Dasar struktural dan mekanistik dari transpor ion logam berpasangan proton dalam keluarga slc11 / nramp | komunikasi alam

Dasar struktural dan mekanistik dari transpor ion logam berpasangan proton dalam keluarga slc11 / nramp | komunikasi alam

Anonim

Subjek

  • Transportasi ion
  • Besi
  • Transporter
  • Kristalografi sinar-X

Abstrak

Transporter aktif sekunder dari keluarga SLC11 / NRAMP mengkatalisasi penyerapan besi dan mangan ke dalam sel. Protein-protein ini sangat terkonservasi di semua kerajaan kehidupan dan karenanya memiliki mekanisme transportasi yang sama. Di sini kita menggambarkan sifat struktural dan fungsional dari transporter SLC11 prokariotik EcoDMT. Struktur kristalnya mengungkapkan keadaan yang sebelumnya tidak diketahui dari keluarga protein. Dalam proteoliposom, EcoDMT memediasi serapan mangan proton-coupled pada konsentrasi mikromolar rendah. Mutan residu dalam situs pengikatan ion logam transisi sangat memengaruhi transpor, sedangkan mutasi histidin yang terkonsentrasi yang terletak di dekat situs ini menghasilkan transpor ion logam yang tampaknya tidak berpasangan dengan transpor proton. Dikombinasikan dengan hasil sebelumnya, penelitian kami mendefinisikan perubahan konformasi yang mendasari transpor ion logam transisi dalam keluarga SLC11 dan memberikan wawasan molekuler untuk penggandaannya dengan proton.

pengantar

Logam transisi Fe 2+ dan Mn 2+ adalah elemen jejak penting di semua kerajaan kehidupan. Transpornya melintasi membran seluler dikatalisis oleh anggota pembawa zat terlarut 11 (SLC11) atau keluarga makrofag terkait protein (NRAMP) yang terkait dengan resistensi alami ( 1, 2) . Protein ini sangat kekal dan berfungsi sebagai transporter aktif sekunder 3 . Sementara anggota keluarga dengan buruk membedakan antara ion transisi-logam divalen yang berbeda, mereka secara efisien memilih terhadap Ca 2+ dan Mg 2+, yang keduanya beberapa urutan besarnya lebih berlimpah 4, 5 . Sehubungan dengan fungsi, transporter yang berkarakteristik terbaik adalah SLC11A2 manusia (atau transporter ion logam 1, DMT1) 4, 6 . Protein ini diekspresikan secara luas di berbagai jaringan 4, 7 . Dalam enterosit, terletak di sisi apikal epitel di mana ia memediasi pengambilan Fe 2+ (ref 4, 8). Dalam semua sel lain, DMT1 ditemukan dalam membran intraseluler di mana ia mempromosikan keluarnya Fe2 + endositosis dari endosom ke dalam sitoplasma 9 . DMT1 ditunjukkan untuk mengkatalisasi cotransport dari Fe 2+ dan H + tetapi juga kebocoran yang terpisah dari kedua substrat telah diamati 4, 10 . Anggota keluarga SLC11 prokariotik yang sangat homolog mengangkut Mn 2+ ke sitoplasma 11 . Juga untuk homolog prokariotik, transportasi diusulkan untuk digabungkan ke H + (ref 11, 12, 13, 14, 15). Studi kami sebelumnya pada struktur dan fungsi transporter ion transisi-logam dari Staphylococcus capitis (ScaDMT) telah mengungkapkan arsitektur umum dari keluarga SLC11 / NRAMP dan mereka memberikan wawasan awal ke dalam dasar struktural dari transportasi ion logam transisi selektif 16 . Seperti yang diperkirakan dari analisis urutan 17, lipatan keseluruhan ScaDMT menyerupai protein transpor terkait jauh yang termasuk transporter asam amino LeuT 18 . Struktur menunjukkan konformasi menghadap ke dalam transporter dengan situs yang dapat diakses dari sitoplasma dan yang mengikat ion transisi-logam tetapi tidak kalsium 16 . Uji fungsional dengan protein yang dilarutkan menjadi liposom menggarisbawahi hasil struktural dengan menunjukkan bahwa ScaDMT mengangkut berbagai logam transisi tetapi bukan logam alkali tanah-logam 16 . Meskipun ada kemajuan dalam pemahaman selektivitas ion, sifat-sifat penting dari mekanisme transportasi tetap sulit dipahami. Pertanyaan terbuka yang paling penting menyangkut struktur transporter dalam konformasi yang menghadap ke luar dan apakah, mirip dengan rekan eukariotik mereka, transportasi dalam transporter prokariotik akan digabungkan ke H + . Untuk menyelesaikan pertanyaan ini, kami telah menyelidiki sifat struktural dan fungsional transporter SLC11 dari bakteri Eremococcus coleocola (EcoDMT). Kami telah mengoptimalkan tes transport kami untuk menunjukkan bahwa EcoDMT mengangkut Mn 2+ dengan KM dalam kisaran μM rendah dan bahwa transportasi ion logam digabungkan ke cotransport proton. Dengan menentukan struktur EcoDMT dalam konformasi yang menghadap ke luar, kami menyediakan kerangka kerja yang mendefinisikan perubahan konformasi yang mendasari transportasi oleh mekanisme akses alternatif 19 . Struktur ini juga mengungkapkan lokasi histidin yang, pada mutasi, mencegah H + tetapi tidak pada transportasi Mn 2+ . Sehubungan dengan penelitian sebelumnya, data kami memberikan dasar yang kuat untuk memahami transpor ion logam transisi-proton-digabungkan dalam keluarga SLC11.

