Trinucleotide repeat ekspansi yang dikatalisis oleh ekstrak bebas sel manusia | penelitian sel

Trinucleotide repeat ekspansi yang dikatalisis oleh ekstrak bebas sel manusia | penelitian sel

Anonim

Subjek

  • Sel biologi
  • Kerusakan dan perbaikan DNA
  • Mutagenesis
  • Kelainan saraf

Abstrak

Ekspansi berulang nukleotida menyebabkan 17 kelainan neurologis manusia yang diturunkan. Pada beberapa penyakit, ekspansi somatik terjadi pada jaringan non-proliferasi seperti otak di mana replikasi DNA terbatas. Temuan ini merangsang minat yang signifikan dalam mekanisme ekspansi replikasi-independen. Perbaikan DNA yang menyimpang mungkin merupakan sumber, sebagian berdasarkan pada studi tikus yang menunjukkan bahwa ekspansi somatik dipicu oleh protein perbaikan DNA MutSβ (kompleks Msh2-Msh3). Studi biokimia sampai saat ini menggunakan ekstrak bebas sel atau protein perbaikan DNA murni untuk menghasilkan reaksi parsial pada pengulangan triplet. Temuan termasuk ekspansi pada satu untai tetapi tidak pada yang lain, atau pemrosesan struktur jepit rambut DNA yang dianggap sebagai perantara penting dalam proses ekspansi. Namun, sulit untuk merekapitulasi ekspansi lengkap in vitro , dan peran biokimia MutSβ tetap kontroversial. Di sini, kami menggunakan novel in vitro assay untuk menunjukkan bahwa ekstrak bebas sel manusia mengkatalisasi ekspansi dan kontraksi trinukleotida berulang tanpa persyaratan untuk replikasi DNA. Ekstrak mempromosikan berbagai ukuran ekspansi yang mirip dengan penyakit tertentu, dan panjang ulangan tiga kali lipat dan urutan mengatur ekspansi in vitro seperti in vivo . MutSβ menstimulasi ekspansi dalam ekstrak, konsisten dengan perbaikan menyimpang kerusakan DNA endogen sebagai sumber ekspansi. Secara keseluruhan, sistem biokimiawi ini mempertahankan karakteristik kunci ekspansi somatik pada manusia dan tikus, menunjukkan bahwa proses mutagenik yang penting ini dapat dipulihkan dalam tabung reaksi.

pengantar

Ekspansi Trinucleotide repeat (TNR) menyebabkan setidaknya 17 penyakit neurologis yang diturunkan, termasuk penyakit Huntington (HD) dan distrofi miotonik tipe 1 (DM1). Secara umum diterima bahwa TNR berkontribusi pada ekspansi sendiri melalui kecenderungan untuk membentuk struktur non-B-DNA seperti jepit rambut dan selot, yang muncul selama replikasi menyimpang atau kesalahan perbaikan kerusakan 1, 2, 3 . Jepit rambut / selot ini kemungkinan merupakan prekursor mutagenik untuk ekspansi itu sendiri. Dengan demikian, protein seluler yang membantu menciptakan jepit rambut / slipout atau memprosesnya lebih lanjut diharapkan menjadi komponen kunci dari proses ekspansi 1, 2, 3 . Protein pengakuan ketidakcocokan MutSβ diidentifikasi sebagai salah satu faktor penyebab penting untuk ekspansi pada model tikus HD atau DM1. Sebagian besar ekspansi, baik yang diwariskan dan somatik, diblokir oleh sistem gugur dari Msh2 atau Msh3 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, yang menyandikan dua subunit MutSβ. Bukti ini mendukung hipotesis bahwa kesalahan perbaikan kerusakan DNA adalah salah satu sumber penting ekspansi, terutama untuk kejadian somatik pada jaringan non-proliferasi di mana replikasi terbatas.

