Penggabungan situs khusus fluorotyrosines ke dalam subunit r2 dari e. coli ribonucleotide reductase dengan ligasi protein yang diekspresikan | protokol alam

Penggabungan situs khusus fluorotyrosines ke dalam subunit r2 dari e. coli ribonucleotide reductase dengan ligasi protein yang diekspresikan | protokol alam

Anonim

Abstrak

Pengikatan protein yang dinyatakan (EPL) memungkinkan semisintesis protein target dengan penggabungan probe spesifik lokasi atau asam amino tidak alami pada termini N atau C-nya. Di sini, kami menggambarkan protokol yang dikembangkan oleh laboratorium kami untuk menggabungkan fluorotyrosines (F n Ys) pada residu 356 dari subunit kecil Escherichia coli ribonucleotide reductase menggunakan EPL. Dalam prosedur ini, sebagian besar protein (residu 1-353 dari 375) menyatu ke domain intein dan disiapkan dengan ekspresi rekombinan, menghasilkan protein dalam bentuk terpotong yang diaktifkan tioester, terpotong. Sisa protein, peptida 22-mer, dibuat dengan sintesis peptida fase padat dan mengandung F n Y pada posisi yang diinginkan. Ligasi 22-peptida p untuk R2 yang diaktifkan thioester dan pemurnian berikutnya menghasilkan R2 panjang penuh dengan F n Y pada residu 356. Prosedur untuk menghasilkan 100 mg jumlah Y 356 F n Y-R2 membutuhkan 3-4 bulan .

pengantar

Masalah sedang diselidiki

Escherichia coli ribonucleotide reductase (RNR) mengkatalisis konversi keempat nukleotida menjadi 2′-deoksinukleotida yang sesuai dan terdiri dari dua subunit homodimerik: R1 dan R2 (ref. 1, 2, 3). R1 adalah subunit homodimerik di mana reduksi nukleotida terjadi. Ini berisi situs pengikatan untuk substrat nukleosida difosfat serta untuk deoksinukleosida trifosfat dan efektor alosterik ATP, yang mengatur spesifisitas substrat dan tingkat turnover. R2 adalah subunit homodimerik, yang menampung kofaktor radikal diiron-tyrosyl (Y 122 •) yang penting untuk katalisis. Setiap turnover membutuhkan migrasi radikal dari situs Y 122 pada R2 ke situs aktif R1, dengan jarak 35 Å. Mekanisme acara propagasi radikal jangka panjang ini adalah area aktif penelitian 4, 5 .

Struktur RNR aktif, kompleks 1: 1 R1 dan R2, tidak tersedia. Namun, Uhlin dan Eklund 6 telah menghasilkan model docking kompleks ini dari struktur individu R1 dan R2 (ref. 7, 8). Analisis mereka, bersama dengan keberpihakan Clustal W lebih dari 160 sekuens RNR kelas I, telah menyarankan jalur untuk migrasi radikal reversibel, yang melibatkan residu berikut dan mungkin pusat diiron: [Y 122 ⇆ Klaster Fe ⇆ W 48 ⇆ Y 356 ] di R2 dan [Y 731 ⇆ Y 730 ⇆ C 439 ⇆ substrat] dalam R1 (Gbr. 1) (ref. 5, 6). Mutagenesis terarah-situs telah digunakan untuk memberikan bukti bahwa residu ini sangat penting untuk inisiasi radikal 9, 10, 11, 12, 13 . Namun, mutan ini belum informatif secara mekanis, karena mereka hanya menunjukkan aktivitas katalitik marginal yang mungkin terkait dengan kontaminasi tipe liar residual dari mutan yang dimurnikan. Dari 19 asam amino alami yang dapat disubstitusi untuk Tyr pada posisi ini, hanya Trp dan Cys yang memiliki potensi oksidasi yang mendekati Tyr, tetapi mereka adalah pengganti struktural yang buruk 5 . Untuk menghasilkan mutasi mekanis yang lebih bermakna, kami bertujuan untuk mengganti residu Y 356 pada jalur inisiasi radikal yang diusulkan dalam R2 dengan asam amino alami yang secara sterik menyerupai Tyr dan memiliki berbagai potensi oksidasi dan pK dari rantai samping fenolik mereka.

Image

Perhatikan bahwa residu 356 tidak terlihat dalam struktur R2 karena gangguan pada ekor terminal-C; oleh karena itu, jarak dari W 48 dan Y 731 ke Y 356 tidak diketahui. Jarak dalam R1 didasarkan pada struktur R1 dalam ref. 6 dan yang ada di R2 didasarkan pada struktur resolusi tinggi dalam ref. 8.

Gambar ukuran penuh

Untuk tujuan ini, kami mengeksplorasi sifat-sifat F n Ys ( n = 1-4) dan menunjukkan bahwa mereka dapat berfungsi sebagai probe untuk menguraikan reaktivitas residu Tyr redoks-aktif dalam protein (Gambar 2) (lihat ref. 14) . F n Ys bersifat isosterik dengan tirosin, menghadirkan sejumlah fenolik pKs serta sejumlah besar potensi oksidasi (Tabel 1). Dengan pilihan F n Y dan pH reaksi yang tepat, seseorang dapat mengubah keadaan protonasi F n Y 356, potensi oksidasi atau keduanya. Dengan demikian, F n Ys adalah probe yang sangat baik untuk memeriksa mekanisme transfer elektron berpasangan proton dalam propagasi radikal dan harus secara umum berguna untuk mempelajari protein yang memerlukan radikal tirosil stabil atau sementara untuk katalisis 15, 16 . Kami selanjutnya mengembangkan semisintesis R2 yang dimediasi-intein yang memungkinkan penggantian residu Y 356 khusus dalam R2 dengan F n Ys 17, 18 .

Image

Sifat-sifat fisik dan kimia yang terkait dari varian N- asetil, yang dilindungi-C-amida dari F n Ys ini tercantum dalam Tabel 1 (lihat ref. 14).

Gambar ukuran penuh

Tabel ukuran penuh

Inteins dan mekanisme splicing protein

Intein adalah domain protein yang mengkatalisasi eksisi diri pasca-translasi sendiri dari polipeptida yang lebih besar di samping penyambungan domain terminal N- dan C-terminal (N-extein dan C-extein) yang mengapit domain intein 19, 20 . Intein pertama, Vma dari Saccharomyces cerevisiae , ditemukan pada awal 1990-an (ref. 21). Potensi kegunaan dari penyambungan diri dalam rekayasa protein memicu studi rinci tentang mekanisme aksi proses multistep ini. Pemahaman ini mengarah pada pengembangan sejumlah konstruksi intein rekayasa ulang yang sekarang tersedia secara komersial memungkinkan semisintesis protein 22, 23 dan akibatnya penggabungan spesifik asam amino alami yang tidak sesuai lokasi. Salah satu teknik ini, EPL, adalah fokus dari protokol ini.

Untuk menunjukkan cara kerja EPL, pertama-tama mekanisme pengusiran diri harus digariskan. Mekanisme yang diusulkan untuk S. cerevisiae Vma intein ditunjukkan pada Gambar 3 (lihat ref. 24, 25). Penyambungan dimulai oleh pergeseran asil NS yang mengubah ikatan peptida menjadi thioester di situs persimpangan N-extein. Transthioesterifikasi melalui residu C-extein Cys menghasilkan zat antara yang bercabang. Zat antara ini mengalami eksisi domain intein dengan menyerang residu Asn pada ikatan peptida di situs persimpangan C-extein membentuk intein succinimide dan domain extein yang disambung. Penataan ulang asil SN spontan menghasilkan ekstensi N- dan C-ligated yang terhubung melalui ikatan amida.

