar ukuran penuh

Untuk menentukan apakah represi SHP-1 yang tergantung p53 terlibat dalam proliferasi sel kanker payudara, tes MTT dilakukan. Karena EGFR dapat difosforilasi tirosin ketika SHP-1 ditekan, pengujian dilakukan dengan adanya EGFR-siRNA untuk menilai fungsi spesifik trkA. Proliferasi menurun pada sel MCF7 dan ZR75-1 yang ditransfusikan secara transien dengan tsp53 ketika tumbuh pada suhu 32 ° C tetapi tidak pada suhu 37 ° C (Gambar 5a1–2). Penurunan terdeteksi pada kontrol positif SHP-1-siRNA tetapi tidak pada transeksi kontrol-siRNA (Gambar 5a1-2). Selain itu, sel MCF7 dan ZR75-1 co-transfected dengan tsp53 dan wt-SHP-1 yang tumbuh pada 32 ° C menunjukkan peningkatan proliferasi yang mirip dengan sel yang tumbuh pada suhu 37 ° C dan sel yang tidak ditransfusikan (Gambar 5a1–2). Perubahan suhu tidak menyebabkan perubahan proliferatif yang signifikan dari sel yang tidak ditransfusikan. Hasil serupa diperoleh dengan sel MCF7-trkA-tsp53, dan SHP-1-siRNA menurunkan proliferasi ketika tumbuh pada kedua suhu (Gambar 5a3). Transfeksi wt-SHP-1 sel MCF7-trkA tidak secara signifikan meningkatkan proliferasi (Gambar 5a4). Namun, SHP-1-siRNA menginduksi penurunan pada 32 atau 37 ° C (Gambar 5a4). Meskipun kontrol-siRNA efektif (Gambar 5a), seperti yang diharapkan (Downward, 2004), aktivitas latar belakang rendah kadang-kadang terdeteksi. Ketika analisis serupa dilakukan dengan menggunakan DN ATP K538 kinase-dead mutant trkA (trkA-KD) (Esposito et al., 2001), proliferasi yang ditekan dihapuskan (Tambahan Gambar 5a1-4).

Image

( a ) represi wtp53 dari SHP-1 mengarah pada supresi proliferasi sel kanker payudara di hadapan wt-trkA endogen atau transfected. Sel-sel yang non-transfected (0) atau trans-transiently transien dengan reseptor faktor pertumbuhan epidermal (EGFR) siRNA atau kontrol-siRNA bebas RISC dan pCMV-wt-SHP-1 (wt-SHP-1), pLTR-tsp53 (tsp53) ), SHP-1-siRNA atau control-siRNA dan dilapisi dengan plat 96-well. Kemudian sel dicuci dengan media bebas serum dan diinkubasi pada 32 ° C (32) atau 37 ° C (37) dengan ada atau tidaknya 100 ng / ml NGF dan dibiarkan tumbuh selama 48 jam. Tes MTT untuk proliferasi telah dilakukan. Perubahan proliferasi dihitung dengan mengurangi proliferasi sel 48 jam dengan proliferasi setelah pelapisan awal. Penting untuk menunjukkan bahwa hasilnya disajikan sebagai rasio proliferasi. Ini diperoleh dengan membagi nilai absorbansi sel yang tumbuh di hadapan NGF dengan nilai yang diperoleh tanpa adanya NGF. (1) MCF7, (2) ZR75-1, (3) MCF7-trkA-tsp53 dan (4) MCF7-trkA (percobaan dinilai dalam rangkap tiga). ( B ) represi wtp53 ekspresi SHP-1 menyebabkan proliferasi sel kanker payudara sel MDA-MB-361 ditekan di hadapan wt-trkA tetapi tidak mutan trkA-Y674F / Y675F. Sel yang tidak ditransfusikan (0) atau ditransfusikan secara transien dengan EGFR-siRNA atau RISC-control-siRNA Gratis dan pCMV-wt-SHP-1 (wt-SHP-1), pLTR-tsp53 (tsp53), pMEX-trkA ( trkA) atau pLCNX-Y674F / Y675F-trkA (trkA-Y674F / Y675F) dilapisi dalam pelat 96-sumur. Proliferasi dianalisis seperti yang dijelaskan pada Gambar 7a. (1) sel MDA-MB-361 ditransfusikan secara transien dengan tsp53, co-transfected dengan mutan trkA-Y674F / Y675F dan tsp53, mutan trkA-Y674F / Y675F, atau tsp53 dan wt-SHP-1 atau tsp53 dan wt-SHP-1, (2) sel MDA-MB-361 ditransfusikan secara sementara dengan wt-trkA, co-transfected dengan wt-trkA dan tsp53 atau wt-trkA, tsp53 dan wt-SHP-1 (percobaan dinilai dalam rangkap tiga). ( c ) Distribusi siklus sel. (1) MCF7 mengekspresikan wt-trkA endogen atau transfected. Sel MCF7, MCF7-trkA atau MCF7-trkA-tsp53 tidak ditransfusikan (-) atau ditransfusikan secara transien dengan pCMV-wt-SHP-1 (wt-SHP-1) dan / atau pLTR-tsp53 (tsp53) dan diinkubasi selama 48 h pada 32 ° C (32) atau 37 ° C (37), dan konten DNA dianalisis dengan penyortiran sel teraktivasi-fluoresensi (FACS, data yang ditampilkan adalah perwakilan dari tiga percobaan independen). (2) sel MDA-MB-361 yang mengekspresikan wt-trkA atau mutan trkA yang ditransfusikan. Sel MDA-MB-361 adalah non-transfected (-) atau ditransfusikan secara transien dengan kombinasi berbeda dari pCMV-wt-SHP-1 (wt-SHP-1), pLTR-tsp53 (tsp53) pMEX-trkA (trkA) atau pLCNX- Y674F / Y675F-trkA (trkA-Y674F / Y675F) dan diinkubasi selama 48 jam pada 32 ° C (32) atau 37 ° C (37), dan konten DNA dianalisis oleh FACS (data yang ditampilkan adalah perwakilan dari tiga percobaan independen).