Studi biokimia ekspansi sebagian besar berfokus pada reaksi parsial. Dalam satu pendekatan 11, 12, pengulangan CAG yang mengandung lesi 8-okso-guanin diobati dengan glikosilase Ogg1 murni dan endonuklease apurinic untuk menghilangkan kerusakan dan meninggalkan celah satu-nukleotida. Perbaikan sintesis dengan DNA polimerase β dan flap endonuklease murni membuat pengulangan CAG berlebih, sehingga memperluas untai DNA yang rusak. Perluasan untai CTG yang tidak rusak tidak didokumentasikan, meskipun diusulkan untuk terjadi melalui peristiwa salah pasang berikutnya 11 . Pendekatan lain 13, 14, 15, 16, 17 dimulai dengan jepit rambut CTG preformed atau CAG slipout dan memantau pemrosesan mereka dalam ekstrak bebas sel. Dalam beberapa kasus, kelebihan pengulangan tepat dipotong dan diperbaiki, konsisten dengan pencegahan ekspansi. Substrat lain baik tidak diperbaiki atau salah diperbaiki untuk memberikan produk mempertahankan pengulangan ekstra pada satu untai. Pendekatan ketiga menggunakan ekstrak sel manusia untuk mendorong replikasi templat plasmid DNA SV40 dengan (CAG • CTG) 79 berulang 18 . Beberapa ekspansi besar dalam DNA yang direplikasi dapat dibedakan dari peristiwa latar belakang. Para penulis menyarankan bahwa replikasi membantu menciptakan perantara mutagenik yang kemudian entah bagaimana tidak diperbaiki untuk memberikan ekspansi 18 . Biokimia MutSβ sehubungan dengan ekspansi telah diperiksa karena hasil genetik yang dikutip di atas. MutSβ mengikat jepit rambut CAG 9, 19 dan diperlukan untuk perbaikan slipout pendek 16, tetapi peran biokimia MutSβ dalam ekspansi tetap kontroversial 9, 19, 20, 21 .

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk membangun sistem in vitro untuk menghasilkan proses ekspansi lengkap. Seperti dijelaskan di bawah ini, ekstrak bebas sel manusia mengkatalisasi ekspansi dengan cara yang konsisten dengan karakteristik genetik kunci dari penelitian in vivo pada manusia dan tikus, termasuk stimulasi ekspansi mutasi MutSβ. Sistem ekstrak ini memberikan kemampuan untuk menilai secara langsung peran replikasi, perbaikan, dan transkripsi DNA dalam mendorong ekspansi.

Hasil

Ekspansi terjadi secara in vitro

Tujuan kami adalah merekapitulasi reaksi ekspansi lengkap secara in vitro . Suatu sistem baru yang bebas sel tetapi sederhana yang menghasilkan ekspansi telah dikembangkan. Plasmid 22-ulang diinkubasi dengan ekstrak sel manusia untuk menghasilkan ekspansi dalam tabung reaksi. Ekspansi dideteksi setelah pemulihan DNA dan transformasi menjadi ragi (Gambar 1A). Kontrol sampel tanpa ekstrak menunjukkan tingkat latar belakang ekspansi, seperti yang timbul dari ekspansi yang sudah ada sebelumnya dalam persiapan substrat atau ekspansi setelah transformasi menjadi ragi. Sebagian besar eksperimen menggunakan ekstrak HeLa, yang mendukung banyak proses metabolisme DNA secara in vitro , seperti replikasi, perbaikan, dan transkripsi. Selain itu, penggunaan HeLa memungkinkan perbandingan dengan studi sebelumnya tentang pengolahan jepit rambut TNR in vitro 13, 14, 15, 16, 17 . Menggunakan ragi sebagai biosensor meningkatkan sensitivitas untuk mendeteksi ekspansi dibandingkan dengan sebagian besar metode biokimia. Pengujian ini juga kuantitatif, dan PCR digunakan untuk memverifikasi ekspansi dan untuk mengukur ukurannya. Uji resistensi obat digunakan untuk mendeteksi ekspansi TNR hingga panjang akhir ≥ 26 berulang 22 (Gambar 1B). Substrat plasmid dapat menerima penyisipan panjang dan urutan TNR yang berbeda (Gambar 1C). Selain itu, plasmid mengandung asal replikasi DNA SV40 (ori + ) atau tidak (ori - ) untuk menilai apakah replikasi diperlukan untuk ekspansi yang diamati (Gambar 1C). Ekstrak dapat ditambahkan sesuai keinginan dengan antigen T besar (Tag) SV40. Eksperimen dengan ori - plasmid dan penghilangan Tag karenanya menghalangi hampir semua replikasi DNA.