Hasil

Properti fungsional EcoDMT

Kami telah mengidentifikasi EcoDMT dari layar lebar yang dijelaskan sebelumnya dari homolog prokariotik 16 sebagai protein dengan sifat biokimia yang luar biasa. EcoDMT adalah 511 asam amino panjang dan berbagi identitas urutan 53% dan kesamaan 67% dengan ScaDMT, anggota keluarga prokariotik dari struktur yang dikenal (Tambahan Gambar. 1a). Dibandingkan dengan transporter ini, EcoDMT berisi ekstensi di terminal-C yang mengkodekan untuk helix transmembran 12 tambahan, yang juga ditemukan di semua anggota keluarga eukariotik (Gambar Tambahan 1a, b). Mirip dengan ScaDMT, identitas urutannya 30% dengan DMT1 manusia sangat tinggi, yang menggarisbawahi tingkat konservasi yang kuat dalam keluarga ini (Gambar Tambahan 1a). EcoDMT diekspresikan dalam E. coli dan dimurnikan dalam deterjen n -decyl-β-D-maltopyranoside (DM). Seperti ScaDMT, protein adalah monomer dalam larutan (Gambar Tambahan 2a). Ketika dilarutkan ke dalam liposom dan diuji dengan bantuan calcein fluorofor yang sensitif terhadap logam, terperangkap di dalam proteoliposom, protein tersebut memediasi pengangkutan Mn 2+ dengan kinetika yang jauh lebih cepat daripada ScaDMT. Oleh karena itu kami mengasumsikan bahwa EcoDMT akan menjadi kandidat yang ideal untuk mengatasi keterbatasan pengujian yang digunakan untuk ScaDMT yang tidak memungkinkan untuk karakterisasi kuantitatif dari sifat-sifat pengangkutannya. Kami beralasan bahwa keterbatasan sebelumnya adalah karena kebocoran intrinsik proteoliposom untuk proton. Ini kemungkinan disebabkan oleh tingginya rasio protein terhadap lipid, pilihan lipid yang digunakan selama rekonstitusi, dan penggunaan konsentrasi ion tinggi yang sebanding yang diperlukan karena kinetika transportasi yang lambat. Untuk mengatasi keterbatasan ini kami menyelidiki pemulihan EcoDMT dengan lipid yang berbeda pada protein yang lebih rendah dengan rasio lipid 20 dan kami menemukan kondisi di mana kami mendeteksi sedikit aktivitas tanpa adanya ionofor dan peningkatan kuat transportasi Mn 2+, pada penambahan valinomycin, yang menghilangkan potensi membran yang ditetapkan oleh transporter elektrogenik (Gambar Tambahan 2b). Pengujian ini memungkinkan kami untuk mengamati transpor yang sudah pada konsentrasi μM rendah Mn 2+ dengan peningkatan dosis yang bergantung pada aktivitas yang turun pada konsentrasi yang lebih tinggi, seperti yang diharapkan untuk transporter yang mengandung situs yang mengikat substrat (Gbr. 1a, Gambar Tambahan 2c). Ketika diuji pada pH 7.2, transport ion logam jenuh dengan KM sekitar 18 μM (Gbr. 1b), yang berada dalam kisaran yang sama dengan nilai yang diperoleh untuk DMT1 manusia oleh elektrofisiologi 4 dan untuk E. coli MntH menggunakan serapan seluler. pengujian 15 . Aktivitas transportasi adalah Na + independen (Gambar 2d tambahan) tetapi tergantung pada konsentrasi proton. Ini mempercepat pada penurunan pH luar dari 7, 2 ke 6, 2 dan melambat pada peningkatan ke pH 8, 2 (Gbr. 1c). Kami selanjutnya tertarik apakah kami akan melihat pengambilan bergantung H + Mn menjadi proteoliposom yang mengandung EcoDMT, yang akan menjadi indikasi untuk Hn - ditambah kopling Mn 2+ . Oleh karena itu kami memantau penurunan pH dalam liposom dengan fluorophore 9-Amino-6-Chloro-2-Methoxyacridine (ACMA) yang sensitif terhadap pH yang terakumulasi di bagian dalam vesikel berasamkan 21 . Gambar 1d menunjukkan pendinginan ACMA yang bergantung pada waktu yang disebabkan oleh pengangkutan H + yang menyertai masuknya Mn 2+ ke dalam vesikel. Pendinginan tergantung pada gradien ion transisi-logam dengan konsentrasi yang lebih tinggi di luar menunjukkan kinetika yang lebih cepat. Hanya peluruhan dangkal yang diamati dengan tidak adanya Mn 2+, meskipun ada kekuatan pendorong untuk H + yang ditetapkan oleh potensial membran negatif. Untuk menunjukkan bahwa efeknya disebabkan oleh akumulasi H + dan bukan interaksi Mn 2+ dengan ACMA, kami telah memantau transportasi yang sama pada konsentrasi buffer internal yang tinggi, yang mencegah perubahan pH. Di bawah kondisi ini, kami tidak melihat penurunan fluoresensi (Gambar Tambahan 2e). Sebaliknya, adanya EDTA intravesikular, yang memungut Mn 2+ gratis, meningkatkan perubahan fluoresensi (Gambar Tambahan 2e). Dalam percobaan pengasaman kami, ketergantungan Mn 2+ yang nyata bergeser cukup ke konsentrasi yang lebih tinggi dibandingkan dengan eksperimen di mana kami mendeteksi penyerapan ion logam (Gbr. 1a, d). Ini dapat diperkirakan karena adanya penyangga di dalam liposom, yang menurunkan sensitivitas uji. Data kami dengan demikian sangat menyarankan bahwa fungsi EcoDMT sebagai transporter aktif sekunder yang memasangkan transportasi Mn 2+ ke transportasi H + dalam arah yang sama, dengan KM dalam kisaran μM rendah.

Image

( a ) Pengangkutan ion logam. EcoDMT memediasi transportasi Mn 2+ ke dalam proteoliposom yang diuji dengan pendinginan quenching fluorophore calcein yang terperangkap di dalam vesikel. Eksperimen dilakukan pada pH 7, 2. Jejak ditampilkan dalam warna unik dengan konsentrasi luar Mn 2+ (μM) diindikasikan. ( B ) ketergantungan konsentrasi transportasi Mn 2+ . Garis solid menunjukkan kecocokan dengan persamaan Michaelis-Menten dengan KM nyata 18, 2 μM. Poin data mewakili rerata dan sem dari 5-9 ulangan teknis dari dua kelompok proteoliposom yang disiapkan secara independen. ( c ) ketergantungan pH transportasi. Ketergantungan waktu transportasi Mn 2+ pada konsentrasi luar 4, 5 μM. Penambahan valinomycin (Val.) Dan Mn 2+ diindikasikan. Transportasi awalnya diuji pada pH 7, 2 untuk semua kondisi. Setelah dua menit (pH) pH diatur ke nilai yang ditunjukkan dengan penambahan volume ekivalen baik NaOH, air, atau HCl. ( D ) Transportasi proton. Mn 2+ -pengangkutan independen H + ke dalam proteoliposom yang mengandung EcoDMT. Transportasi diuji dengan pendinginan ACMA fluorofor yang bergantung-pH pada pH 7, 2 yang awalnya simetris. Jejak ditampilkan dalam warna unik dengan konsentrasi luar Mn 2+ (μM) diindikasikan.

Gambar ukuran penuh

Struktur EcoDMT dalam konformasi menghadap ke luar

Untuk mendapatkan wawasan baru tentang sifat-sifat struktural anggota keluarga SLC11, kami telah mengkristalisasi EcoDMT dan menentukan strukturnya dengan kristalografi sinar-X pada resolusi 3, 3 Å (Tabel 1). Kristal-kristal tersebut adalah dari grup ruang C2 dan mengandung satu salinan molekul dalam unit asimetris. Semua upaya untuk menggunakan konformasi menghadap ke dalam ScaDMT untuk pentahapan dengan penggantian molekul tidak berhasil, yang menunjukkan bahwa, dalam bentuk kristal ini, EcoDMT menunjukkan perbedaan struktural yang substansial. Kami dengan demikian menumbuhkan kristal dari protein turunan selenomethionine dan memperoleh serangkaian fase awal dari percobaan dispersi anomali multipel tiga panjang gelombang. Setelah peningkatan dengan pelarut rata, fase ini memungkinkan untuk membangun model dan perbaikan (Tabel 1, Gambar Tambahan. 3a-c). Daftar struktur yang benar dikonfirmasi oleh perbedaan anomali kerapatan atom selenium yang menentukan lokasi 14 metionin asli (tidak termasuk dua posisi tidak beraturan di terminal-N) dan tujuh posisi tambahan yang diperoleh dari data yang dikumpulkan dari beberapa mutan titik di mana metionin diperkenalkan di daerah yang tidak memiliki residu ini dalam protein asli (Gambar Tambahan. 3d, e). Sebagian besar struktur, termasuk seluruh bagian yang disisipkan membran, didefinisikan dengan baik dalam kerapatan elektron kecuali untuk 13 residu pada residu N- dan 5 pada terminal-C. Struktur EcoDMT ditunjukkan pada Gambar. 2a. Seperti yang diantisipasi dari urutan, protein terdiri dari 12 heliks transmembran. Terminal helix (α-helix 12) dari EcoDMT, yang tidak ada dalam ScaDMT, terletak di pinggiran protein dan mungkin tidak memainkan peran utama selama transportasi (Gambar 2a). Seperti ScaDMT 16 dan transporter lain yang berbagi lipatan yang sama 18, EcoDMT menampilkan hubungan pseudo-simetris antara dua domain analog struktural yang terdiri dari α-heliks 1–5 dan α-heliks 6-10 (Gbr. 2a, Gambar Tambahan 1b). Kedua domain saling terkait dan disejajarkan dalam orientasi yang berlawanan dalam membran. Heliks 1 dan 6 keduanya dilepas di tengah lipid bilayer dan, seperti yang terungkap dalam struktur ScaDMT 16, residu yang dilestarikan dari wilayah yang dilepas ini merupakan situs pengikatan ion logam transisi (Gbr. 2b). Di situs ini, interaksi ion-protein dibangun dengan oksigen karbonil backbone pada akhir α-helix 6a, dan rantai samping dari aspartat dan asparagin, yang semuanya bertindak sebagai ligan keras yang juga akan cocok untuk koordinasi dari Ca 2+ . Sebaliknya, rantai samping metionin yang juga merupakan bagian dari situs pengikatan bertindak sebagai ligan lunak khusus logam transisi yang tidak cocok untuk koordinasi Ca 2+ 16, 22 (Gambar Tambahan 4a). Kesamaan urutan tinggi dengan ScaDMT memungkinkan untuk perbandingan segmen setara yang dapat diandalkan. Kedua struktur menggambarkan konformasi yang berbeda pada siklus pengangkutan dengan ScaDMT yang mengadopsi kondisi menghadap ke dalam dan EcoDMT menghadap ke luar (Gambar 3a-c, Gambar Tambahan. 4b-d). 305 posisi Cα yang setara dari 11 heliks transmembran yang ditumpangkan dengan simpangan kuadrat akar (RMSD) 3, 3 Å tetapi perbedaan struktural tidak terdistribusi secara merata dan RMSD rata-rata heliks transmembran tunggal berkisar antara 1, 5 hingga 6, 0 Å (Gbr. 3b). Dibandingkan dengan ScaDMT hanya ada perbedaan moderat dalam posisi rantai utama α-heliks 2, 3, 6b, 7, 8, 9 dan setengah terminal-N dari α-helix 4, sedangkan konformasi telah banyak berubah untuk α- heliks 1b dan 10 dan bahkan lebih luas untuk heliks α 5, 6a dan setengah terminal C dari α-helix 4. Perubahan konformasi besar juga diharapkan untuk α-helix 1a, yang, meskipun didefinisikan dengan baik dalam EcoDMT, tidak dapat dikuantifikasi karena tidak adanya dalam struktur ScaDMT. Deviasi terbesar antara kedua struktur menyangkut setengah terminal-C dari α-helix 4 dan α-helix 5 yang keduanya telah bergerak secara hampir bersamaan dengan rotasi seperti engsel di sekitar sumbu yang berjalan dari pusat α-helix 4 hingga akhir α-helix 5 (Gbr. 3d). Dalam transisi dari konformasi ke arah luar ke dalam, gerakan ini membuka celah antara α-heliks 5 dan 7 pada sisi intraseluler, yang diisi oleh pergerakan α-helix 1a pada pembukaan rute akses intraseluler ke situs pengikatan ion (Gbr. 3c, d). Sebaliknya, jalur berair ke sisi ekstraseluler ditutup oleh gerakan besar α-helix 6a dan gerakan α-heliks 1b, 10 yang lebih kecil dan bagian ekstraseluler α-helix 2 (Gbr. 3c, e). Sebagai konsekuensi dari perubahan konformasi yang dijelaskan, akses ke situs pengikatan ion dari sitoplasma yang ditemukan di ScaDMT ditutup dalam struktur EcoDMT sedangkan residu yang membentuk situs pengikatan ion sekarang dapat diakses dari luar melalui rongga berair dengan diameter antara 5 dan 9 Å (Gambar 3c, Gambar Tambahan. 4b – d).

