Diseksi fungsional in vivo dari peran yang bergantung pada konteks untuk hif1α dalam tumorigenesis pankreas | onkogenesis

Diseksi fungsional in vivo dari peran yang bergantung pada konteks untuk hif1α dalam tumorigenesis pankreas | onkogenesis

Anonim

Subjek

  • Pertumbuhan sel
  • Onkogen

Abstrak

Hypoxia-inducible factor 1α (Hif1α) adalah pengatur utama adaptasi seluler dan kelangsungan hidup dalam kondisi hipoksia. Dalam adenokarsinoma duktal pankreas (PDAC), baru-baru ini ditunjukkan bahwa ablasi genetik Hif1α mempercepat perkembangan tumor dengan mempromosikan peradangan yang mendukung tumor pada tikus, mempertanyakan perannya sebagai target kunci hilir dari banyak sinyal onkogenik dari PDAC. Kemungkinan, Hif1α memiliki peran yang bergantung pada konteks dalam tumorigenesis pankreas. Untuk menganalisis lebih lanjut ini, garis sel PDAC murine dengan ekspresi Hif1α yang berkurang dihasilkan menggunakan transfeksi shRNA. Sel-sel ditransplantasikan menjadi tikus tipe-liar melalui injeksi ortotopik atau portal vena untuk menguji fungsi in vivo Hif1α dalam dua skenario biologis terkait-tumor utama: pertumbuhan tumor primer dan kolonisasi / metastasis jauh. Meskipun Hif1a melindungi sel-sel PDAC dari kematian sel yang diinduksi stres pada kedua skenario - sejalan dengan fungsi umum Hif1a - penipisannya menyebabkan konsekuensi onkogenik yang berbeda. Penipisan Hif1α menghasilkan pertumbuhan tumor yang cepat dengan kematian sel yang diinduksi hipoksia yang ditandai, yang berpotensi menyebabkan respons inflamasi yang berkelanjutan akibat tumor yang persisten. Namun, secara bersamaan mengurangi kolonisasi tumor dan metastasis hati dengan meningkatkan kerentanan terhadap anoikis yang disebabkan oleh kondisi yang tidak tergantung pada penjangkaran. Secara bersama-sama, peran Hif1α dalam tumorigenesis pankreas tergantung pada konteks. Uji klinis inhibitor Hif1α perlu mempertimbangkan hal ini, menargetkan skenario yang sesuai, misalnya terapi paliatif vs adjuvan.

pengantar

Adenokarsinoma duktus pankreas (PDAC) adalah entitas kanker yang menghancurkan yang ditandai dengan hipoksia jaringan. 1, 2 Diaktifkan oleh hipoksia, faktor yang diinduksi hipoksia 1a (Hif1a) adalah efektor hilir utama, yang terlibat dalam berbagai proses seluler yang memediasi sejumlah perubahan adaptif. Perubahan adaptif ini dimaksudkan untuk mengurangi stres seluler yang disebabkan oleh kondisi hipoksia dan untuk meningkatkan kelangsungan hidup sel dalam keadaan fisiologis. 3, 4 Namun, respons ini sering digunakan oleh sel-sel PDAC untuk meningkatkan potensi ganas seperti chemoresistance atau invasi metastasis. 5, 6 Memang, ekspresi tinggi Hif1α adalah prediktor negatif kelangsungan hidup pasien PDAC secara keseluruhan. 7 Selain itu, dalam kondisi normoksik, Hif1α bertindak sebagai target hilir utama dari sejumlah jalur onkogenik yang diduga dari PDAC misalnya mTOR (target mekanis rapamycin). Pensinyalan mTOR hiperaktif dapat menstabilkan Hif1α tanpa adanya hipoksia dan mempromosikan angiogenesis tumor. Secara kolektif, data ini memperdebatkan peran onkogenik Hif1α dalam tumorigenesis pankreas.