Image

Fitur utama dari uji in vitro untuk ekspansi. (A) Prosedur pengujian. Vektor ulang-alik 22-ulang diinkubasi dengan ekstrak bebas sel, kemudian pulih dan diubah menjadi ragi. Plasmid yang mengandung resistansi canavanine berulang yang diperluas (≥ 26). Wilayah berulang diperkuat oleh PCR dan ekspansi dikonfirmasi pada gel poliakrilamida. (B) Pilihan ekspansi 22 . Pada 22 pengulangan, CAN1 diekspresikan, menyebabkan sensitivitas kanavanin. Ekspansi menambahkan ≥ 4 pengulangan menyebabkan perubahan di situs awal transkripsi, sehingga kodon inisiator out-of-frame dimasukkan ke dalam mRNA. Terjemahan dari kodon inisiator ini adalah out-of-frame sehubungan dengan gen struktural CAN1 , menyebabkan resistensi canavanine 22 . (C) Antar-jemput vektor. Plasmid didasarkan pada yang digunakan oleh Claassen dan Lahue 35, dimodifikasi dengan kaset pilihan CAN1 22 . Secara singkat, setiap plasmid adalah vektor antar-jemput tiga arah yang mampu direplikasi dalam Saccharomyces cerevisiae , E. coli , dan sel manusia atau ekstrak sel bebas yang dilengkapi dengan antigen T besar SV40. TNR biasanya (CTG) 22, meskipun urutan lainnya dapat diganti. P, adh1 promotor untuk ekspresi dalam ragi.

Gambar ukuran penuh

Jika ekspansi dihasilkan secara in vitro , mereka harus terakumulasi dalam cara yang tergantung pada ekstrak. Ekspansi jelas meningkat dengan penambahan ekstrak sel utuh HeLa (Gambar 2A). Sebagian besar ekspansi, biasanya 80% atau lebih, bergantung pada ekstrak dibandingkan dengan kontrol tanpa ekstrak. Reaksi ini cukup efektif, mengkatalisasi ekspansi pada frekuensi yang mendekati 1%. Ekspansi tidak membutuhkan replikasi DNA; secara tak terduga, lebih banyak ekspansi diamati ketika replikasi diblokir (–Tag, ori - ) daripada ketika diizinkan (+ Tag, ori + ; Gambar 2A). Ada tren atipikal pada Gambar 2A menuju ekspansi lebih ketika replikasi diblokir; dalam kebanyakan percobaan tidak ada efek negatif atau positif dari replikasi pada frekuensi ekspansi (lihat di bawah). Ekspansi juga tergantung pada waktu reaksi (Gambar 2B), konsisten dengan prediksi bahwa ekstrak memproses lebih banyak molekul DNA dari waktu ke waktu dan karenanya harus menghasilkan lebih banyak ekspansi. Untuk mendukung prediksi ini lebih lanjut, ekspansi diperlukan suplementasi reaksi dengan Mg 2+, creatine kinase dan dNTPs (Gambar 2C). Ketergantungan pada dNTP konsisten dengan persyaratan untuk sintesis perbaikan DNA untuk meningkatkan panjang saluran TNR. Ketergantungan parsial pada ATP mungkin karena ATP dari ekstrak atau dari sistem regenerasi. Ekspansi juga terjadi pada tingkat yang sama dalam ekstrak nuklir HeLa, dan mencegah replikasi DNA tidak mengubah frekuensi ekspansi (Gambar 2D). Singkatnya, data ini menunjukkan bahwa ekspansi dikatalisis in vitro oleh ekstrak bebas sel HeLa, tanpa persyaratan yang dapat terdeteksi untuk replikasi DNA.