Tabel ukuran penuh

Image

( a ) Presentasi EcoDMT dalam dua orientasi berbeda. Heliks ditampilkan sebagai silinder. Perspektifnya adalah dari dalam membran. Sub-domain N-terminal (mencakup α-heliks 1–5) diwarnai krem, sub-domain C-terminal (mencakup α-heliks 6-12) berwarna biru gelap, α-heliks 11 dan 12 dalam magenta. Kotak abu-abu di panel kanan menunjukkan wilayah yang dilihat di b . ( B ) Representasi pita dari heliks α terputus 1 dan 6. Tampilan kira-kira seperti dalam (panel kanan). Rantai samping residu yang merupakan situs pengikatan ion ditunjukkan sebagai model pengisian ruang. Representasi molekuler pada Gambar 2, 3, 4, 5 disiapkan dengan DINO (//www.dino3d.org/).

Gambar ukuran penuh

Image

( a ) Tampilan stereo dari superposisi EcoDMT dan ScaDMT (PDB ID 5M94). Protein ditampilkan sebagai Cα-traces. Perspektif dan kode warna EcoDMT adalah seperti pada Gambar. 2a (panel kanan). Untuk ScaDMT, domain N-terminal berwarna kuning, domain C-terminal berwarna biru muda dan α-helix 11 berwarna pink. ( B ) RMSD dari posisi Cα dihitung dari superposisi kuadrat terkecil dari daerah setara ScaDMT dan EcoDMT. Nomor residu diplot pada sumbu x. Garis dan angka biru menunjukkan rata-rata untuk setiap segmen transmembran. ( c ) Rongga berair yang mengarah ke situs pengikatan logam EcoDMT (kiri) dan ScaDMT (kanan). Protein diwarnai seperti pada Gambar. 2 dan ditampilkan sebagai pita. Tampilan kira-kira seperti pada panel kiri Gambar 2a. Bagian dari permukaan molekul yang menunjukkan rongga akses ditampilkan sebagai jaring abu-abu padat. Pergerakan dalam transisi ke luar ke dalam yang mengatur pembukaan rongga intraseluler ( d ) dan penutupan rongga ekstraseluler ( e ). Dalam d pandangan adalah dari dalam dan dalam dari sisi ekstraseluler sepanjang sumbu tegak lurus terhadap membran. Bagian dari struktur EcoDMT dan ScaDMT ditampilkan sebagai pita dan diwarnai seperti pada a . Posisi α-helix 1a dalam struktur ScaDMT dimodelkan pada posisi antara berdasarkan wilayah terkait dalam struktur menghadap ke dalam dari LeuT (PDB ID 3TT3) dan vSGLT (PDB ID 3DH4) (Gambar Tambahan 4c).

Gambar ukuran penuh

Sifat fungsional dari mutan situs pengikat ion

Meskipun dalam struktur EcoDMT, residu yang merupakan situs pengikatan ion transisi-logam terpapar ke sisi ekstraseluler, kami tidak mengamati perbedaan anomali kepadatan indikatif untuk ikatan Mn 2+ atau ion logam transisi lainnya dalam rendam atau kristalisasi bersama. percobaan. Ini berbeda dengan afinitas ion yang diharapkan tinggi yang mengikat pada konformasi yang menghadap ke luar dan mungkin terkait dengan pH tinggi larutan kristalisasi kami dan hambatan perubahan konformasi yang diinduksi substrat pada pengikatan ion logam oleh lingkungan kristal. Dibandingkan dengan struktur ScaDMT, dalam struktur EcoDMT, akses ke situs pengikatan ion jauh lebih luas dan jarak antara residu pengoordinasi logam lebih besar (Gambar 4a, Gambar Tambahan. 4e). Khususnya, interaksi ion dengan tulang punggung C-terminus α-helix 6a yang terbentuk dalam struktur ScaDMT hanya dapat dibentuk pada transisi protein menjadi konformasi yang tersumbat substrat (Gbr. 4a, Gambar Tambahan . 4e).

Image

( a ) Akses ke situs pengikatan ion dalam konformasi menghadap ke luar dari EcoDMT (kiri) dan konformasi menghadap ke dalam dari ScaDMT (kanan). Tampilan diputar sekitar 180 ° dibandingkan dengan Gambar. 2b. Bagian α-heliks 1 dan 6 ditampilkan sebagai pita, rantai samping residu yang mengoordinasikan ion sebagai tongkat. Permukaan molekul rongga berair yang mengarah ke situs pengikatan ion ditampilkan sebagai abu-abu mesh. Ion Mn 2+ yang didefinisikan secara kristalografi dalam ScaDMT digambarkan sebagai bola hijau. ( b ) Pengangkutan Mn 2+ ke proteoliposom yang mengandung mutan EcoDMT D51A (kiri), N54A (tengah) dan M234A (kanan). Transport diuji dengan pendinginan quenching fluorophore calcein yang terperangkap di dalam vesikel. Eksperimen dilakukan pada pH 7, 2. ( c ) Mn 2+ -pengangkutan independen H + ke proteoliposom yang mengandung mutan EcoDMT D51A (kiri), N54A (tengah) dan M234A (kanan). Transportasi diuji dengan pendinginan ACMA fluorofor yang bergantung-pH pada pH 7, 2 yang awalnya simetris. Jejak dalam b dan c ditunjukkan dalam warna unik dengan konsentrasi luar Mn 2+ (μM) diindikasikan.