Gambar ukuran penuh

Untuk mendefinisikan fungsi trkA, sel MDA-MB-361 yang tidak mengekspresikan atau mengekspresikan trkA-Y674F / Y675F dan tsp53, trkA-Y674F / Y675F, tsp53 dan wt-SHP-1 atau tsp53 saja dianalisis. Perubahan proliferatif minor tetapi tidak signifikan terlihat (Gambar 5b1). Namun, penurunan diamati pada ko-transfeksi sel wt-trkA dan tsp53 yang tumbuh pada 32 ° C (Gambar 5b2). Ekspresi wt-trkA, tsp53 dan wt-SHP-1 menunjukkan peningkatan proliferasi pada 32 ° C (Gambar 5b2). trkA-KD menghapuskan penindasan proliferasi (Gambar 5b tambahan).

Eksperimen dengan RISC-free control-siRNA (Gambar 5a dan b) dan inhibitor farmakologis dari EGFR, Erb-2 atau PDGFR (AG1478, AG825 atau AG1295 masing-masing) menunjukkan hasil yang setara (Tambahan Gambar 6a dan b), menunjukkan bahwa p53 represi dari SHP Ekspresi -1 membutuhkan trkA-Y674 / Y675 untuk menginduksi penekanan proliferasi. PDGFR juga dipilih karena mungkin terlibat dalam kanker payudara (Carvalho et al., 2005) dan SHP-1 adalah kemungkinan PDGFR fosfatase (Yu et al., 1998).

Karena tes MTT menghitung jumlah sel yang layak, ada kemungkinan bahwa efek pada kelangsungan hidup atau proliferasi diukur. Kurangnya asimilasi Trypan biru, fragmentasi DNA dan aktivasi caspase-3/7 (data tidak ditampilkan) menunjukkan bahwa apoptosis bukanlah penyebab penurunan proliferasi. Oleh karena itu status siklus sel diselidiki oleh pewarnaan propidium iodida oleh flow cytometry. Peningkatan ∼ 80% dalam sel pada G 0 / G 1 pada MCF7 ditransfeksi dengan sel tsp53 atau MCF7-trkA-tsp53 yang tumbuh pada suhu 32 ° C terlihat, tetapi tidak diamati ketika tumbuh pada suhu 37 ° C atau dalam sel yang tidak ditransfusikan. . Transfeksi wt-SHP-1 menginduksi penurunan populasi G0 / G1 dalam sel yang mengekspresikan trkA dan tsp53 yang tumbuh pada suhu 32 ° C (Gambar 5c1). Yang penting, sel-sel MDA-MB-361 yang ditransfusikan dengan wt-trkA dan tsp53, yang mengalami analisis yang sama, menunjukkan peningkatan yang signifikan pada populasi G0 / G1. Meskipun beberapa peningkatan dalam populasi G0 / G1 diamati dalam sel yang mengekspresikan tsp53 saja atau Y674F / Y675F-trkA dan tsp53 (konsisten dengan fungsi p53 dalam menginduksi penangkapan siklus sel (Stiewe, 2007)), ini tidak setinggi seperti ketika wt-trkA hadir, menunjukkan bahwa trkA terlibat dalam mengurangi perkembangan siklus sel kanker payudara (Gambar 5c2).