Image

Perluasan membutuhkan ekstrak, waktu dan kofaktor. Plasmid awal (CTG) 22 diuji di semua panel. (A) Frekuensi ekspansi yang bergantung pada ekstrak untuk ori + dan ori - plasmid diinkubasi dengan ekstrak sel utuh HeLa selama 4 jam. + Tag, dilengkapi dengan 2 μg SV40 antigen T besar. (B) Waktu ekspansi untuk ori + plasmid yang diobati dengan 30 μg ekstrak sel utuh ditambah 2 μg SV40 T-antigen. (C) Persyaratan kofaktor untuk ekspansi ori - plasmid dalam 30 μg ekstrak sel utuh selama 4 jam. CK, creatine kinase. (D) Frekuensi ekspansi untuk ori + dan ori - plasmid dalam ekstrak nuklir HeLa selama 4 jam. Di semua panel, bilah galat ± SEM kecuali panel C, bilah galat = rentang. * P <0, 05 dibandingkan dengan kontrol ekstrak 0 di panel (A dan D), atau dibandingkan dengan kontrol waktu 0 di panel (C) .

Gambar ukuran penuh

Ukuran ekspansi in vitro dan persyaratan urutan untuk menghasilkannya secara akurat mencerminkan ekspansi in vivo

Tes penting dari ekspansi in vitro adalah apakah mereka konsisten dengan karakteristik yang diketahui dari studi genetik. Kami pertama kali memeriksa ukuran ekspansi sebagai salah satu indikator relevansi penyakit. Analisis PCR menunjukkan bahwa ekspansi yang dikatalisis oleh ekstrak terjadi sebagai lompatan daripada keuntungan kecil yang berulang (Gambar 3A). Distribusi ukuran ekspansi dalam ekstrak sel HeLa keseluruhan berkisar dari +4 hingga +18 pengulangan, tanpa perbedaan yang dapat dideteksi terlepas dari apakah replikasi diizinkan atau tidak (Gambar 3B). Ekspansi dikatalisis oleh ekstrak nuklir HeLa memberikan distribusi ukuran yang sama, dengan penambahan satu ekspansi masing-masing +20 dan +21 untuk panjang pengulangan akhir dari 42 dan 43 (Gambar 3C). Hasil lompatan tunggal dan rentang ukuran konsisten dengan ekspansi yang terlihat pada germline pria dari individu HD 23, 24 . Ekspansi terbesar yang terlihat secara in vitro , hingga panjang akhir 40-43 berulang, sesuai dengan alel penyebab penyakit dari sejumlah penyakit poliglutamin termasuk HD 25 dan SCA1 26 . Singkatnya, ekspansi yang terjadi dalam ekstrak bebas sel tumpang tindih dengan yang terlihat pada sejumlah penyakit ekspansi TNR.

Image

Analisis ukuran ekspansi. (A) Gel poliakrilamid representatif yang menunjukkan produk PCR dari pengulangan awal (22 pengulangan; jalur 1), tiga ekspansi yang dikonfirmasi (jalur 2-4) dan satu false positive (jalur 5). Ukuran dinyatakan sebagai panjang TNR. (B) Spektrum ekspansi menunjukkan ukuran pengulangan akhir dari (CTG) 22 ori + dan ori - plasmid dalam ekstrak sel utuh 30 μg. n , 64 untuk + Tag ori + ; 49 untuk −Tag ori - . (C) Ekspansi (CTG) 22 dirawat selama 4 jam dengan ekstrak nuklir HeLa. Spektra dikumpulkan dari eksperimen menggunakan ekstrak 25, 50 atau 100 μg. + Tag, ori +, ekstrak ditambah dengan 2 μg antigen T besar, substrat yang mengandung asal SV40, n = 62; −Tag, ori -, tidak ada antigen T besar yang ditambahkan, substrat tanpa asal SV40, n = 56.