Gambar ukuran penuh

Untuk mengonfirmasi bahwa residu yang sama yang diidentifikasi dalam ScaDMT dan DMT1 manusia (ref. 16) juga menjelaskan pengenalan ion dalam EcoDMT, kami telah mempelajari perilaku transportasi mutan-mutan di lokasi pengikatan dalam pengujian in vitro kami. Untuk tujuan itu, kami telah memurnikan dan menyusun kembali mutan D51A, N54A dan M234A di mana rantai samping residu yang sesuai yang ditemukan berinteraksi dengan ion logam transisi dalam ScaDMT 16 dipotong menjadi alanin (Gambar Tambahan 4f). Dalam ketiga mutan kami telah mengamati perilaku transportasi yang sangat terganggu dengan aktivitas yang sangat berkurang, menunjukkan afinitas menurun untuk substrat (Gambar 4b). Di antara mutan-mutan di lokasi pengikatan, efeknya tampak paling parah pada M234A, yang kami telah mendeteksi transpor residu pada konsentrasi Mn 2+ yang tinggi. Pada langkah selanjutnya, kami tertarik apakah protein dengan sifat pengikatan ion yang terganggu masih akan menunjukkan transpor proton. Dengan demikian kami mengkarakterisasi masuknya H + ke dalam proteoliposom yang mengandung mutan EcoDMT pada konsentrasi hingga 400 μM Mn 2+, kondisi di mana kami mendeteksi aktivitas rendah di M234A dan hampir tidak ada transportasi Mn 2+ di D51A dan N54A. Dalam kasus apa pun, kami tidak mengamati pengasaman lumen vesikel (Gambar 4c), yang diharapkan jika transpor H + dalam EcoDMT digabungkan dengan transpor Mn 2+ . Dengan demikian tampak bahwa pengangkutan proton memerlukan perubahan konformasi dari situs pengikatan ion dan bahwa, melalui mutasi situs ini, kami tidak membuat kebocoran proton yang tidak terpisahkan dari transporter.

Mutasi residu yang terlibat dalam transportasi proton

Karena pengangkutan proton tampaknya digabungkan dengan perubahan konformasi protein, kami berusaha untuk menentukan residu dalam EcoDMT yang dapat berfungsi sebagai akseptor H + untuk proses ini. Kami kemudian menganalisis EcoDMT yang menghadap ke luar dan struktur ScaDMT yang menghadap ke dalam sehubungan dengan residu yang dapat diprotonasikan dan yang telah mengubah aksesibilitasnya ke kedua sisi membran. Dalam analisis ini, kami mengidentifikasi dua kandidat, Glu129 dan His236, yang keduanya terletak di sekitar lokasi pengikatan dan yang sangat dilestarikan dalam keluarga SLC11 (Gambar 5, Gambar Tambahan. 1a). Untuk menyelidiki peran residu ini untuk fungsi, kami telah menyiapkan titik mutan E129Q, E129A dan H236A, menentukan strukturnya dengan kristalografi sinar-X dan menyelidiki sifat transpor Mn 2+ dan H + dengan uji in vitro berbasis fluoresensi kami. Struktur kristal dari ketiga mutan sangat dekat dengan wildtype (WT), mengkonfirmasikan bahwa mutasi masing-masing tidak mengganggu pelipatan (Tambahan Gambar. 5, Tabel 2). Ketika menguji transportasi Mn 2+ ke dalam proteoliposom, ketiga mutan menunjukkan pendinginan yang tergantung dosis dari fluoresensi calcein yang terperangkap di dalam vesikel, sehingga menunjukkan bahwa mereka masih mengangkut ion transisi-logam (Gbr. 6a). Sebuah analisis kinetik mengungkapkan bahwa ketergantungan konsentrasi Mn 2+ dari ketiga mutan mirip dengan WT, sementara aktivitas maksimum menurun pada kedua mutan Glu129 dan berkurang menjadi setengahnya pada H236A. (Gambar 6b, Gambar Tambahan. 5d). Sedangkan untuk WT, transportasi Mn 2+ oleh E129Q dipercepat pada pH yang lebih rendah dan dilemahkan pada pH yang lebih tinggi (Gbr. 6c). Sebaliknya, tidak ada perubahan tergantung pH dalam aktivitas transportasi yang diamati untuk E129A dan H236A (Gambar 6c). Ketika menguji serapan H +, E129Q menunjukkan perubahan bergantung Mn 2+ seperti WT dalam pH intravesikuler, sedangkan tidak ada perubahan pH yang terdeteksi untuk H236A bahkan pada konsentrasi Mn 2+ yang tinggi (Gbr. 6d, e). Berbeda dengan E129Q dan H236A, mutasi E129A menghasilkan konduktansi kebocoran H + yang kuat bahkan tanpa adanya Mn 2+ (Gbr. 6d, e). Pengasaman tidak tergantung pada ion logam dan berproses dengan kinetika yang sama dengan aktivitas maksimal yang diamati untuk E129Q pada konsentrasi Mn 2+ yang tinggi (Gbr. 6d, e).

Image

( a ) Lokasi akseptor proton potensial sehubungan dengan situs pengikatan ion EcoDMT (kiri) dan ScaDMT (kanan). Rantai samping residu pengoordinasi ion ditunjukkan sebagai tongkat, Glu129 dan His236, dua akseptor potensial proton, sebagai model pengisian ruang. ( B ) Lokasi Glu129 dan His236 sehubungan dengan rongga akses substrat berair di EcoDMT (kiri) dan ScaDMT (kanan). Rantai samping residu pengoordinasi ion, dua akseptor potensial proton dan residu asam dan basa terkonsolidasi yang melapisi rongga berair sempit di ScaDMT ditunjukkan sebagai batang. Dalam a dan b, permukaan molekul rongga berair ditunjukkan sebagai abu-abu mesh. Bola hijau sesuai dengan Mn 2+ yang terikat di ScaDMT. Heliks α yang dipilih ditampilkan sebagai pita dan diberi label sesuai.

Gambar ukuran penuh

Tabel ukuran penuh

Image

( a ) Pengangkutan Mn 2+ ke proteoliposom yang mengandung mutan EcoDMT E129Q (kiri), E129A (tengah) dan H236A (kanan). Eksperimen dilakukan pada pH 7, 2. Jejak ditampilkan dalam warna unik dengan konsentrasi luar Mn 2+ (μM) diindikasikan. ( B ) ketergantungan konsentrasi Mn 2+ transportasi dalam mutan E129Q, E129A dan H236A. Garis solid menunjukkan kesesuaian dengan persamaan Michaelis-Menten (E129Q, K M 14, 4 μM, v maks 12, 5 ΔF min −1 ; E129A, K M 24, 4 μM, v maks 12, 2 ΔF min −1 ; H236A, K M 18, 1 μM, v maks 7.4 ΔF min −1 ). WT (KM 18.2 μM, v maks. 15.9 ΔF min −1 ) ditampilkan untuk perbandingan. Poin data mewakili rerata dan sem dari 4–7, 5–10 dan 3–6 ulangan teknis untuk E129Q, E129A dan H236A, masing-masing. ( c ) ketergantungan pH transportasi ke proteoliposom yang mengandung mutan E129Q (kiri), E129A (tengah) dan H236A (kanan). Percobaan dilakukan seperti yang dijelaskan untuk Gambar. 1c. ( D ) Mn 2+ -pengangkutan independen H + ke proteoliposom yang mengandung mutan E129Q (kiri), E129A (tengah) dan H236A (kanan). Jejak ditampilkan dalam warna unik dengan konsentrasi luar Mn 2+ (μM) diindikasikan. ( e ) Perbandingan pengasaman proteoliposom pada laju transpor Mn 2+ yang serupa. Jejak tanpa Mn 2+ ditampilkan dalam warna hitam. Dalam kasus mutan, jejak merah sesuai dengan konsentrasi Mn 2+ 300 μM, dan dalam kasus WT hingga 100 μM untuk memperhitungkan aktivitas maksimal yang lebih tinggi. Data berasal dari Gambar 1d dan 6d. Panel mutan menunjukkan jejak WT sebagai garis putus-putus untuk perbandingan.