Image

Gambar ukuran penuh

Semisintesis R2 menggunakan EPL

Kami telah menerapkan EPL untuk membuat subunit R2 dari E. coli RNR semisintetik. R2 adalah homodimer dengan setiap polipeptida mengandung 375 asam amino. Asam amino C-terminal 35 dari E. coli R2 tidak teratur dan daerah ini menampung Y 356, residu yang diusulkan menjadi penting dalam proses perbanyakan radikal yang secara mekanis tidak biasa dijelaskan di atas (Gbr. 1) (ref. 5). Skema umum yang kami gunakan untuk semisintesis R2 ditunjukkan pada Gambar 4 (lihat ref. 17). Residu 1–353, dilipat menjadi keadaan asli, dibuat melalui teknologi DNA rekombinan dan diikat ke residu 354–375, dibuat dengan sintesis peptida fase padat (SPPS). Mayoritas R2 (residu 1-353) menyatu dengan mutan intein, yang tidak memiliki residu C-extein Asn dan Cys tetapi mengandung tag pemurnian, domain pengikat kitin (CBD) 26 . Setelah ekspresi rekombinan, produk rekayasa fusi intein mengkatalisasi langkah pertama dari reaksi pembelahan diri, tetapi bukan langkah penyambungan berikutnya. Thioester yang terbentuk kemudian ditangkap oleh tiol molekul kecil, seperti asam 2-mercaptoethanesulfonic (MESNA), melalui transthiosesterifikasi, menghasilkan pembelahan protein target dari konstruksi intein-CBD. R2 yang diaktivasi oleh tioester kemudian terpotong pada sisa R2, peptida yang mengandung residu 354–375 dengan asam amino tidak alami pada residu 356 dan Cys pada ujung N (residu 354). Transthioesterifikasi residu N-terminal Cys dari peptida diikuti oleh pergeseran asil SN secara spontan menghasilkan R2 panjang penuh. R2 tipe liar mengandung Ser pada 354 dan dengan demikian mutasi kedua, selain asam amino tidak wajar, dimasukkan ke dalam R2 pada residu 354. Akhirnya, mutasi ketiga, V 353 G, diperlukan untuk meningkatkan efisiensi ligasi dan akibatnya hasil hingga 100 mg jumlah semisintetik R2 diperlukan untuk percobaan biofisik.

Image

Residu 1–353 diekspresikan secara rekombinan sebagai chimera intein-CBD. Setelah pergeseran asil NS awal, tiol molekul kecil, MESNA, digunakan untuk memotong R2 terpotong dari domain intein-CBD. R2 yang diaktifkan MESNA yang dihasilkan diikat ke F n Y-22mer, yang disiapkan oleh SPPS dan mengandung residu 354-375 dengan F n Y di residu 356. Perhatikan bahwa mutasi V 353 G diperlukan untuk meningkatkan pembelahan dan ligasi hasil panen.

Gambar ukuran penuh

Keuntungan dan keterbatasan EPL

Sejumlah metode sedang dalam proses dikembangkan untuk penggabungan asam amino tidak alami ke dalam protein dengan cara yang kuat 27, 28 . Kami telah memilih EPL untuk semisintesis R2 karena sejumlah alasan. Pertama, 100 mg jumlah semisintetik R2, yang diperlukan untuk eksperimen biofisik mekanistik, dapat diakses. Kedua, pemurnian dengan tag CBD kuat. Ketiga, residu Y 356, anggota dari rantai inisiasi radikal dan sangat menarik bagi kita secara mekanis (Gbr. 1), berada pada bagian C-terminal yang tidak teratur dari protein, dan karenanya merupakan target yang baik untuk substitusi oleh EPL. Akhirnya, sejumlah inteins sekarang tersedia secara komersial. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4, kami telah menggunakan metode tiol untuk memotong R2 terpotong yang diaktifkan dari konstruksi intein-CBD, tetapi pembelahan yang diinduksi oleh suhu dan pH juga dapat digunakan untuk menghasilkan spesies yang diinginkan. Karena keunggulan ini, metode EPL telah digunakan oleh banyak penyelidik, dan ulasan yang sangat baik tentang aplikasinya tersedia 29, 30, 31 .

EPL juga memiliki sejumlah keterbatasan. Pertama, penggabungan probe spesifik-situs hanya dapat terjadi dekat dengan N atau C termini protein karena peptida yang lebih lama dari 40-50 residu sulit disintesis dan dimurnikan. Kedua, situs ligasi harus dapat diakses untuk pelarut dalam protein asli. Jika tempat ligasi dikubur, maka reaksi ligasi perlu dilakukan dalam kondisi denaturasi, dan metode untuk melipatgandakan protein diperlukan. Ketiga, protein terpotong tioester mengalami hidrolisis dalam persaingan dengan ligasi peptida. Tingkat ligasi, reaksi bimolekuler, meningkat dengan meningkatnya konsentrasi. Namun, ligasi masih lambat dan akibatnya hidrolisis hampir selalu menyertai reaksi yang diinginkan. Oleh karena itu, diperlukan metode untuk memisahkan protein terpotong dari protein terpanjang penuh. Masalah ini diperburuk jika protein yang diminati bersifat multimerik, seperti dalam kasus R2.

Masalah khusus yang terkait dengan semisintesis R2

R2 adalah homodimer dan oleh karena itu diperlukan metode untuk memisahkan homodimer terpotong, heterodimer dan homodimer panjang penuh. Selain itu, R2 mengandung kofaktor diferrik-Y 122, yang penting untuk katalisis dan rentan terhadap reduksi oleh tiol. Semisintesis, pada gilirannya, memerlukan konsentrasi tiol yang tinggi untuk pembelahan domain intein-CBD dari R2 terpotong serta untuk reaksi ligasi. Oleh karena itu, semisintesis awal R2 kami mengandung konten Y 122 rendah dan aktivitas enzimatik yang rendah. Namun, kami telah berhasil memodifikasi metode EPL untuk semisintesis R2 sehingga hasil Y 122 • sekarang serupa dengan yang ada dalam R2 tipe liar yang diekspresikan secara rekombinan (MRS, CSY & JS, naskah dalam persiapan - protokol terperinci yang tersedia berdasarkan permintaan). Diharapkan bahwa peneliti lain yang ingin menggunakan EPL untuk mensintesiskan protein target mereka untuk menggabungkan F n Ys akan mendapat manfaat dari prosedur terperinci yang dijelaskan di sini dan dari solusi yang telah kami temukan untuk masalah tambahan yang ditimbulkan oleh sifat multimerik R2, ketidakmampuannya untuk dijual kembali setelah denaturasi dan Y122 tidak stabil dalam kondisi reduksi.

Ikhtisar skematis protokol

Prosedur untuk memasukkan F n Ys ke dalam R2 oleh EPL membutuhkan implementasi tiga langkah yang dapat dianggap sebagai blok protokol sekuensial yang saling independen:

1. Sintesis dan pemurnian F n Y (s). Blok ini tercakup dalam Langkah 1–9 dari PROSEDUR.

2. Perlindungan gugus amino F n Y (s) dengan 9-fluorenylmethoxy carbononyl (Fmoc) -melindungi kelompok dan sintesis dan pemurnian peptida-22mer (H 2 N-CS (F n Y) LVGQIDSEVDTDDLSNFQL-COOH) mengandung F n Y (s) yang diinginkan, Langkah 10–34.

3. Pertumbuhan MESNA-aktif, R2 terpotong dan ligasi ke F n Y-22mer (s), Langkah 35-50.

Material

Reagen

  • Perhatikan bahwa semua bahan kimia yang dibeli harus memiliki grade tertinggi yang tersedia dari vendor yang ditunjukkan. Lebih jauh lagi adalah praktik umum untuk memahami sifat-sifat dan potensi bahaya dari masing-masing bahan kimia yang digunakan - ini dapat diperoleh dari lembar data keselamatan bahan (misalnya, //hazard.com/msds).

  • Tyrosine phenol lyase (TPL): ekspresi dan pemurnian TPL dari pTZTPL plasmid telah dilaporkan sebelumnya 32, 33, 34

  • Ammonium asetat (Sigma-Aldrich)

  • Asam piruvat (Sigma-Aldrich)

  • Pyridoxal-5′-phosphate (PLP) (Sigma-Aldrich)

    Kritis

    • PLP harus disimpan kering dalam gelap di −20 ° C.