Gambar ukuran penuh

Ekspansi penyebab penyakit pada manusia dan tikus terjadi pada pengulangan CNG, di mana N menunjukkan nukleotida apa pun, dengan satu-satunya pengecualian pengulangan GAA yang tidak stabil dalam ataksia Friedreich 1, 2, 3 . Fitur urutan tambahan yang mendukung ekspansi mencakup pengulangan yang lebih lama dan tidak adanya perubahan pasangan basa dalam traktat ('interupsi'). Kami menggunakan keserbagunaan substrat plasmid kami untuk memeriksa sejauh mana ekspansi in vitro meniru persyaratan urutan in vivo (Gambar 4A). Dibandingkan dengan plasmid referensi (CTG) 22, ekspansi (CAG) 22 substrat dalam kondisi replikasi-permisif terjadi sekitar 30% secara efisien. Dengan demikian pengulangan CTG dan CAG berkembang secara in vitro . Urutan non-struktur-pembentuk (CTA) 22 27 tidak memberikan ekspansi terdeteksi, menunjukkan kapasitas pembentukan-struktur TNR penting untuk reaktivitas. Memperpendek saluran CTG dari 22 menjadi 16 pengulangan mengurangi ekspansi dua pertiga relatif terhadap (CTG) 22 (Gambar 4A) dan juga menunjukkan distribusi ukuran yang lebih terbatas yaitu +6 hingga +14 pengulangan. Dimasukkannya dua gangguan ATG dalam saluran CTG menstabilkan pengulangan ke titik di mana tidak ada ekspansi yang terdeteksi (Gambar 4A). Bersama-sama, analisis ini mendukung hipotesis bahwa unsur-unsur DNA dari TNR mengatur ekspansi yang sama secara in vitro dan in vivo .

Image

Persyaratan DNA dan protein untuk ekspansi. (A) Frekuensi ekspansi untuk substrat plasmid diinkubasi dengan ekstrak sel utuh 30 μg selama 4 jam. Semua plasmid identik kecuali untuk perubahan yang ditunjukkan pada saluran TNR dan ada atau tidak adanya asal SV40. Nilai kontrol ekstrak nol dikurangi. <, batas atas, karena analisis PCR menunjukkan semua positif palsu. * P <0, 05 dengan ekstrak versus ekstrak nol. Rincian tambahan disediakan dalam Informasi tambahan, Tabel S1. (B) Frekuensi ekspansi untuk (CTG) 22 ori + plasmid dengan HCT116 + chr3 ekstrak sel utuh dengan atau tanpa 400 ng MutSβ selama 4 jam. Bilah galat adalah ± 1 SEM; * P <0, 05 versus ekstrak nol. P juga <0, 05 membandingkan ekstrak 40 μg dengan MutSβ hingga 40 μg tanpa MutSβ. (C) Immunoblot untuk Msh3, Msh2 dan aktin (kontrol pemuatan) 30 μg protein dari HeLa, HCT116 atau HCT116 + chr3 ekstrak.