Selain itu, sel MCF7 atau ZR75-1 yang tidak ditransfusikan atau ditransfusikan secara transien dengan tsp53, wt-SHP-1, SHP-1-siRNA atau control-siRNA ditanam pada 32 atau 37 ° C, diinkubasi dengan BrdU dan diwarnai dengan anti Antibodi BrdU. Penggabungan BrdU (28 dan 40%) terdeteksi di masing-masing sel MCF7 atau ZR75-1 yang ditransfusikan tsp53, ketika tumbuh pada suhu 32 ° C, sedangkan penggabungan ∼ 95% terlihat ketika tumbuh pada suhu 37 ° C (Gambar 6a dan c). MCF7 atau ZR75-1 sel co-transfected dengan tsp53 dan wt-SHP-1 menunjukkan peningkatan penggabungan 85 dan 80%, masing-masing, ketika tumbuh pada 32 ° C (Gambar 6a dan c). Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam penggabungan yang diamati pada sel yang tidak ditransfusikan. Sel MCF7 atau ZR75-1 yang ditransfeksi dengan SHP-1-siRNA menunjukkan penurunan penggabungan menjadi 22 dan 27%, dan 23 dan 30% masing-masing pada 32 atau 37 ° C (Gambar 6a dan c). Hasil serupa terlihat dengan sel MCF7-trkA-tsp53 yang tumbuh pada suhu 32 ° C atau SHP-1-siRNA (Gambar 6e). Penggabungan diamati dalam sel MCF7-trkA siRNA-transfected kontrol atau sel MCF7-trkA-tsp53 tumbuh pada suhu 37 ° C. Seperti yang diharapkan, wt-SHP-1 atau trkA-KD mempromosikan peningkatan penggabungan BrdU (Gambar 6b, d dan f).

Image

Represi ekspresi SHP-1 oleh wtp53 mengarah pada penghentian siklus sel sel kanker payudara di hadapan wt-trkA. Sel-selnya dilapisi dalam piring 3 cm yang berisi penutup yang dilapisi kolagen. Kemudian sel-sel non-transfected atau ditransfusikan secara transien dengan pCMV-wt-SHP-1 (wt-SHP-1), pLTR-tsp53 (tsp53), pMEX-trkA (trkA), pLCNX-trkAY674F / Y675F (trkA-Y674 / Y675) ), SHP-1-siRNA atau control-siRNA dan diinkubasi selama 48 jam pada 32 ° C (32) atau 37 ° C (37). Kalau tidak, sel-sel transien co-transfected dengan pLCNX-KD-trkA (trkA-KD) dan seperti yang dinyatakan sebelumnya. Sel diinkubasi dengan BrdU selama 4 jam dan diwarnai dengan antibodi anti-BrdU diikuti oleh antibodi sekunder terkonjugasi Alexa-568. Mounts coverslips dianalisis dengan mikroskop fluoresensi dan sel-sel dengan BrdU dimasukkan dihitung dalam bidang (dipilih secara acak) yang berisi 60-70 sel. Hasil adalah rata-rata dari percobaan rangkap tiga dan standar deviasi mereka. ( a ) sel MCF7 yang tidak ditransfusikan (-) atau ditransfusikan secara sementara dengan tsp53, SHP-1-siRNA atau control-siRNA, atau ditransfusikan bersama dengan tsp53 dan wt-SHP-1. ( B ) sel MCF7 ditransfeksi dengan trkA-KD dan seperti yang dinyatakan sebelumnya. ( c ) ZR75-1 sel yang tidak ditransfusikan (-) atau ditransfusikan secara sementara dengan tsp53, SHP-1-siRNA atau control-siRNA, atau ditransfusikan bersama dengan tsp53 dan wt-SHP-1. ( d ) ZR75-1 sel ditransfeksi dengan trkA-KD dan seperti yang dinyatakan sebelumnya. ( e ) sel MCF7-tsp53-trkA dan MCF7-trkA, non-transfected (-) atau ditransfusikan secara sementara dengan wt-SHP-1, SHP-1-siRNA atau control-siRNA. ( f ) Sel MCF7-tsp53-trkA dan MCF7-trkA ditransfeksi dengan trkA-KD dan seperti yang dinyatakan sebelumnya. ( g ) sel MDA-MB-361 yang tidak ditransfusikan (-) atau ditransfusikan secara transien dengan tsp53, SHP-1-siRNA atau control-siRNA, atau ditransfusikan bersama dengan wt-trkA dan tsp53, mutan trkA-Y674F / Y675F dan tsp53, wt-trkA, tsp53 dan wt-SHP-1, wt-trkA dan SHP-1-siRNA atau wt-trkA dan control-siRNA. ( h ) sel MDA-MB-361 ditransfeksi dengan trkA-KD dan seperti yang dinyatakan sebelumnya (percobaan dinilai dalam rangkap tiga).