  • (Fluoro) n fenol ( n = 1-4) (Sigma-Aldrich)

  • Ninhydrin (Sigma-Aldrich)

  • n -butanol (Sigma-Aldrich)

  • Celite 545 (Sigma-Aldrich)

  • β-Mercaptoethanol (βME) (Mallinckrodt)

  • Etil asetat (Mallinckrodt)

    Peringatan

    Etil asetat mudah terbakar - jauhkan dari sumber api.

  • Asam asetat (Mallinckrodt)

    Peringatan

    Asam asetat bersifat korosif.

  • Sodium chloride (NaCl) (Mallinckrodt)

  • Solusi HCl (∼ 6 N)

  • Resin hidrogen penukar kation, AG50W-X8, 50-100 mesh (Bio-Rad)

  • 10% (v / v) larutan amonium hidroksida

  • Sodium karbonat (Na 2 CO 3 ) (Sigma-Aldrich)

  • 9-fluorenylmethyl N -succinimidyl carbonate (Fmoc-OSu) (Sigma-Aldrich)

    Kritis

    • Fmoc-OSu harus disimpan kering pada suhu -20 ° C.

  • Dioxane (Sigma-Aldrich)

  • Diisopropyl ethylamine (DIPEA) (Sigma-Aldrich)

  • Dimethyl formamide (DMF) (Sigma-Aldrich)

    Peringatan

    DMF mudah terbakar dan iritasi yang kuat.

  • Piperidine (Sigma-Aldrich)

    Peringatan

    Piperidine adalah mutagen dan racun reproduksi.

  • Asam Trifluoroacetic (TFA) (Sigma-Aldrich)

    Peringatan

    TFA sangat korosif.

  • Triisopropyl silane (TIS) (Sigma-Aldrich)

  • α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHA) dan matrix desisted / ionization time of flight (MALDI TOF) standar penerbangan: angiotensin, peptida sintetik P14R, fragmen hormon adrenokortikotropik dan insulin rantai B teroksidasi (Sigma-Aldrich)

  • Kloroform (CHCl 3 ) (Mallinckrodt)

    Peringatan

    CHCl 3 adalah racun reproduksi dan kemungkinan karsinogen manusia.

  • Methanol (Mallinckrodt)

    Peringatan

    Metanol sangat mudah terbakar dan menyebabkan iritasi.

  • Acetonitrile (MeCN) (Mallinckrodt)

    Peringatan

    MeCN mudah terbakar dan mungkin mutagen.

  • Diklorometana (CH 2 Cl 2 ) (Mallinckrodt)

    Peringatan

    CH 2 Cl 2 adalah karsinogen potensial.

  • Dietil eter (Mallinckrodt)

    Peringatan

    Dietil eter bersifat iritan dan mudah terbakar.

  • Magnesium sulfat (MgSO 4 ) (Mallinckrodt)

  • NaCl (Mallinckrodt)

  • Ammonium bikarbonat (NH 4 HCO 3 ) (Mallinckrodt)

  • Potassium phosphate (KPi) (Mallinckrodt)

  • Silica gel 60 (ukuran partikel 0, 04-0, 063 mm, 230–400 mesh) (EMD Bioscience)

  • O - (7-azabenzotriazole-1-yl) - N , N , N ′, N ′, tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) (Terapan Sistem Bio)

    Kritis

    • HATU harus disimpan kering pada <5 ° C.

  • Fmoc- L -Leu-PEG-PS (0, 2 mmol g -1 ) (BioSystems Terapan)

  • Fmoc-Leu-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Gln (Trt) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Phe-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Asn (Trt) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Ser (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Asp (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Thr (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Val-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Glu (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Asp (OtBu) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Ile-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Gly-OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Asp (OtBu) -Ser (ψ Me, Me pro) -OH (NovaBiochem)

  • Fmoc-Cys ( t Buthio) -OPfp (NovaBiochem)

  • 1-hydroxy-benzotriazole hydrate (HOBt) (NovaBiochem)

  • F n Ys dari langkah sebelumnya

  • BL21-DE3 codon + sel (Stratagene)

  • R2-intein-CBD plasmid 17

  • Luria – Bertani medium (LB) (Becton Dickerson)

  • Isopropyl-β- D-thiogalactopyranoside (IPTG; Promega)

  • DL -Dithiothreitol (DTT) (Promega)

  • MESNA (Sigma-Aldrich)

  • Ampisilin (Amp) (Sigma-Aldrich)

  • Chloramphenicol (Cm) (Sigma-Aldrich)

  • Triton X-100 (Sigma-Aldrich)

  • Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich)

  • Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) (Sigma-Aldrich)

    Peringatan

    PMSF beracun.

  • Glycerol (Sigma-Aldrich)

  • Bradford Reagent (Sigma-Aldrich)

  • Sodium askorbate (Sigma-Aldrich)

  • Besi amonium sulfat heksahidrat (Fe II (NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 ) (Sigma-Aldrich)

  • Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (Sigma-Aldrich)

    Peringatan

    EDTA adalah iritasi.

  • Manik-manik kitin (NEB)

  • 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) (EMD Bioscience)

  • DNase I (dari bovine pankreas) (Roche)

  • Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris base) (Roche)

Peralatan

  • Corong pemisah besar (2 liter)

  • Corong Buchner besar (1 liter)

  • Aduk piring

  • Rotary evaporator

  • Lyophilizer

  • Pelat kromatografi lapis tipis (KLT) - 2, 5 × 7, 5 cm (JT Baker)

  • Pioneer Peptide Synthesizer (Applied Biosystems)

  • Kolom Econo-Pac Frekuensi Pakai (Bio-Rad)

  • Vortexer (Ilmiah Fisher)

  • Sistem HPLC dengan 2487 detektor penyerapan ganda dan 515 pompa HPLC yang berjalan pada perangkat lunak milenium (Waters)

  • Semi-preparatif XTerra MS C 18 5 μm (19 × 100 mm) kolom (Perairan)

  • Analytical Phenomenex C18 5 μm (150 x 4, 6 mm) kolom (Jupiter)

  • 1.000 tabung dialisis cutoff Da (SpectraPor)

  • 50 ml tabung polypropylene Falcon (BD Bioscience)

  • Shaker / inkubator (New Brunswick Scientific)

  • French Pressure Cell Press (Instrumen Sim-Aminco Spectronic)

  • Glove Box (M. Braun)

  • Pengaturan SDS-PAGE (Bio-Rad)

  • Sistem Sprint Biocad FPLC (Biosystems Terapan)

  • Kolom Penukaran Anion MonoQ HR 16/10 (10 μm, 2 × 10, 5 cm, 33 ml) (Amersham Bioscience)

  • Perangkat konsentrasi protein Centriprep (YM-30) (Millipore)

  • Perangkat ultrafiltrasi Amicon (Millipore)

  • YM-30 membran ultrafiltrasi (Millipore)

  • OmniFlex MALDI TOF spektrometer massa dan target yang sesuai (Bruker)

Pengaturan reagen

  • Tes ninhidrin Untuk menguji keberadaan amina bebas, larutan ninhidrin terdiri dari 0, 19% (b / v) ninhidrin, 95% (v / v) n -butanol, 0, 5% (v / v) asam asetat dan 4, 5% (v / v) air harus disiapkan. Untuk melakukan tes ninhidrin, tempatkan setetes larutan ke piring TLC dan biarkan piring mengering. Celupkan pelat TLC ke dalam larutan ninhidrin, lalu panaskan pelat dengan senapan panas selama 10–15 detik. Bintik ungu / merah muda merupakan hasil positif dan menunjukkan adanya fungsi amina gratis.