Gambar ukuran penuh

Stimulasi ekspansi in vitro oleh MutSβ

Dalam model mouse HD dan DM1, sebagian besar ekspansi memerlukan keberadaan MutSβ (kompleks Msh2-Msh3) 4, 5, 6, 7, 8, 9 . Untuk menguji apakah MutSβ diperlukan untuk ekspansi in vitro , ekstrak disiapkan dari sel HCT116 manusia yang dilengkapi dengan kromosom 3 ('HCT116 + chr3'). Sel HCT116 rusak pada Mlh1 dan Msh3 28, yang terakhir menyebabkan defisiensi MutSβ. Komplemen yang stabil dengan kromosom 3 mengoreksi cacat MLH1 tetapi tidak MSH3, membuat sel HCT116 + chr3 mahir untuk perbaikan mismatch 28, 29 tetapi masih kurang dalam MutSβ 28 . Analisis Immunoblot (Gambar 4C) memverifikasi bahwa sel HCT116 + chr3 kekurangan Msh3, sedangkan sel HeLa mengekspresikan Msh3. Kedua garis sel mengekspresikan Msh2 pada level yang sama. Ekspansi diukur dalam ekstrak 30-40 μg dari sel HCT116 + chr3, dengan atau tanpa penambahan MutSβ murni (Gambar 4B). Penambahan MutSβ merangsang ekspansi sekitar dua kali lipat, menunjukkan bahwa sekitar setengah dari ekspansi tergantung pada MutSβ dalam kondisi ini. Peningkatan aktivitas ekspansi setelah penambahan MutSβ mencapai signifikansi statistik dengan ekstrak 40 μg. Sepengetahuan kami, ini adalah demonstrasi biokimia pertama yang memfasilitasi ekspansi MutSβ.

Kontraksi pengulangan triplet juga dikatalisis oleh ekstrak bebas sel manusia

Selain ekspansi, triplet berulang pada manusia dan tikus kadang-kadang berkontraksi (memendek). Meskipun jarang terjadi pada kebanyakan keluarga ekspansi TNR, kontraksi adalah mutasi yang bermanfaat yang dapat mengurangi risiko penyakit atau menunda timbulnya 2 . Kami memodifikasi uji in vitro sedikit untuk memulai dengan panjang saluran (CTG) 33 dan (CAG) 33 dan kemudian mengukur kontraksi 5 pengulangan atau lebih (Gambar 5A). Ekstrak sel utuh HeLa juga mengkatalisis kontraksi dari kedua sekuens (Gambar 5B). Frekuensi kontraksi kira-kira dua kali lebih tinggi dari frekuensi ekspansi untuk traktat CTG, dan ∼ 10 kali lebih besar untuk pengulangan CAG (bandingkan Gambar 5B dengan Gambar 2A dan 4A). Frekuensi kontraksi yang lebih tinggi bisa disebabkan oleh saluran awal yang lebih panjang untuk kontraksi daripada ekspansi, 33 berbanding 22 ulangan. Mirip dengan apa yang terlihat untuk ekspansi, mencegah replikasi DNA tidak mengubah frekuensi kontraksi in vitro (Gambar 5B). Hasil yang disajikan di sini menunjukkan bahwa ekstrak bebas sel manusia aktif dalam mengkatalisasi ekspansi dan kontraksi pengulangan triplet.

Image

Kontraksi dikatalisis oleh ekstrak sel HeLa. (A) Tinjauan kontraksi berdasarkan karya yang diterbitkan 34 . Plasmid dengan 33 pengulangan tidak mengekspresikan gen pelapor URA3 karena blok dalam terjemahan (X merah), sehingga sel-sel ragi memerlukan urasil untuk pertumbuhan (Ura - ). Kontraksi TNR menghilangkan 5 atau lebih pengulangan memungkinkan ekspresi URA3 dalam ragi, sehingga memberikan fenotipe Ura + . Analisis PCR berikutnya dari wilayah yang berulang memverifikasi kontraksi. (B) Frekuensi kontraksi (CTG) 33 dan (CAG) 33 ori + plasmid diinkubasi selama 4 jam dengan 30 μg ekstrak HeLa seluruh sel dengan atau tanpa suplementasi dengan 2 μg SV40 T antigen besar. (CTG) 33 hasil berasal dari dua percobaan independen; bar kesalahan menampilkan rentang nilai frekuensi. (CAG) 33 hasil berasal dari tiga percobaan independen; error bar adalah ± SEM, * P <0, 05 versus tanpa kontrol ekstrak.