Gambar ukuran penuh

Secara kolektif, hasil kami pada karakterisasi mutan dari dua residu terionisasi yang dikonservasi dekat dengan situs pengikatan substrat telah mengungkapkan peran mereka yang berbeda dalam pengangkutan ion logam berpasangan proton. Sedangkan mutasi glutamat menjadi alanin telah menyebabkan kebocoran H + yang kuat yang tidak dapat dipisahkan bahkan tanpa adanya ion logam, mutasi konservatif dari residu yang sama dengan glutamin, sehingga menghilangkan kemampuannya untuk menerima dan melepaskan proton, memiliki sedikit pengaruh pada perilaku fungsional, dengan demikian menunjukkan bahwa residu ini tidak berfungsi sebagai reseptor H + primer. Sebaliknya, mutasi histidin yang dilestarikan pada α-helix 6b ke alanin mengganggu sambungan Mn 2+ ke H + tanpa menciptakan kebocoran yang tidak terpisahkan, yang menyiratkan bahwa residu ini kemungkinan memainkan peran sentral dalam transportasi H + .

Diskusi

Dalam penelitian ini, kami telah mengkarakterisasi sifat struktural dan fungsional dari transporter SLC11 prokariotik EcoDMT. Dikombinasikan dengan pekerjaan kami sebelumnya, struktur kristalnya telah menyediakan kerangka kerja yang mendefinisikan transisi konformasi selama pengangkutan ion transisi-logam oleh mekanisme akses-alternatif 19, 23, 24, 25 (Gbr. 7a, Film Tambahan 1). Struktur ScaDMT yang ditentukan sebelumnya telah mengungkapkan konformasi menghadap ke dalam dengan situs pengikatan substrat yang dapat diakses dari sisi intraseluler 16 . Struktur keadaan berwawasan lingkungan dari EcoDMT sekarang telah mengungkapkan titik akhir yang berlawanan dalam siklus transportasi. Bersama-sama, kedua struktur memungkinkan perbandingan dengan transporter lain yang berbagi lipatan yang sama. Sekarang, struktur beberapa pengangkut tersebut untuk asam amino 18, 26, 27, 28, 29, 30, neurotransmitter 31, 32, gula 33 dan senyawa lain 34, 35, 36, 37, 38 telah ditentukan. Demi kejelasan, analisis berikut ini berfokus pada perbandingan dengan LeuT transporter asam amino, yang konformasi multipelnya diketahui 18, 26 (Gambar Tambahan 6a, b) dan yang merupakan salah satu homolog struktural terdekat dari SLC11 keluarga 16 . Dengan kurang dari 14% residu identik (ditentukan dalam keberpihakan berpasangan), tidak ada hubungan urutan yang jelas antara kedua protein. RMSD antara atom Cα ekuivalen (mencakup 241 posisi dan tidak termasuk α-heliks 12, yang berada dalam konformasi berbeda) dari EcoDMT dan konformasi menghadap ke luar dari LeuT (PDB ID 5JAE), adalah 3, 5 Å (Gambar Tambahan 6c). Nilai yang sesuai dengan konformasi menghadap ke dalam (PDB ID 3TT3) dari 5, 1 Å jelas menggarisbawahi kesetaraan struktural EcoDMT ke keadaan menghadap ke luar. Sebaliknya, 224 posisi Cα dari konformasi menghadap ke dalam ScaDMT dan LeuT superimpose dengan RMSD 3, 9 Å (Gambar Tambahan 6d). Nilai RMSD yang relatif tinggi antara keadaan yang sesuai dari dua transporter SLC11 dan LeuT menekankan perbedaan struktural yang signifikan antara kedua keluarga protein. Namun demikian, kedua transporter mengalami perubahan konformasi yang sama (Gambar 3a dan 7a, Gambar Tambahan 6a). Ini diilustrasikan dalam analisis RMSDs dari posisi tunggal antara dua keadaan masing-masing transporter (Gambar 3b, Gambar Tambahan. 6b). Dalam kedua kasus, daerah-daerah tertentu dari molekul mengalami pergerakan besar sedangkan yang lain pada dasarnya invarian. Dalam LeuT bagian invarian struktur disebut domain perancah dan mereka ditugaskan untuk heliks α 3, 4, 8 dan 9, sedangkan heliks α 1, 2, 5, 6 dan 7 merupakan domain inti bergerak 26 . Secara umum, pola yang sama juga ditemukan untuk transporter SLC11, meskipun ada perbedaan ketika membandingkan tingkat pergerakan. Dibandingkan dengan LeuT, perubahan konformasi pada bagian terminal-C dari α-helix 4 dan α-helix 5, yang, bersama dengan pergerakan α-helix 1a, mengontrol akses ke situs pengikatan intraseluler, tampaknya secara signifikan lebih besar dalam transporter SLC11 (Gbr. 3a, b, Gambar tambahan. 6a, b). Gerakan ini melibatkan kekusutan di pusat α-helix 4 yang tidak diamati pada LeuT (Gambar 3a, d, Gambar Tambahan. 6a). Demikian pula, pergerakan α-helix 6a, yang menutup akses ekstraseluler ke situs pengikatan, lebih besar dibandingkan dengan LeuT, sedangkan perubahan konformasi α-helix 1b lebih kecil (Gambar 3b, e, Gambar Tambahan 6b). Perbedaan struktural ini telah memengaruhi bentuk kantong berair yang mengarah ke situs pengikatan pengangkut SLC11. Sedangkan akses ke situs pengikat media di LeuT di masing-masing negara diberikan melalui jalur berair tunggal berbentuk corong, kesetaraannya dalam pengangkut SLC11 bercabang dan lebih sempit dalam satu arah, sejalan dengan ukuran yang lebih kecil dari media yang diangkut. (Gambar Tambahan 7a).

Image

( a ) Penggambaran skematis tentang mekanisme akses alternatif dalam transporter SLC11. Heliks yang dipilih ditampilkan, dan bagian yang bergerak diberi label. Engsel dan arah gerakan ditunjukkan sebagai lingkaran dan panah. Jalur akses berair ditunjukkan dengan warna biru muda. ( B ) Mekanisme potensial dari H + -coupled Mn 2+ cotransport. Untuk situs pengikatan ion logam hanya aspartat koordinator yang digambarkan. Dalam keadaan menghadap ke luar (kiri) histidin yang dikonservasi bertindak sebagai akseptor proton. Setelah transisi ke keadaan menghadap ke dalam (kanan), ion Mn 2+ keluar melalui jalur berair utama. Proton dapat dilepaskan melalui jalur yang sama seperti Mn 2+ atau melalui rongga berair sempit yang dibatasi oleh residu asam dan basa yang dilestarikan. Pengangkutan H + yang tidak terpisahkan pada DMT1 manusia dan pada mutan EDM9A juga dapat terjadi melalui rongga berair yang sempit ini.