  • Aktivitas TPL Sebelum sintesis F n Ys, aktivitas TPL yang dimurnikan harus ditentukan dengan metode yang dilaporkan sebelumnya 32, 33 . Satu unit aktivitas TPL (U) didefinisikan sebagai 1 μmol produk per menit. TPL yang dimurnikan di tangan kita memiliki aktivitas spesifik 6-10 U mg −1 .

  • MALDI TOF MS Spektrum massa diperoleh dalam mode negatif menggunakan CHA sebagai matriks. Matriks dibuat dengan menangguhkan 10 mg CHA ke dalam larutan 1 ml 50% (v / v) MeCN dan 0, 1% (v / v) TFA - 1 μl larutan peptida (0, 5-3 mM) kemudian terlihat dengan 1 μl larutan matriks ke target MALDI TOF dan dibiarkan kering selama 0, 5-1 jam sebelum analisis. Spektrometer massa MALDI TOF dikalibrasi dengan campuran angiotensin II (1, 044, 5423 Da), p14 peptida sintetis (1, 531, 8582 Da), fragmen hormon adrenokortikotropik (2, 463, 1989 Da) dan insulin, rantai B teroksidasi (3, 492.6513 Da) dalam mode negatif.

  • Buffer pemurnian Buffer lisis untuk isolasi R2 yang diaktifkan oleh MESNA terdiri dari 30 mM HEPES, 500 mM NaCl dan 0, 1% (b / v) Triton X-100 (pH 7, 6). Sebelum lisis sel, tambahkan buffer lisis dengan 25 U DNase I per gram pasta sel dan 1 mM PMSF. Buffer belahan dada terdiri dari 50 mM HEPES dan 500 mM NaCl (pH 7, 6).

Pengaturan peralatan

  • SPPS Manual Reaksi deblocking dan coupling manual dilakukan pada vortexer yang dilengkapi dengan adaptor yang cocok untuk memegang 50 ml tabung Falcon, yang pada gilirannya memegang kolom Econo-pac fritting.

  • Dialisis anaerob Untuk mempertahankan konsentrasi oksigen yang rendah selama dialisis, buffer digelembungkan dengan gas argon selama 15 menit sebelum pencelupan kantong dialisis dan selanjutnya secara kontinyu. Dialisis anaerobik dilakukan dalam labu Erlenmeyer pada suhu kamar (25 ° C).

  • Pra-ekuilibrasi kolom kitin Total 5 ml resin kitin diperlukan per gram pasta sel basah. Untuk 200 ml resin kitin, kolom dengan dimensi 5 × 10 cm digunakan. Setimbangkan kolom kitin dengan 10 volume kolom (CV) buffer lisis sebelum aplikasi ekstrak kasar. Setelah digunakan, kolom harus dicuci dengan 10 CV air, 5 CV larutan 1% (b / v) SDS diikuti oleh 20 CV air. Resin harus disimpan dalam larutan etanol 20% (v / v) pada suhu 4 ° C.

  • Pemisahan pertukaran anion MonoQ dari campuran ligasi. Kromatografi kolom MonoQ dilakukan pada laju aliran 3 ml min -1 . Kolom diseimbangkan dalam 50 mM Tris, gliserol 5% dan 1 mM DTT, pH 7, 6 (Buffer Q). Setelah dimuat, kolom dicuci selama 2 menit dengan Buffer Q. Protein kemudian dielusi menggunakan gradien linier dari 0 hingga 200 mM NaCl dalam Buffer Q selama 3 menit, diikuti oleh gradien linier dari 200 hingga 440 mM NaCl dalam Buffer Q lebih dari 37 menit. R2 panjang penuh biasanya dielusi pada 360–380 mM NaCl dalam Buffer Q.

Prosedur

Sintesis F n Y (s)

Waktu: 1-4 minggu

  1. Buat larutan 1 liter amonium asetat 30 mM. Tambahkan fluorophenol yang sesuai ke konsentrasi akhir 10 mM. Kemudian, tambahkan asam piruvat dan βME ke konsentrasi akhir masing-masing 60 dan 5 mM.

    Langkah kritis

    • Konsentrasi fluorofenol yang melebihi 10 mM menghasilkan denaturasi enzim. Pastikan bahwa konsentrasi (fluoro) n fenol adalah ≤10 mM.

  2. Sesuaikan pH larutan menjadi 8, 0 dengan amonium hidroksida. Lindungi bejana reaksi dari cahaya dengan membungkusnya dengan aluminium foil, karena kofaktor PLP yang digunakan oleh TPL sensitif terhadap cahaya.

  3. Untuk sintesis semua fluorophenol selain 2, 3, 5, 6-tetrafluorophenol, ikuti opsi A; jika tidak, ikuti petunjuk di opsi B:

    1. Opsi (A)

      1. Tambahkan 30 U TPL dan PLP ke konsentrasi akhir 40 μM.

        Titik jeda

        • Aduk selama 3-4 hari pada suhu kamar.

        Langkah kritis

        • Kapal harus tetap ditutup dengan aluminium foil selama proses ini untuk menghindari degradasi PLP yang disebabkan oleh cahaya.

    2. Opsi (B)

      1. Untuk 2, 3, 5, 6-tetrafluorophenol, tambahkan 300 U TPL dan 40 μM PLP.

        Titik jeda

        • Aduk selama 3-4 minggu. Kapal harus tetap ditutup dengan aluminium foil selama periode ini (lihat di atas). Setiap minggu, tambahkan campuran dengan tambahan 20 U TPL dan 1 mM 2, 3, 5, 6-tetrafluorophenol.

  4. Sebelum prosedur pengerjaan, resin penukar kation perlu disiapkan. Untuk reaksi 1 liter, gunakan 220 ml resin penukar kation dalam kolom dengan dimensi 4 × 17 cm. Resin baru dalam bentuk terprotonasi (bentuk H + ) dapat digunakan setelah dicuci dengan 10 CV air. Setelah setiap aplikasi, resin harus dibersihkan dan dikembalikan ke bentuk terprotonasi. Untuk tujuan ini, instruksi oleh pabrikan harus diikuti.

  5. Setelah selesai pembentukan T-mediated Fn Y, lepaskan aluminium foil dan turunkan pH campuran menjadi 2–3 dengan 6 N HCl. Ini menghasilkan presipitasi TPL.

  6. Siapkan celite pad untuk menghilangkan TPL yang diendapkan: tambahkan bubuk celite dengan ketebalan 2–3 cm dalam corong Buchner 1 liter (frit kasar) yang diletakkan di atas labu sedot samping, yang terhubung ke saluran vakum. Bilas celite pad dengan ∼ 500 ml air, lalu saring campuran melalui pad celite dan kumpulkan filtratnya.

  7. Ekstrak filtrat sekali dengan 0, 5 volume etil asetat; pisahkan kedua lapisan dengan corong pemisah dan buang lapisan etil asetat (lapisan atas). Kumpulkan lapisan air (lapisan bawah), yang berisi F n Y, dalam gelas kimia.

  8. Muat campuran ini ke resin penukar kation yang disiapkan pada Langkah 4 untuk memisahkan F n Y dari sisa asam piruvat, asam asetat, dan PLP. Setelah memuat, cuci kolom dengan 8 CV air.

  9. Elusi F n Y dari kolom dengan ∼ 8 CV larutan amonium hidroksida 10% dan kumpulkan 10 ml fraksi. Kolam fraksi yang memberikan tes ninhidrin positif (lihat SETELAH REAGEN) dan berkonsentrasi hingga 20-30 ml dalam vakum menggunakan evaporator berputar dengan suhu bak air diatur pada 35-40 ° C. Lelofilisasi larutan yang tersisa hingga kering dan simpan pada suhu 4 ° C. Identitas F n Y didasarkan pada sifat UV (Tabel 1) dan spektrum NMR-nya, yang telah dilaporkan sebelumnya 14 .

    Titik jeda

    • F n Ys dapat disimpan dengan aman pada suhu 4 ° C selama beberapa tahun.