Gambar ukuran penuh

Hasil yang sama diperoleh dengan EGFR-siRNA atau RISC-Free control-siRNA (data tidak ditampilkan), dan EGFR, Erb-2 atau inhibitor farmakologis PDGFR (Gambar Tambahan 7a-f). Ketika sel MDA-MB-361 transien co-transfected dengan trkA-Y674F / Y675F dan tsp53 atau ditransfeksi dengan tsp53 saja, masing-masing 75 dan 85% penggabungan BrdU, masing-masing, diamati pada trkA-Y674F / Y675F dan sel tsp53 yang ditumbuhkan bersama sel at 32 or 37 °C, and 71 and 88% incorporation, respectively, was detected in tsp53 transfected cells grown at either temperature (Figure 6g). This is consistent with a function of wtp53 in promoting cell-cycle arrest. However, wt-trkA and tsp53 co-transfection showed a decrease to 22% in cells grown at 32 °C, suggesting a function for trkA. A comparison between results from co-transfections of wt-trkA and tsp53 with transfections of tsp53 alone and co-transfections of Y674F/Y675F-trkA and tsp53 showed significant high wt-trkA-dependent cell-cycle arrest ( t -test, P <0.001). wt-trkA, wt-SHP-1 and tsp53 co-transfection revealed 85% incorporation in cells grown at 32 °C, and co-transfections with wt-trkA and SHP-1-siRNA showed decreased incorporation. No significant decrease was seen with control-siRNA or transfections with SHP-1-siRNA or control-siRNA alone (Figure 6g). Increased incorporation was observed in the presence of trkA-KD (Figure 6h), indicating that trkA is involved in repression of BrdU incorporation.

These results demonstrate that endogenous or exogenous phosphorylated wt trkA-Y674/Y675 is involved in suppression of breast cancer cell proliferation promoted by p53 repression of SHP-1 expression.

Diskusi

This investigation shows that in breast-cancer cells p53 repression of SHP-1 expression leads to trkA-Y674/Y675 phosphorylation and suppression of proliferation in the presence of wt-trkA (Figure 7). This can be detected when EGFR, Erb-2 and PDGFR are ablated by siRNA or pharmacological inhibitors, demonstrating the importance of trkA. Luciferase assays reveal that wtp53 represses expression through SHP-1-P1. Endogenous wtp53, when activated by chemotherapeutic agents represses gene expression, thus MCF7 cells (but not MDA-MB-231 or T47D cells that express mutant p53) transfected with SHP-1-P1-lu and treated with ActD or Cis show repression of luciferase activity through SHP-1-P1-lu. Comparison of activity between wt and mutant SHP-1-P1 reveals partial decrease in repression with 5′ −410 to −96 SHP-1-P1 mutants, suggesting that these sequences can influence on p53-dependent repression. This could be due to changes in promoter conformation induced by DNA deletion, or loss of NF-κB, D-CCAAT or Sp1 consensus sequences (Xu et al., 2001). However, mutation of P-CCAAT and adjacent sequences induce low activity, suggesting that they are primarily involved in p53-dependent repression. Importantly, ChIP assays indicate that p53 and NF-Y are involved in wt but not mutant P-CCAAT recognition.

Image

Model of trkA tyrosine phosphorylation. Schematic representation showing how trkA-Y674/Y675 can be phosphorylated through repression of SHP-1 expression by p53.

Gambar ukuran penuh

Results also suggest that SHP-1 protein expression is repressed by endogenous wtp53 (but not mutant p53) when activated with ActD or UV, as increased p53 concomitant with decreased SHP-1 expression is observed. This is strengthened by results revealing p53 repression of SHP-1 at the mRNA level. Chemotherapeutic drugs can activate receptor tyrosine kinases (Benhar et al., 2002; El-Abaseri et al., 2006). Agents such as AraC induce trkA transcription or activation (Jagjit and Anthony, 1998; Xie et al., 2000). Because ActD does not induce trkA tyrosine phosphorylation in the absence of wtp53, ActD was used to assess if p53-dependent SHP-1 repression leads to trkA-Y674/Y675 phosphorylation. Analysis of wt-trkA- and wtp53-expressing cells shows Y674/Y675 phosphorylation. Phosphorylation is not seen in the presence of K252a, wt-SHP-1 or in control MDA-MB-361 cells expressing trkA-Y674F/Y675F, indicating that SHP-1 repression by p53 promotes trkA-Y674/Y675 phosphorylation.