Gambar ukuran penuh

Tidak seperti kebanyakan transporter yang berbagi lipatan yang sama yang berfungsi sebagai symporter yang dipasangkan dengan Na + 18, 32, 33, 34, 36, 39, transport dalam keluarga SLC11 digerakkan oleh cotransport H +, dengan stoikiometri yang mungkin dari satu proton per divalen. ion logam 4 . Kopling ke H + menyediakan sumber energi untuk transportasi aktif di lingkungan yang berbeda seperti membran plasma dan membran organel intraseluler. Meskipun mereka berlimpah dalam organisme pro dan eukariotik, mekanisme transporter yang dipasangkan proton sampai saat ini masih kurang dipahami. Dalam penelitian kami, kami telah menunjukkan bahwa transportasi ion logam di EcoDMT digabungkan ke H + (Gbr. 1d). Kami mengamati transpor H + bahkan pada pH 7.2 di mana transpor ion logam transisi divalen yang tidak diusulkan diusulkan untuk hDMT1 (ref. 10). Karena pengujian kami tidak memungkinkan kami untuk menyelidiki transpor H + pada pH yang lebih rendah, kami tidak dapat mengecualikan kemungkinan kebocoran yang tidak dapat dipisahkan pada konsentrasi proton yang lebih tinggi. Untuk mendapatkan wawasan yang lebih dalam tentang mekanisme transportasi, kami tertarik untuk menentukan dengan tepat residu yang akan terlibat dalam penggabungan H + . Eksperimen mutagenesis kami yang melibatkan residu dari situs pengikatan ion logam menunjukkan bahwa pengasaman tidak terdeteksi dalam mutan di mana afinitas yang menurun untuk substrat mencegah transpor yang efisien, dan kami dengan demikian menyimpulkan bahwa transpor H + terhubung dengan perubahan dalam akses substrat. - wilayah yang mengikat. Kami mempertimbangkan pengamatan ini ketika memilih residu yang dapat bertindak sebagai akseptor proton selama transportasi. Tidak ada kandidat yang cocok ditemukan di daerah yang sesuai dengan dua situs pengikatan Na + yang ditemukan di LeuT 18 atau pengangkut terkait lainnya 33, 36 (Gambar Tambahan 7a, b). Demikian pula, daerah di sekitar asam amino basa yang diusulkan untuk memainkan peran dalam transpor proton dalam transporter AgcT 27 yang diperkirakan H + tidak mengandung residu yang dapat menerima dan melepaskan proton (Gambar Tambahan 7d). Sebaliknya, kami menemukan dua residu protonatable, Glu129 dan His236, yang terletak dekat dengan situs pengikatan dan yang mengubah akses mereka ke kedua sisi membran dari konformasi ke luar ke menghadap ke dalam (Gbr. 5). Kedua residu sangat kekal dalam keluarga (Gambar Tambahan 1a). Sedangkan pKa dari rantai samping histidin berada dalam kisaran yang sesuai untuk menerima dan melepaskan H + pada pH yang sedikit asam, pKa dari Glu129 harus digeser ke atas. Dalam konformasi yang menghadap ke luar, Glu129 terletak dekat dengan permukaan rongga substrat berair di sekitar Asp51 (Gbr. 5a, b). Kami menduga bahwa interaksi elektrostatik dengan residu situs ikatan bermuatan negatif dapat menstabilkan keadaan terprotonasinya dan pada gilirannya menempatkan Asp51 untuk berinteraksi dengan ion logam transisi. Namun, kami tidak mendeteksi perilaku yang berubah dalam percobaan transportasi dari mutan E129Q konservatif, karena mutan mengangkut Mn 2+ dan H + dengan sifat yang sama seperti WT (Gambar 6a-d). Ini menunjukkan bahwa Glu129 bukan akseptor H + utama selama transportasi. Namun, karena pada pH yang lebih rendah, mutasi yang sesuai dari homolog E. coli MntH sangat menurunkan tingkat serapan Mn 2+ ke dalam sel 40, residu ini mungkin memainkan peran penting untuk fungsi protein.

Berbeda dengan E129Q, mutasi His236 menampilkan fenotip yang berubah, yang dapat dijelaskan oleh peran dalam menerima dan melepaskan proton selama transportasi. H236A mutan menunjukkan serapan Mn 2+ yang kuat tetapi tidak ada kopling yang dapat dideteksi ke H + (Gbr. 6a, d). Namun, karena aktivitas maksimal yang lebih rendah dan sensitivitas yang lebih rendah dari uji transpor H + kami, kami tidak dapat mengecualikan kemungkinan transpor residu H + yang mungkin lolos dari deteksi kami. Hebatnya, His236 sebelumnya ditugaskan peran potensial dalam kopel proton dan ketergantungan pH transportasi pada DMT1 manusia (ref. 41), sedangkan efek yang lebih kecil pada mutasi residu ini diamati dalam penelitian lain dari protein yang sama 10 dan untuk MntH 14, 15, 42 .

Dalam struktur menghadap ke luar dari EcoDMT, His236 terletak dekat dengan permukaan jalur berair yang mengarah ke situs pengikatan ion logam transisi dan dalam struktur menghadap ke dalam ScaDMT ditempatkan di persimpangan dua proton intraseluler potensial. jalur keluar (Gbr. 5a, b). Dalam konformasi terakhir, His236 berada di satu sisi terkena jalur pelepasan ion logam yang luas ke arah dalam protein. Sepanjang jalur ini, ini berada di dekat His241, histidin kedua yang dilestarikan ditempatkan di α-helix 6b, yang terlibat untuk berperan dalam transportasi dalam anggota keluarga yang berbeda 10 . Di arah lain, itu menghadapi kantong sempit, mungkin berisi air yang telah dapat diakses karena pergerakan Glu129 menjauh dari situs pengikatan ion logam (Gbr. 5b). Kantung ini dilapisi oleh interaksi residu asam yang terletak pada α-helix 3 (dalam EcoDMT Glu119, Asp126, Glu129) dan residu dasar pada α-helix 9 (Arg368, Arg369, Arg373) (Gbr. 5b). Sebagian besar residu ini (kecuali Arg369) dikonservasi antara anggota keluarga, sedangkan wilayah ekuivalen di LeuT dan transporter yang terhubung dengan Na + lainnya sebagian besar adalah hidrofobik (Gambar Tambahan 7e). Menariknya, Arg416 pada DMT1 manusia, yang sesuai dengan Arg373 dalam EcoDMT, ditemukan bermutasi pada pasien dengan anemia berat 43, 44 . Karena residu yang dapat diionisasi yang dijelaskan menjembatani His236 ke permukaan intraseluler molekul, mereka adalah konstituen potensial dari jalur keluar H + (Gbr. 5b). Wilayah yang sama juga dapat melakukan kebocoran yang tidak terpisahkan dengan tidak adanya Mn 2+ yang diamati pada DMT1 manusia (ref. 10) dan pada mutan EcoDMT E129A, di mana pemindahan rantai samping mungkin telah membuka jalur konduksi proton yang tidak lagi membutuhkan perubahan konformasi transporter.

Dengan demikian, kita berakhir dengan dua skenario yang mungkin untuk transpor ion logam transisi-berpasangan H + dalam keluarga SLC11 yang diilustrasikan pada Gambar 7b. Dalam kedua kasus, His236 bertindak sebagai akseptor utama untuk proton dalam keadaan luar. Setelah transisi ke keadaan menghadap ke dalam, proton dilepaskan baik melalui jalur keluar ion logam utama atau terowongan samping yang lebih kecil yang keduanya terhubung ke sitoplasma. Karena konservasi yang kuat, kami menganggap bahwa mekanisme ini dibagikan oleh anggota keluarga SLC11 lainnya. Terlepas dari bukti kuat untuk peran His236 sebagai akseptor selama transportasi proton, ada pertanyaan terbuka lebih lanjut. Saat ini tidak jelas bagaimana protonasi His236 akan memfasilitasi pengikatan transisi-logam ion divalen atau sebaliknya dan bagaimana protein transit antara negara-negara yang berlawanan, terutama karena rantai samping bermuatan positif harus melintasi membran tanpa stabilisasi dengan dekat. oleh balasan negatif. Singkatnya, studi kami tentang EcoDMT telah memperdalam pemahaman kami tentang transisi - transportasi ion logam dalam keluarga SLC11 dan mereka telah memberikan wawasan penting ke dalam penggandengan ke proton. Pemahaman penuh dari proses ini akan membutuhkan penyelidikan lebih lanjut yang kami miliki di sini menyediakan fondasi struktural dan fungsional.