Perlindungan Fmoc pada F n Y (s) dan sintesis peptida F n Y-22mer (s)

Waktu: 3 minggu

  1. Penambahan kelompok pelindung Fmoc untuk masing-masing F nY dengan mudah dilakukan pada skala 0, 5-1 mmol 35 . Larutkan F n Y (1 mmol) dalam 3, 4 ml larutan 10% Na 2 CO 3 .

  2. Larutkan Fmoc-OSu (1, 35 mmol) dalam 3, 5 ml dioxane dalam 100 ml labu berbentuk pir yang dilengkapi dengan batang pengaduk. Dinginkan kedua campuran hingga 0–4 ° C baik dengan menginkubasi di atas es atau diaduk di ruangan yang dingin.

  3. Dalam satu langkah, tambahkan larutan F n Y ke campuran Fmoc-OSu sambil diaduk, kemudian biarkan reaksi memanas hingga suhu kamar. Lanjutkan mengaduk campuran pada suhu kamar dan memantau kemajuan reaksi dengan TLC (lihat Tabel 2 untuk fase gerak dan nilai Rf yang sesuai dari masing-masing Fmoc-F n Y-OH). Reaksi selesai ketika intensitas tempat yang sesuai dengan Fmoc-F n Y-OH berhenti meningkat.

  4. Setelah selesai reaksi, biasanya 0, 5-2, 5 jam (substitusi fluorin yang lebih tinggi membutuhkan waktu reaksi yang lebih lama), tambahkan 36 ml air ke reaksi dan ekstrak campuran dua kali dengan 15 ml EtOAc menggunakan corong pemisah untuk menghilangkan Fmoc-OSu yang tidak bereaksi. Buang lapisan EtOAc (lapisan atas).

  5. Turunkan pH fase berair, yang mengandung Fmoc-F n Y-OH, menjadi 2-3 dengan 2 N HCl dan ekstrak produk ke EtOAc ((10 ×, 15 ml). Gabungkan ekstrak EtOAc.

  6. Cuci ekstrak EtOAc dengan larutan NaCl jenuh (3 ×, 4 ml) dan air (2 ×, 4 ml) dan keringkan di atas MgSO 4 : tambahkan ujung spatula MgSO 4 ke ekstrak EtOAc dan aduk labu. MgSO 4 yang menyerap air membentuk rumpun sedangkan MgSO 4 yang kering tetap seperti bubuk. Lanjutkan untuk menambahkan MgSO 4 ke ekstrak EtOAc dengan berputar-putar sampai rumpun MgSO 4 terhidrasi tidak terbentuk lagi dan bubuk MgSO 4 mengendap di bagian bawah labu. Pada titik ini, lepaskan MgSO 4 yang terhidrasi dengan filtrasi vakum. Akhirnya, lepaskan pelarut dalam kondisi vakum (suhu bak air diatur pada 25 ° C).

    Titik jeda

    • Produk dari prosedur ini dapat disimpan pada suhu −20 ° C selama berbulan-bulan.

  7. Purifikasi Fmoc-F n Y-OH dengan kromatografi silika gel (25 g, 1, 5 × 40 cm) menggunakan sistem pelarut pada Tabel 2. Fmoc-F n Y-OH yang dimurnikan dapat digunakan langsung dalam sintesis peptida. Perhatikan bahwa gugus hidroksil dari fluorophenol tidak memerlukan perlindungan.

    Titik jeda

    • Fmoc-F n Y-OH kering yang dimurnikan dapat disimpan pada suhu -20 ° C hingga satu tahun.

  8. 19 residu pertama (H 2 NL 19 VGQID 14 S 13 EVDTDDLSNFQL 1 -COOH) dari F n Y-22mer disiapkan pada synthesizer peptida. Perhatikan bahwa residu 13 (Ser) dan 14 (Asp) ditambahkan sebagai dipeptida pseudo-prolin untuk menghindari agregasi peptida ( vide infra ) 36 . Tiga residu yang tersisa, F n Y 20, S 21 dan C 22, ditambahkan secara manual. Dengan cara ini, seseorang dapat menghasilkan beberapa peptida Fn Y-22mer dari kumpulan peptida 19-mer yang sama. Jika hanya satu F n Ys pada Gambar 2 yang menarik, maka seluruh F n Y-22mer dapat disiapkan pada synthesizer. Karena mode operasi synthesizer peptida bersifat merek dan model, manual instruksi untuk instrumen spesifik harus diikuti. Sintesis peptida membutuhkan dua langkah yang diulang sampai sintesis selesai. Langkah pertama adalah penghilangan gugus pelindung N-Fmoc dan langkah kedua adalah penggabungan dengan asam amino yang dilindungi N-Fmoc berikutnya dalam urutan peptida. Menggunakan synthesizer, kelompok Fmoc dihilangkan dalam DMF yang mengandung 20% ​​(v / v) piperidin dan 0, 1 M HOBt (lihat Gambar. 5 dan langkah kritis di bawah ini untuk tujuan pereaksi ini) selama 10 menit dengan laju aliran instrumen yang telah ditetapkan. Reaksi penggabungan menggunakan 4 ekuivalen asam amino yang dilindungi Fmoc, 3, 6 ekuivalen HATU dan 8 ekuivalen DIPEA relatif terhadap jumlah peptida pada konsentrasi akhir masing-masing 0, 5, 0, 45 dan 1 M, dan dilanjutkan selama 1 jam.

    Langkah kritis

    • Untuk sintesis peptida Fn Y-22mer, penyertaan HOBt dalam campuran deblocking sangat penting untuk menghindari pembentukan aspartimide yang dihasilkan dari urutan reaksi yang ditunjukkan pada Gambar 5. Menghilangkan HOBt selama deblocking dari kelompok Fmoc menghasilkan peptida yang mengandung α- atau β-piperidid. "Produk samping" ini dapat mencapai sebanyak 80% dari total peptida ketika deblocking dilakukan tanpa HOBt 37 .

    Langkah kritis

    • The pseudo-prolin dipeptide, Fmoc-Asp (OtBu) -Ser (ψ Me, Me pro) -OH, sangat penting untuk menghindari agregasi peptida Fn Y-22mer selama sintesis. Peptida Fn Y-22mer sangat rentan terhadap agregasi, yang menghasilkan pengurangan deblocking dan coupling yang dihasilkan secara drastis ketika panjang peptida melebihi 18 residu. The pseudo-prolin dipeptide mencegah agregasi dengan memecah struktur sekunder 36 . Lebih lanjut, gugus pseudo-prolin bersifat labil asam dan menghasilkan residu S 13 dan D 14 yang diinginkan setelah pembelahan peptida yang dimediasi TFA dari resin fase padat ( vide infra ).

    Titik jeda

    • Pada akhir sintesis otomatis peptida 19-mer, peptida yang dilindungi resin yang dilindungi Fmoc dapat disimpan kering pada suhu -80 ° C selama setahun.

  9. Tiga residu berikutnya sekarang dapat digabungkan secara manual. Pindahkan peptida yang terikat resin ke dalam kolom Econo-pac yang tertutup. Kolom-kolom ini ditutup di bagian atas dan bawah selama reaksi. Lepaskan kelompok Fmoc dari ujung terminal N dari peptida yang baru lahir yang terikat resin dengan mengocoknya dalam kolom Econo-pac pada vortexer dengan campuran deblocking yang terdiri dari 20% (v / v) piperidin dan 0, 1 M HOBt dalam DMF untuk 10–12 mnt. Lepaskan tutup bawah dan atas untuk mengalirkan campuran deblocking. Tambahkan campuran deblocking dan vortex baru selama 10-12 menit. Tiriskan solusi deblocking seperti sebelumnya. Gunakan 15 ml larutan deblocking per gram resin.

  10. Setelah deblocking, cuci resin 4-5 kali dengan DMF dengan menambahkan 7-8 ml DMF per gram resin, pusarkan selama ing 1 menit dan tiriskan DMF dari kolom dengan melepas tutup atas dan bawah. Setelah pencucian terakhir, tiupkan gas N 2 melalui kolom untuk menghilangkan sisa DMF sepenuhnya.