To determine if this type of SHP-1 repression is involved in breast-cancer cell proliferation, MTT assays, propidium iodide staining and BrdU incorporation were carried out. These demonstrated that proliferation was suppressed in cells expressing wt-trkA and wtp53. This was not observed in the presence of wt-trkA and mutant p53, trkA-Y674F/Y675F and tsp53, tsp53 alone or in the presence of trkA-KD indicating that wt-trkA is involved in suppression of proliferation. Although a percentage of MDA-MB-361 cells expressing mutant trkA-Y674F/Y675F and tsp53 or tsp53 alone undergo cell-cycle arrest, this is low compared to wt-trkA and tsp53 co-transfections, emphasizing the key function of wt-trkA.

Because we have demonstrated that trkA and p53 associate and as trkA binds to SHP-1 (Marsh et al., 2003), immunoprecipitation experiments were performed to determine whether p53 and SHP-1 bind and if a trkA/p53/SHP-1 trimer can be detected. p53 and SHP-1 association was not detected in immunoprecipitations with anti-p53-PAb248, -p53-PAb421 or anti-SHP-1 antibodies (Supplementary Figure 8a). In the presence of trkA, it was possible to observe trkA and p53 association but not a trkA/p53/SHP-1 trimer complex (Supplementary Figure 8b), suggesting that p53 does not modulate SHP-1 through binding, and that p53 and SHP-1 possibly compete for the same trkA-binding site. Although it is possible that physical interaction between trkA and p53 might contribute to the function of trkA in reduction of breast cancer cell proliferation, this study shows that SHP-1 downregulation by p53 in the presence of wt-trkA is one mechanism by which breast-cancer cell proliferation is reduced. Moreover, given that wtp53 expression is seen preferentially in the cytoplasm of breast-cancer cells undergoing proliferation (Moll et al., 1996), these experiments suggest that upon activation, p53 translocates to the nucleus to transcriptionally repress SHP-1 expression resulting in suppressed proliferation.

Because p53-induced repression of SHP-1 expression occurs in the presence of pharmacological or DNA-damaging agents, this finding could be used for therapeutic purposes during the clinical management of wt-trkA, wtp53 and wt-SHP-1 expressing breast tumours. Dephosphorylation of Y674/Y675 (which are catalytic tyrosines) inhibits trkA kinase activity and trkA-dependent signal transduction. NGF-dependent trkA activation and phosphorylation of these tyrosines leads to signal transduction through binding of Grb-2, SHB-2 and APS adaptors. Grb-2-binding induces MAP-kinase activation (MacDonald et al., 2000). SHB-2 and APS binding increases the magnitude of trkA tyrosine phosphorylation and activation, and promote branching of axonal processes of sympathetic neurons (Qian et al., 1998; Qian and Ginty, 2001). Therefore, in breast-cancer cells this type of repression induces trkA-Y674/Y675 phosphorylation, and possibly activation of these substrates and novel signalling cascades promoting cell-cycle arrest, and this novel mechanism is involved in suppression of proliferation and differential tissue-specific responsiveness of trkA.

Previous studies suggested that Erb-2 interacts with trkA during breast-cancer cell proliferation promoted by NGF-stimulated trkA (Tagliabue et al., 2000). Because suppressed proliferation was detected with an Erb-2 pharmacological inhibitor, the present research suggests that Erb-2 is not involved in trkA-dependent suppression of proliferation. Although transfection of SHP-1 may have tumour suppressor behaviour in cancer cells lacking SHP-1 expression (for example, those of haematopoietic origin; Ostman et al., 2006), its involvement in SHP-1 expressing cancer cells is not well understood. This investigation indicates that in breast-cancer cells downregulation of SHP-1 expression has tumour-suppressing activity. SHP-1 is a negative regulator of several tyrosine kinases and signalling proteins (Neel et al., 2003). Thus, the possibility that its repression might affect their function and contribute to breast-cancer cell-cycle arrest cannot be excluded and is under investigation.

Overall these results suggest that repression of SHP-1 expression by p53, in the absence of NGF stimulation, promotes trkA-Y674/Y675 phosphorylation and trkA-dependent suppression of breast-cancer cell proliferation. This data provide a possible explanation for why high trkA levels are associated with favourable patient prognosis.

Konflik kepentingan

Penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Supplementary Figures 1–8

Dokumen Word

  1. 1.

    Informasi tambahan

    Informasi Tambahan menyertai makalah di situs Oncogene (//www.nature.com/onc)