Metode

Ekspresi dan pemurnian protein

Pengkodean gen untuk transporter ion logam divalen dari bakteri Eremococcus coleocola (EcoDMT; pengidentifikasi UniProtKB E4KPW4) diamplifikasi dari DNA genomiknya dan dikloning ke dalam L-arabinose-inducible express vector pBXC3GH dengan kloning-pertukaran (FX) kloning 45 . Mutasi titik diperkenalkan oleh mutagenesis diarahkan-situs (Tabel Tambahan 1). Untuk ekspresi E. coli MC1061 (ref. 46) yang membawa plasmid pBXC3GH-EcoDMT ditanam dengan fermentasi dalam medium Terrific Broth (TB) yang dilengkapi dengan 0, 75% (v / v) gliserol dan 100 μg ml −1 ampisilin. Suhu berangsur-angsur menurun dari 37 menjadi 25 ° C. Pada OD 600 sekitar 2, 5, ekspresi protein diinduksi dengan penambahan 0, 0045% (b / v) L-arabinosa dan dilanjutkan semalam pada suhu 18 ° C. Semua langkah berikut dilakukan pada 4 ° C. Setelah panen dengan sentrifugasi, sel-sel dilisiskan dalam buffer A (50 mM kalium fosfat pH 7, 5, dan 150 mM NaCl) yang mengandung lsozyme 1 μl (w / v) mg 1 μg dan 20 μg ml − 1 DNaseI. Lisat dibersihkan dengan sentrifugasi (10.000 g selama 20 menit) dan membran dipanen dengan ultrasentrifugasi (200.000 g selama 1 jam). Membran disuspensi kembali dalam buffer A yang mengandung 10% (b / v) gliserol dan protein diekstraksi selama 1 jam dengan penambahan 1, 5% (b / v) n -decyl-β-D -maltopyranoside (DM, Anatrace). Bagian yang tidak larut dihilangkan dengan ultrasentrifugasi dan protein terlarut dimurnikan dengan kromatografi afinitas logam imobilisasi (IMAC). Tag GFP-His 10 dihapus dengan inkubasi dengan HRV 3C protease selama 2 jam. Konsentrasi imidazol diturunkan dengan dialisis terhadap 20 mM HEPES pH 7, 5, 150 mM NaCl, 8, 7% (b / v) gliserol, dan 0, 25% (b / v) DM selama pembelahan. GFP yang ditandai dengan Histidin dan protease kemudian dihapus oleh IMAC. Protein yang terpecah terkonsentrasi dan diterapkan pada kolom kromatografi eksklusi ukuran Superdex S200 (GE Healthcare) yang diseimbangkan dalam 10 mM HEPES pH 7, 5, 150 mM NaCl, dan 0, 25% (b / v) DM. Fraksi puncak terkonsentrasi dan digunakan untuk percobaan kristalisasi berikutnya dan rekonstitusi menjadi liposom. WT dan mutan dimurnikan menggunakan prosedur yang sama. Berat molekul EcoDMT ditentukan oleh hamburan cahaya Multi-sudut pada 20 ° C pada HPLC (Agilent 1100) yang terhubung ke sistem Eclipse 3 yang dilengkapi dengan detektor TREOS MAL miniDAWN dan refraktometer Optilab T-rEX (Teknologi Wyatt). Untuk tujuan itu 40 μg WT murni (pada 0, 8 mg ml − 1 ) disuntikkan ke dalam kolom Superdex S200 (GE Healthcare) diseimbangkan dalam 10 mM HEPES pH 7, 5, 150 mM NaCl, dan 0, 25% (b / v) DM. Data dianalisis dengan paket Astra (Astra 6.1, Wyatt Technology).

Ekspresi protein berlabel selenomethionine

Untuk persiapan protein selenomethionine berlabel 16, 47, sel E. coli MC1061 yang membawa plasmid pBXC3GH-EcoDMT yang ditumbuhkan dalam media TB dilarutkan 1: 100 ke dalam media M9 yang dilengkapi dengan elemen jejak, larutan Kao dan Michayluk Vitamin (Sigma), 20 μg ml −1 (b / v) tiamin, 0, 75% (v / v) gliserol dan 100 μg ml − 1 ampisilin. Pertumbuhan dimulai pada 37 ° C dan suhu secara bertahap menurun hingga 25 ° C selama 5 jam gemetar. Untuk menghambat jalur sintesis metionin 47, asam amino L-lisin, L-threonine, dan L -phenylalanine (masing-masing pada konsentrasi 125 mg l- 1 ) dan L -leusin, L -isoleusin dan L -valin (masing-masing pada konsentrasi 62, 5 mg l- 1 ) ditambahkan dan biakan diinkubasi selama satu jam sebelum penambahan 50 mg l- 1 L -selenomethionine. Satu jam kemudian, ekspresi diinduksi dengan penambahan 0, 0045% (b / v) L-arabinosa dan diproses semalaman pada suhu 18 ° C. Sel dipanen, dilisiskan dan ekstraksi dimulai dari lisat yang telah dibersihkan dengan penambahan 1, 5% (b / v) DM pada 4 ° C. Semua langkah pemurnian selanjutnya dilakukan seperti yang dijelaskan untuk protein non-derivatisasi. Penggantian kuantitatif metionin oleh selenomethionine dikonfirmasi oleh spektrometri massa.

Kristalisasi

Kristal EcoDMT WT dan mutan diperoleh dalam tetes duduk pada suhu 4 ° C menggunakan 24-well piring dan larutan reservoir yang mengandung 50 mM Tris-HCl pH 8, 0-9, 0 dan 22-26% PEG 400 (v / v). Percobaan kristalisasi disiapkan dengan mencampur larutan protein 1 μl (pada konsentrasi 7-10 mg ml ml1 ) dan larutan reservoir 1 μl dan tetes kemudian diseimbangkan dengan 500 μl larutan reservoir. Untuk perlindungan cryo, konsentrasi PEG 400 ditingkatkan bertahap menjadi 35% (v / v).

Penentuan struktur

Semua set data dikumpulkan pada kristal beku pada X06SA atau sinar X06DA di Sumber Cahaya Swiss Institut Paul Scherrer pada EIGER X 16M atau detektor PILATUS 6M (Dectris). Data diindeks, diintegrasikan dan diskalakan dengan XDS 48 dan diproses lebih lanjut dengan program CCP4 49 . Fasa diperoleh dari data dispersi anomali dengan panjang gelombang ganda yang dikumpulkan untuk selenomethionine yang diderivatisasi kristal EcoDMT (Tabel 1). Situs selenium diidentifikasi dengan SHELX C dan D 50, 51 . Situs selenium disempurnakan dalam SHARP 52, dan fase ditingkatkan dengan perataan pelarut dengan program DM 53 . Dalam kerapatan elektron yang dihasilkan (Gambar Tambahan 3a), posisi semua heliks transmembran dapat diidentifikasi menggunakan struktur ScaDMT (PDB ID 5M94) sebagai templat dan situs selenium sebagai kendala. Model ini dibangun di COOT 54 dan awalnya disempurnakan dalam Refmac5 menggunakan jelly-body restraints 55 . Pada tahap selanjutnya dari pembangunan model, strukturnya disempurnakan dalam Phenix 56 . Pengekangan fase eksperimental dimasukkan untuk meningkatkan konvergensi. Pekerjaan R dan bebas R dimonitor secara keseluruhan. R gratis dihitung dengan memilih 5% dari data refleksi yang dihilangkan dalam penyempurnaan. Model akhir memiliki nilai R work dan R gratis sebesar 23, 2 dan 27, 7%, geometri yang baik, dengan 95% residu berada di wilayah yang paling disukai dan tidak ada di wilayah yang dilarang di plot Ramachandran (Tabel 1). Rantai polipeptida dari residu 13-506 dapat dilacak dan hampir semua rantai samping dapat diposisikan secara akurat (Gambar Tambahan 3b, c). Daftar yang benar dari urutan asam amino di terminal-N dan antara α-heliks 4 dan 6 dikonfirmasi dalam perbedaan kepadatan anomali yang diperoleh dari data kristal turunan seleno-metionin dari mutan I19M, E27M, W32M, L36M, L154M, V180M dan A195M (Gambar Tambahan 3d, e). Kristal mutan E129Q, E129A, dan H236A disempurnakan dalam Phenix 56 menggunakan struktur modifikasi dari EcoDMT sebagai model awal (Tambahan Gambar. 5). Karena homologi urutan tinggi, struktur EcoDMT telah memungkinkan kami untuk memperbaiki kesalahan lokal dalam struktur ScaDMT. Ini menyangkut konformasi loop yang menghubungkan α-helix 5 dengan α-helix 6a dan α-helix 6b dengan α-helix 7 dan register terminal α-helix 11 (Gambar Tambahan 8). Koreksi tidak mempengaruhi kesimpulan apa pun yang diambil dalam penelitian sebelumnya16. Koordinat terkoreksi dari ScaDMT diperbaiki dan disimpan dengan PDB di bawah kode aksesi (5M94 dan 5M95).