  11. Tambahkan residu berikutnya (Fmoc-F n Y-OH) dengan vortexing peptide yang terikat resin selama 1 jam dengan setidaknya 6 ekuivalen asam amino yang dilindungi N-Fmoc, 5, 4 ekuivalen HATU dan 12 ekuivalen DIPEA dalam DMF pada akhirnya konsentrasi masing-masing 0, 5, 0, 45 dan 1 M. Siapkan campuran ini dengan terlebih dahulu melarutkan asam amino yang dilindungi Fmoc dalam volume DMF yang diperlukan, diikuti oleh HATU dan DIPEA. Vortex Vessel selama 10-15 detik untuk melarutkan komponen sepenuhnya; kemudian tambahkan ini ke peptida yang terikat resin di kolom Econo-pac. (Misalnya, campuran 2, 5-3 ml DMF dengan asam amino yang dilindungi Fmoc, HATU dan DIPEA pada konsentrasi akhir masing-masing 0, 5, 0, 45 dan 1 M, ditambahkan ke 1 g peptida yang terikat resin.) Vortex the campur pada suhu kamar selama 1 jam, lalu cuci peptida yang terikat resin 2-3 kali dengan DMF seperti pada Langkah 19.

  12. Ulangi Langkah 18-20 untuk asam amino ke-21 dalam urutan (Fmoc-Ser (OtBu) -OH). Kemudian, hilangkan kelompok pelindung Fmoc dari asam amino ke-21 seperti yang dijelaskan dalam Langkah 18 dan 19.

  13. Tambahkan residu N-terminal Cys dalam bentuk pentafluorophenol yang diaktifkan dan t dilindungi Buthio. Kopling residu ini membutuhkan vorteks dengan 6 ekuivalen Fmoc-Cys ( t Buthio) -OPfp dan 6 ekuivalen HOBt relatif terhadap peptida pada konsentrasi akhir masing-masing 0, 5 M selama 1, 5 jam. Cuci resin 2–3 kali dengan DMF seperti dijelaskan pada Langkah 19 dan deblock kelompok pelindung Fmoc seperti dijelaskan dalam Langkah 18 dan 19.

    Langkah kritis

    • Residu Cys memiliki kecenderungan untuk rasemat ketika digabungkan menggunakan DIPEA 38 . Untuk menghindari rasisasi Cys, residu C-terminal N digabungkan sebagai ester OPfp yang diaktifkan yang meniadakan kebutuhan akan suatu pangkalan.

  14. Sebelum pembelahan peptida dari resin, cuci peptida yang terikat resin 2-3 kali dengan CH 2 Cl 2 seperti dijelaskan pada Langkah 19 untuk pencucian DMF. Kemudian, tutup kolom Econo-Pac di bagian atas, tetapi tidak di bagian bawah, dan hubungkan bagian bawah kolom ke garis vakum. Tarik ruang hampa selama 5-10 menit untuk mengeringkan resin sepenuhnya.

  15. Bersihkan peptida dari resin dengan mengocok resin dengan larutan yang terdiri dari 95% TFA, 2, 5% TIS dan 2, 5% air selama 4 jam. Gunakan 25 ml larutan pembelahan per gram resin.

  16. Setelah 4 jam, larutan TFA akan mengandung peptida bebas. Kuras larutan ini ke dalam tabung Falcon 50 ml dan cuci resin 2-3 kali dengan TFA volume kecil. Gabungkan mencuci TFA dengan larutan pembelahan.

  17. Berkonsentrasi peptida dengan meniup N 2 (g) di atas larutan sampai terjadi pengendapan. Pada titik ini, tambahkan 8-10 volume dietil eter dingin dan inkubasi campuran pada suhu 4 ° C selama ∼ 45 menit.

  18. Kumpulkan peptida dengan sentrifugasi (∼ 5.000 g , 10-15 menit, 4 ° C) dan buang supernatan. Cuci peptida satu kali dengan dietil eter dingin dengan menambahkan volume yang sama dari dietil eter dingin seperti pada Langkah 26, inkubasi selama 5 menit pada suhu 4 ° C dan buang eter setelah sentrifugasi. Lepaskan residu eter dalam keadaan vakum atau dengan menempatkan tabung Falcon yang tidak tertutup dalam sungkup pada suhu kamar semalaman.

    Titik jeda

    • Peptida dapat disimpan dalam bentuk ini pada −80 ° C selama satu tahun.

  19. Larutkan peptida dalam 0, 1 M NH 4 HCO 3 (pH 8, 0) hingga konsentrasi ≥0, 3 mM.

    Langkah kritis

    • Karena jumlah besar karboksilat dalam F n Y-22mer (total enam), maka hanya dapat larut dalam kondisi agak basa. Ini tidak biasa karena kebanyakan peptida mudah larut dalam asam.

  20. Pemurnian pada skala semipreparatif dapat dilakukan pada kolom Waters XTerra. Hingga 2 μmol peptida dapat dimuat ke kolom ini per injeksi (loop injeksi 5 ml). Elusi peptida dengan 0, 1 M NH 4 HCO 3 (pH 8, 0) dengan gradien linier 10-20% MeCN selama 5 menit diikuti oleh gradien linier 20-35% MeCN selama 23 menit. Pantau elusi peptida dengan absorbansi pada 215 nm dan pada λ maks spesifik F n Y (Tabel 1). Kumpulkan fraksi yang mengandung peptida, keluarkan MeCN dalam vakum dengan penguapan putar (suhu penangas air diatur pada 25 ° C) dan liofilisasi larutan peptida yang tersisa hingga kering.

  21. Kemurnian peptida dinilai menggunakan HPLC analitik. Gradien linier 10-75% MeCN selama 45 menit versus 0, 1 M NH 4 HCO 3 (pH 8, 0) digunakan untuk mengelusi peptida dari kolom Jupiter Phenomenex. Profil khas ditunjukkan pada Gambar 6.

  22. Dapatkan spektrum UV dan MALDI-TOF MS pada setiap peptida murni untuk memastikan identitasnya. Tabel 1 merangkum maxima serapan dan koefisien kepunahan C- dan N- yang tersumbat secara terminal F n Ys dalam bentuk fenol dan fenolat. Karena tidak ada residu Trp atau Tyr lain dalam urutan peptida, F n Ys sebagian besar bertanggung jawab atas absorbansi di daerah ∼ 270 nm.

  23. Akhirnya, kelompok pelindung Buthio pada residu C-terminal N harus dihilangkan. Untuk menghindari pembentukan ikatan disulfida antar molekul antara dua peptida, pengangkatan kelompok t Buthio dilakukan dalam kondisi anaerob. Pembentukan disulfida lebih lazim dari bentuk tiolat dari residu Cys, terutama hadir karena peptida larut hanya dalam kondisi yang agak basa. Tangguhkan peptida terliofilisasi dalam 0, 1 M NH 4 HCO 3 (aq.) (PH 8, 0) hingga konsentrasi akhir 1–7 mM dan tambahkan 0, 1 volume 250 mM Tris (pH 8, 0). Misalnya, untuk mendeproteksi 5 μmol peptida, tunda dalam larutan 3 ml 0, 1 M NH 4 HCO 3 (pH 8, 0) dan tambahkan 300 μl Tris 250 mM (pH 8, 0). Pindahkan larutan ke dalam labu berbentuk buah pir dan deoksiat pada garis Schlenk dengan bergantian siklus degassing, dengan menarik ruang hampa, diikuti dengan pembacaan ulang gas argon. Diperlukan enam hingga delapan siklus untuk degassing total. Dalam setiap siklus, labu didegradasi dengan menarik ruang hampa selama ∼ 2-5 menit dan kemudian dibilas dengan argon dengan pengadukan selama min 5 menit.

  24. Tambahkan DTT padat ke kelebihan molar 15 kali lipat di atas peptida. Selama penambahan ini, campuran terpapar ke atmosfer secara singkat. Karena itu, degas campuran lagi seperti dijelaskan pada Langkah 32. Aduk campuran reaksi pada suhu kamar selama 4 jam.