Gambar ukuran penuh

Diskusi

Sistem biokimia yang dijelaskan di sini mempertahankan karakteristik kunci ekspansi somatik dari jaringan non-proliferasi pada manusia dan tikus. Tidak ada persyaratan untuk replikasi DNA, frekuensi ekspansi diatur oleh panjang, urutan dan kemurnian TNR, ukuran ekspansi tumpang tindih dengan yang terlihat pada penyakit poliglutamin seperti HD, dan MutSβ merangsang ekspansi. Ketidakstabilan yang dimediasi transkripsi tidak mungkin dalam sistem kami karena tidak ada promotor manusia yang jelas dalam substrat plasmid (Gambar 1C), dan penambahan inhibitor transkripsi α-amanitin tidak menunjukkan efek pada frekuensi ekspansi (data tidak ditampilkan). Karena ekspansi adalah replikasi yang independen dan dapat dirangsang oleh MutSβ, kami mendalilkan bahwa ekspansi terjadi melalui kesalahan perbaikan kerusakan DNA endogen dalam sistem ini. Ekstrak bebas sel manusia juga memicu kontraksi dalam cara yang tidak bereplikasi. Mekanisme kontraksi yang paling mungkin juga salah, konsisten dengan pengamatan sebelumnya bahwa kontraksi adalah kejadian in vitro yang paling dominan setelah perbaikan double-strand break dalam CTG • CTG tract 30 .

Sistem ekspansi in vitro ini memiliki sifat kesederhanaan, sensitivitas dan fleksibilitas, tetapi efisiensinya ∼ 1% lebih rendah daripada in vivo . Satu perbedaan utama adalah panjang TNR. Kami mulai dengan 22 pengulangan dan memantau ekspansi yang mendekati dan kadang-kadang melewati ambang batas penting ∼ 30-40 berulang di mana ketidakstabilan menjadi jelas pada manusia 1, 3, 31 dan di mana penyakit seperti HD dan SCA1 pertama kali mengekspresikan fenotipe 25, 26 . Efisiensi ekspansi terlihat in vitro untuk substrat 22-repeat sejalan dengan hasil in vivo . Pada sperma dari orang normal dan HD, ekspansi pertama menjadi jelas untuk memulai alel antara 30 dan 36 pengulangan, dan frekuensi ekspansi melebihi 90% untuk panjang TNR 38-51 pengulangan 23 . Secara keseluruhan, sistem in vitro menghasilkan ekspansi yang mencerminkan mutasi yang memicu penyakit dan pada frekuensi sesuai dengan harapan.

MutSβ menstimulasi ekspansi sekitar dua kali lipat in vitro , menunjukkan bahwa MutSβ berfungsi pada saluran TNR pendek dan panjang ambang. Ini konsisten dengan pekerjaan terbaru dalam astrosit manusia yang dikultur yang menunjukkan bahwa MutSβ mempromosikan sebagian besar ekspansi (CTG) 22 traktat, dan bahwa Msh2 dan Msh3 secara khusus diperkaya di TNR, dibandingkan dengan urutan kontrol acak 32 . Bersama-sama, temuan ini memperluas rentang panjang pengulangan di mana MutSβ merangsang ekspansi hingga 22 pengulangan dalam ekstrak dan kultur sel. Penelitian sebelumnya pada tikus menunjukkan bahwa MutSβ diperlukan untuk sebagian besar ekspansi somatik dan lama dari saluran TNR dari 84 menjadi> 300 unit berulang dengan panjang 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 . Dengan demikian MutSβ mempromosikan ekspansi lebih dari 10 kali lipat dalam panjang yang diulang. Meskipun mekanisme yang tepat dimana fungsi MutSβ masih harus dipecahkan, protein ini menunjukkan efeknya pada kisaran ukuran TNR yang mengesankan.

Informasi tambahan

File PDF

  1. 1.

    Informasi tambahan, Tabel S1

    Data frekuensi ekspansi untuk Gambar 4A

    ( Informasi tambahan terkait dengan versi online makalah di situs web Penelitian Sel .)