Persiapan proteoliposom

Proteoliposom yang mengandung EcoDMT disiapkan dengan liposom yang tidak stabil 57 . Fosfolipid sintetik yang dilarutkan dalam kloroform (POPE, POPG dari Avanti Polar Lipids) dengan rasio aw / w 3: 1 digunakan sebagai sumber lipid 20 . Lipid dikeringkan, dicuci dengan diethylether dan dikeringkan dengan exsiccation. Lipid kemudian disuspensi kembali dan disonikasi dalam buffer yang mengandung 20 mM HEPES pH 7, 2, dan 100 mM KCl. Vesikel unilamellar besar dibentuk oleh tiga siklus pembekuan diikuti oleh ekstrusi melalui filter polikarbonat 400 nm (Avestin, LiposoFast-Basic). Liposom yang diencerkan (4 mg ml- 1 ) tidak stabil dengan penambahan Triton X-100. Protein murni (dalam DM) diinkubasi dengan liposom yang tidak stabil pada rasio protein terhadap lipid 1: 100 (b / b). Deterjen telah dihapus dengan penambahan Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad) selama tiga hari. Proteoliposom dipanen dengan sentrifugasi, diresuspensi dalam buffer yang mengandung 10 mM HEPES pH 7, 2, dan 100 mM KCl dan disimpan dalam nitrogen cair. Semua percobaan transportasi dilakukan dengan proteoliposom dilarutkan pada rasio protein terhadap lipid 1: 100 (b / b).

Uji transportasi Mn 2+ berbasis fluoresensi

Untuk tes transportasi Mn 2+, proteoliposom di resuspended dalam buffer B yang mengandung 20 mM HEPES pH 7, 2, 100 mM KCl dan 250 μM calcein (Invitrogen). Sampel dibekukan dalam nitrogen cair dan dicairkan pada 25 ° C tiga kali sebelum ekstrusi melalui filter polikarbonat 400 nm (Avestin, LiposoFast-Basic). Proteoliposom dipanen dengan sentrifugasi dan dicuci dua kali dengan resuspensi dalam 20 volume buffer B tanpa Calcein. Kontrol liposom tanpa protein disiapkan dengan cara yang sama (Gambar 2c). Untuk pengukuran, sampel diencerkan menjadi 0, 25 mg lipid ml- 1 dalam buffer yang mengandung 20 mM HEPES pH 7, 2 dan 100 mM NaCl. Untuk setiap konsentrasi Mn 2+, alikuot 100 μl ditempatkan dalam pelat hitam 96-sumur. Transport diinisialisasi dengan penambahan MnCl 2 dan valinomycin (konsentrasi akhir 100 nM, Sigma-Aldrich) dan fluoresensi dicatat dalam interval 4 detik dalam fluorimeter (Tecan Infinite M1000; eksitasi pada 492 nm, emisi pada 518 nm). Setelah 10 menit, ion Mn 2+ diseimbangkan dengan penambahan penukar kalsium Mn 2+ -H + (konsentrasi akhir 100 nM, Invitrogen). Gradien pH dibentuk dengan menambahkan HCl atau NaOH ke larutan luar untuk mencapai konsentrasi proton yang diinginkan. Laju transpor awal (minF min −1 ) dihitung dengan melakukan regresi linier pada data transpor antara 30 dan 90 detik setelah penambahan valinomisin dan MnCl 2 . Data yang dihasilkan dipasang ke persamaan Michaelis-Menten. Data kinetik WT dan semua mutan yang dijelaskan dalam penelitian ini dikonfirmasi dengan setidaknya dua pemulihan independen.

Uji transportasi H + berbasis fluoresensi

Untuk uji transpor H +, proteoliposom dicampur dengan buffer yang mengandung 6 mM HEPES pH 7, 2, 100 mM KCl dan 50 μM ACMA (Invitrogen) kecuali dinyatakan sebaliknya (Gambar Tambahan 2e). Suspensi keruh disonikasi sampai diklarifikasi. Kontrol liposom tanpa protein disiapkan menggunakan prosedur yang sama (Gambar 2e). Untuk pengukuran, sampel diencerkan menjadi 0, 15 mg lipid ml- 1 dalam buffer yang mengandung 6 mM HEPES pH 7, 2, 100 mM NaCl (menghasilkan konsentrasi ACMA akhir 0, 5 pM). Untuk setiap konsentrasi Mn 2+, alikuot 100 μl ditempatkan dalam plat hitam 96 sumur. Transport diinisialisasi dengan penambahan MnCl 2 dan valinomycin (konsentrasi akhir 4 nM, SigmaAldrich) dan fluoresensi dicatat dalam interval 4 detik dalam fluorimeter (Tecan Infinite M1000; eksitasi pada 412 nm, emisi pada 482 nm).

Ketersediaan data

Koordinat dan faktor struktur untuk EcoDMT dan mutan E129Q, E129A dan H236A telah disimpan di Protein Data Bank dengan kode aksesi 5M87, 5M8K, 5M8A, dan 5M8J. Koordinat ScaDMT dan ScaDMT-Mn 2+ yang telah dikoreksi telah disimpan di Protein Data Bank dengan kode aksesi 5M94 dan 5M95. Semua data yang tersisa yang mendukung temuan penelitian ini dapat diperoleh dari penulis terkait berdasarkan permintaan yang masuk akal. Urutan EcoDMT, ScaDMT dan manusia DMT1 (pengidentifikasi UniprotKB E4KPW4, A0A178L6Y2-1, P49281-2) dan kode aksesi PDB ID ID 3TT3 (LeuT, menghadap ke dalam), 5JAE (LeuT, menghadap ke luar), 3F3E (LeuT, keluar ke luar), 3GI8 (APCT), 3DH4 (vSGLT), 4WGV (ScaDMT) dan 4WGW (ScaDMT-Mn 2+ complex) digunakan dalam penelitian ini.

Informasi tambahan

Cara mengutip artikel ini: Ehrnstorfer, IA et al . Dasar struktural dan mekanistik dari transpor ion logam berpasangan proton dalam keluarga SLC11 / NRAMP. Nat. Komunal. 8, 14033 doi: 10.1038 / ncomms14033 (2017).

Catatan penerbit: Springer Nature tetap netral sehubungan dengan klaim yurisdiksi dalam peta yang diterbitkan dan afiliasi kelembagaan.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Informasi tambahan

    Angka Tambahan, Tabel Tambahan.

  2. 2.

    File Tinjauan Sebaya

Video

  1. 1.

    Film Tambahan 1

    Transisi dari konformasi menghadap ke luar menghadap ke dalam transporter SLC11. Film ini menunjukkan morf antara bagian-bagian yang dilestarikan dari struktur EcoDMT dan ScaDMT. Posisi α-helix 1a dari ScaDMT dimodelkan seperti yang dijelaskan dalam Gambar Tambahan. 4c. Pengodean dan tampilan warna seperti pada Gambar. 2a.

Komentar

Dengan mengirimkan komentar Anda setuju untuk mematuhi Ketentuan dan Pedoman Komunitas kami. Jika Anda menemukan sesuatu yang kasar atau yang tidak mematuhi persyaratan atau pedoman kami, harap tandai sebagai tidak pantas.