  25. Setelah 4 jam, pindahkan campuran reaksi ke kantung dialisis dan panggil secara anaerob (seperti dijelaskan dalam SET PERALATAN) terhadap kalium fosfat 5 mM, pH 6, 0 (1 liter, 2–3 perubahan masing-masing 4 jam). Setelah dialisis, pindahkan larutan peptida ke tabung Falcon, bekukan dan liofilis sampai kering.

    Titik jeda

    • Peptida kering yang dimurnikan dapat disimpan pada suhu -80 ° C selama setahun.

Tabel ukuran penuh

Image

Aspartimid dihasilkan dari kondensasi amida dengan rantai samping residu Asp terdekat, yang dilindungi oleh gugus t- butil. Reaksi piperidin dengan aspartimide selama deblocking Fmoc menghasilkan peptida termodifikasi α- dan β-piperidide. Pembentukan aspartimide dicegah dengan melakukan reaksi deblocking di hadapan HOBt, seperti yang dilaporkan sebelumnya 36 .

Gambar ukuran penuh

Image

Peptida dielusi dengan gradien linier 10-75% MeCN versus 0, 1 M NH 4 HCO 3 (pH 8, 0).

Gambar ukuran penuh

Ligasi F n Y-22mer (s) ke R2 yang diaktifkan MESNA

Waktu: 3-4 minggu

  1. Ubah pR2-intein-CBD 17 menjadi sel-sel kodon + BL21-DE3 menggunakan instruksi yang disediakan oleh pabrikan.

    Langkah kritis

    • Untuk semisintesis R2, kodon Stratagene + baris sel yang kompeten menghasilkan ekspresi, pemurnian, dan konten radikal yang optimal. Perhatikan bahwa tergantung pada asal intein, garis kodon + sel mungkin tidak diperlukan. Untuk menentukan apakah garis sel kodon + diperlukan, penggunaan kodon organisme dari mana intein berasal harus dibandingkan dengan E. coli atau organisme tempat ekspresi dilakukan.

  2. Lakukan pertumbuhan kultur kecil dan besar dengan pengocokan (200 rpm) pada 37 ° C dalam LB yang mengandung Amp (100 μg ml- 1 ) dan Cm (50 μg ml- 1 ). Inokulasikan kultur LB / Amp / Cm 5 ml (dalam tabung kultur bakteri 12 ml) dengan satu koloni yang diperoleh dari transformasi pada Langkah 35.

    Titik jeda

    • Tumbuhkan sel sampai jenuh semalaman (∼ 12 jam).

  3. Encerkan 0, 5 ml kultur kecil jenuh menjadi 100 ml kultur LB / Amp / Cm sedang dalam labu Erlenmeyer 500 ml.

    Titik jeda

    • Tumbuhkan kultur medium ini hingga jenuh dalam semalam (∼ 12 jam).

  4. Akhirnya, inokulasikan kultur besar LB / Amp / Cm 10 liter (kultur 5 × 2 liter dalam labu Erlenmeyer 6 liter) dengan 50 ml kultur medium jenuh, dan lanjutkan pertumbuhan pada suhu 37 ° C.

  5. Ketika OD 600 nm mencapai 0, 7-0, 8 (∼ 4 jam setelah inokulasi), turunkan pengaturan suhu ke 23 ° C. Setelah 15 menit, tambahkan IPTG ke konsentrasi akhir 0, 5 mM dan lanjutkan inkubasi pada suhu 23 ° C selama 5-6 jam tambahan. Pada saat ini, panen sel dengan sentrifugasi (10.000 g , 15 menit, 4 ° C); biasanya hasil 5 g pasta sel basah per liter kultur diperoleh.

    Langkah kritis

    • Chimera R2-intein-CBD tidak dapat larut pada suhu 37 ° C; oleh karena itu, ekspresi harus dilakukan pada 23 ° C. Juga, hubungan thioester dalam R2 terpotong yang diekspresikan tidak stabil bahkan pada -80 ° C. Oleh karena itu, untuk hasil ligasi yang optimal, pemurnian konstruk R2 terpotong harus dilakukan dalam beberapa hari pertumbuhan.

  6. Resuspend setiap gram pasta sel dalam 5 ml buffer lisis yang dilengkapi dengan 1 mM PMSF dan 25 U DNase I. Letakkan sel dalam French Pressure Cell pada 14.000 psi dengan satu bagian. Untuk memastikan zat besi yang cukup untuk perakitan klaster diiron dalam R2, larutkan Fe II (NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2 dan natrium askorbat (5 mg masing-masing per pasta sel gram) dalam ml 10 ml buffer lisis dan tambahkan larutan ini secara bertahap 10 menit ke ekstrak kasar pada suhu 4 ° C sambil diaduk. Kemudian, aduk campuran selama 15 menit tambahan. Akhirnya, singkirkan puing-puing sel dengan sentrifugasi pada suhu 4 ° C (15.000 g , 35 menit).

  7. Kumpulkan supernatan dan muatkan ke kolom kitin yang sudah disetimbangkan sebelumnya (lihat SET PERALATAN) pada laju aliran ∼ 1-3 ml min −1 . Diperlukan total 5 ml resin kitin per gram pasta sel.

  8. Cuci resin dengan 30-40 CV buffer lisis yang mengandung 0, 2 mM PMSF, diikuti oleh 2 CV buffer pembelahan. Kemudian, muat kolom dengan 1, 5 CV buffer pembelahan yang berisi 100 mM MESNA.

    Titik jeda

    • Inkubasi pada suhu 4 ° C selama 30 jam.

    Langkah kritis

    • Efisiensi pembelahan tergantung langsung pada konsentrasi MESNA dan waktu inkubasi. Kami menemukan bahwa inkubasi dengan 100 mM MESNA selama 30 jam menghasilkan pembelahan optimal (5 mg R2 yang diaktifkan MESNA per gram pasta sel) tetapi memberikan Y 122 • konten radikal hanya ∼ 0, 3 per R2. Ini kontras dengan 1, 2 Y 122 • s per R2 yang dihasilkan oleh teknologi rekombinan. Pada gilirannya, inkubasi dengan konsentrasi MESNA rendah dan periode inkubasi yang lebih pendek, masing-masing 50 mM dan 20 jam, menghasilkan efisiensi pembelahan yang rendah (3 mg R2 yang diaktifkan MESNA per gram pasta sel) tetapi kandungan radikal yang lebih tinggi (∼ 0, 45 per R2) .

  9. Setelah 30 jam, mengelusi R2 yang diaktifkan MESNA dari kolom kitin dengan buffer pembelahan. Jumlah protein dipantau menggunakan uji reagen Bradford (lihat instruksi pabrik). Lanjutkan elusi hingga tidak ada lagi protein yang terdeteksi.

    Langkah kritis

    • Jumlah R2 yang diaktifkan MESNA yang dielusi dari kolom tergantung pada konsentrasi MESNA dan periode inkubasi seperti dijelaskan di atas. Hal ini juga tergantung pada residu C-terminal R2 terpotong yang mengandung thioester MESNA (residu 353, yang merupakan valin dalam R2 tipe liar, tetapi glisin di semua konstruksi R2-intein-CBD kami). Rantai samping yang besar pada posisi ini secara sterik menghambat akses molekul tiol kecil ke thioester. Kami telah menentukan efisiensi pembelahan 50%, 15% dan 10%, ketika residu 353 adalah Gly, Ala dan Val, masing-masing. Karena kami membutuhkan 100 mg R2 semisintetik untuk percobaan biofisik yang ingin kami lakukan, semua semisintesis R2 kami dilakukan dengan Gly pada residu 353. Efisiensi pembelahan juga tergantung pada tiol molekul kecil. Idealnya, tiol adalah nukleofil yang baik untuk pembelahan optimal dan kelompok yang baik untuk ligasi optimal ( vide infra ). Kami menemukan MESNA untuk menghasilkan perpecahan gabungan terbaik dan efisiensi ligasi. Meskipun DTT menghasilkan efisiensi pembelahan tertinggi, hasil ligasi buruk. Tiol lain yang diuji adalah βME, ethanethiol, tiofenol dan benzilmerkaptan. Meskipun tiofenol tidak diharapkan menjadi reagen pembelahan yang baik, penggunaannya untuk tujuan ini telah dilaporkan 39 .

  10. Setelah elusi, konsentrasikan R2 yang diaktifkan-MESNA menjadi 20–25 mg ml- 1 menggunakan perangkat konsentrasi Amicon dengan membran YM-30. Kemudian, hapus kelebihan MESNA dari R2 yang diaktifkan MESNA menggunakan kromatografi Sephadex G-25 dalam buffer pembelahan. Karena langkah penghilangan garam ini menghasilkan pengenceran protein, konsentrasikan kembali R2 yang diaktifkan-MESNA menjadi 20–25 mg ml- 1 menggunakan konsentrator protein YM-30 Centriprep.

  11. Degas protein pada garis Schlenk dengan sepuluh siklus vakum degassing selama 5-10 detik diikuti oleh argon fill selama 1 menit dengan pengadukan. Pindahkan sampel protein ke dalam kotak sarung tangan untuk langkah ligasi. Pindahkan peptida terliofilisasi ke kotak sarung tangan juga.

  12. Siapkan reaksi ligasi dengan menambahkan peptida ke konsentrasi akhir 2 mM ke R2 yang diaktivasi oleh MESNA. Kemudian tambahkan 0, 1 volume 1, 5 M HEPES dan 0, 4 mM EDTA (pH 7, 9). Biasanya, reaksi ligasi mengandung, dalam volume akhir 3 ml, 20 mg ml- 1 R2 yang diaktifkan-MESNA (0, 7 umol) dan 2 mM peptida (6 umol).

    Titik jeda

    • Inkubasi campuran reaksi pada suhu 4 ° C dalam kotak sarung tangan selama 36 jam.

    Langkah kritis

    • Perhatikan bahwa pengadukan tidak dianjurkan karena menginduksi presipitasi protein dalam kondisi ini. Alih-alih, aduk perlahan labu 3-4 kali selama masa inkubasi.

    Langkah kritis

    • Seperti dijelaskan pada Langkah 43, tiol molekul pilihan kecil adalah molekul yang menghasilkan pembelahan tinggi dan efisiensi ligasi. Sebelumnya, Kent dan rekan kerjanya melaporkan penggunaan katalis tiol molekul kecil untuk reaksi ligasi. Kami menguji kemampuan thiophenol dan p -nitrothiophenol untuk berfungsi dalam kapasitas ini dengan menggunakan R2 yang diaktifkan MESNA. Namun, kami mengamati tidak ada peningkatan dalam hasil ligasi.

  13. Bagilah igation 3 ml campuran ligasi menjadi 1 ml alikuot dalam 1, 5 ml tabung Eppendorf, flash-freeze dalam cairan N 2 dan simpan pada −80 ° C.

    Titik jeda

    • Campuran ligasi stabil pada -80 ° C selama satu tahun.

  14. Peptida yang tidak bereaksi yang digunakan dalam ligasi sering membentuk jembatan disulfida intermolekul dengan peptida ligated yang menghasilkan R2 panjang penuh (lihat ref. 17) Untuk mengurangi ikatan disulfida ini, cairkan alikuot campuran ligasi dan tambahkan DTT ke konsentrasi akhir dari 5 mM. Inkubasi campuran reaksi pada suhu 4 ° C selama 20 menit. Kemudian singkirkan peptida berlebih dari R2 menggunakan siklus konsentrasi-pengenceran dalam perangkat konsentrator protein centriprep.

    Langkah kritis

    • Penghapusan peptida terikat adventif sangat penting untuk percobaan yang dilakukan dengan R2, karena peptida C-terminal menyediakan situs pengikatan utama untuk interaksi dengan R1. Perhatikan bahwa tergantung pada urutan peptida, itu mungkin tidak dapat dihapus oleh siklus konsentrasi-pengenceran melalui membran-kemungkinan ini perlu diselidiki untuk kepentingan peptida (misalnya, dengan SDS-PAGE non-mengurangi). Jika pemindahan tidak terjadi oleh siklus konsentrasi-pengenceran, maka kromatografi Sephadex G-25 dalam kondisi reduksi dapat digunakan untuk menghilangkan peptida. Selanjutnya, pemurnian berikutnya pada kolom MonoQ (Langkah 49) dilakukan dalam kondisi reduksi untuk memastikan penghapusan peptida terikat adventif.

  15. Suntikkan 10-20 mg reaksi ligasi ke kolom penukar anion MonoQ (loop injeksi 2 ml). Elute R2 dengan gradien NaCl linier - profil elusi tipikal ditunjukkan pada Gambar 7. Karena muatan negatif yang terkait dengan C-terminal 22 asam amino R2, heterodimer dapat dipisahkan dari dua homodimer. Pool fraksi yang diinginkan (sesuai dengan puncak 2 dan 3 pada Gambar. 7), berkonsentrasi ke to 150 μM dan simpan pada −80 ° C. Biasanya, 10 g pasta sel basah menghasilkan 50 mg R2 yang diaktifkan MESNA terpotong, yang setelah ligasi menghasilkan 15-20 mg R2 panjang penuh.

    Titik jeda

    • F n Y-R2 dapat disimpan dengan aman pada suhu −80 ° C selama beberapa tahun.

  16. Mengkarakterisasi R2 semisintesis oleh SDS-PAGE dan ESI-MS dalam mode positif melalui infus langsung (bukan melalui LC-MS). Data MS dapat menetapkan bahwa peptida dari 22 asam amino yang mengandung Fn Y yang menarik telah ditambahkan.

    Penyelesaian masalah

Image

Ligasi yang tidak lengkap mengharuskan pemisahan tiga produk, homodimer terpotong, 1, protein heterodimerik, 2, yang terdiri dari protomer terpotong dan protomer full-length dan homodimer full-length, 3, terdiri dari dua protomer full-length. Pemisahan ini dilakukan dengan menggunakan kolom penukar anion MonoQ yang dielusi dengan gradien linier 0, 2-0, 44 M NaCl selama 37 menit (ref. 17, 18).

Gambar ukuran penuh

Penyelesaian masalah

Saran pemecahan masalah dapat ditemukan pada Tabel 3.

Tabel ukuran penuh

Pengaturan waktu

Waktu untuk penggabungan FnY tunggal ke dalam R2 ditunjukkan di bawah ini. Perhatikan bahwa sintesis F4Y membutuhkan 4 minggu.

Reagent and equipment setup (including expression and purification of TPL): 1 month

Synthesis and purification of an FnY (other than F4Y) in Figure 2: 1 week

Synthesis and purification of Fmoc-FnY and FnY-22mer: 3 weeks

Semisynthesis and purification of FnY-R2: 3–4 weeks

Hasil yang diantisipasi

A typical 1 liter enzymatic synthesis of 3, 5-F 2 Y yields 1.7 g of the desired product (80% yield). Addition of the Fmoc-protecting group by the described procedure yields Fmoc-3, 5-F 2 Y-OH in good yield (85%). The 3, 5-F 2 Y-22mer is synthesized by a combination of automatic and manual SPPS. After purification and deprotection of the t Buthio-protecting group of the N-terminal Cys, 4.5 μmol of 3, 5-F 2 Y-22mer is obtained from a theoretical yield of 6 μmol (75% yield). Ligation of 4.5 μmol of peptide to 45 mg (0.52 μmol) of MESNA-activated, truncated R2 and subsequent purification yields 20 mg (0.23 μmol) of full-length homodimeric 3, 5-F 2 Y-R2. SDS-PAGE and ESI-MS analyses confirm incorporation of 3, 5-F 2 Y.

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.