Baru-baru ini, gagasan ini telah ditantang oleh sebuah studi provokatif yang menunjukkan bahwa ablasi genetik Hif1α secara signifikan mempercepat perkembangan PDAC pada tikus dengan mempromosikan peradangan penunjang tumor yang dimediasi limfosit B. 9 Crosstalk penting dengan sistem kekebalan menunjuk ke fungsi kompleks Hif1α dalam tumorigenesis pankreas. Dengan demikian, kami berhipotesis bahwa Hif1α mungkin memiliki peran tergantung konteks dalam PDAC. Untuk menguji ini, kami menghasilkan garis sel PDAC murine dengan ekspresi Hif1α yang berkurang dari garis sel yang telah dibuat sebelumnya. 10 Fungsi in vivo dari Hif1α diuji dalam dua skenario biologis yang berhubungan dengan tumor utama: pertumbuhan tumor primer dan kolonisasi / pertumbuhan metastasis.

Hasil dan Diskusi

Sebelumnya, kami mengkarakterisasi sejumlah garis sel PDAC murine dari p48 Cre ; Kras G12D / + ; Tsc1 flox / + mouse. Di antara ini, 399 sel yang ditandai dengan pensinyalan Mek / Erk / mTOR yang hiperaktivasi mengembangkan tumor pada tikus tipe liar (C57BL / 6J) dengan injeksi ortotopik atau portal vena, dan oleh karena itu dipilih untuk penelitian ini. Kami secara stabil mentransfeksi 399 sel dengan kontrol scramble (shControl) atau plasmid pengekspres shRNA spesifik-hif1α (shHif1α). Analisis Western blot mengkonfirmasi pengurangan sekitar 90% ekspresi Hif1α dalam sel shHif1α dibandingkan dengan sel shControl (Gambar 1a). Dibandingkan dengan sel kontrol, sel shHif1α menunjukkan penurunan yang signifikan dalam pengambilan glukosa (diukur dengan tingkat DG6P intraseluler: pengurangan 50%, P = 0, 0005) (Gambar 1b), tingkat glutamat antar sel (penurunan 57%, P = 0, 0481, Gambar 1c ) dan sekresi laktat (reduksi 34%, P <0, 0001, Gambar 1d), yang sejalan dengan pengaruh Hif1α pada metabolisme tumor. Sekresi Vegfa (faktor pertumbuhan endotel vaskular A) -sebuah target hilir Hif1α - juga menurun dalam sel shHif1α (ELISA, pengurangan 67%, P = 0, 0046 Gambar 1e). Downregulation Hif1α tidak berpengaruh pada proliferasi sel in vitro di bawah kondisi yang bergantung pada penjangkaran dalam pengujian formasi koloni (Gambar 1f).

Image

Hif1α diregulasi dalam sel-sel PDAC murine. ( a ) Analisis western blot menunjukkan penurunan regulasi Hif1α dalam sel shHif1α tetapi tidak dalam sel shControl: (kiri) hasil western blot; dan (kanan) pengukuran kuantitatif; shHif1α: transfeksi dengan vektor pengekspresikan shRNA-spesifik Hif1α; shControl: transfeksi dengan vektor kontrol. ( B – d ) Keadaan metabolik sel shControl atau sel shHif1α ditentukan oleh uji serapan glukosa ( b ), uji glutamat ( c ) dan uji sekresi laktat ( d ). ( e ) Sekresi Vegfa antara sel shControl dan shHif1α diukur dengan uji ELISA Vegfa. ( f ) Kapasitas proliferasi sel shControl atau shHif1α ditentukan oleh uji pembentukan koloni. Semua data disajikan sebagai rata-rata ± sem ( n = 3), uji t tidak berpasangan digunakan untuk menguji signifikansi statistik, * P <0, 05. Lihat Bahan dan Metode Tambahan.

Gambar ukuran penuh

Untuk menguji pengaruh penipisan Hif1α pada pertumbuhan tumor primer, kami melakukan injeksi ortotopik menggunakan kontrol dan sel shHif1α. Menariknya, sel shHif1α memunculkan tumor yang secara signifikan lebih besar dibandingkan dengan sel kontrol (Gambar 2a, peningkatan 11, 8 kali lipat, P = 0, 0079). Analisis histologis mengungkapkan bahwa tumor yang berasal dari sel shHif1α lebih nekrotik (Gambar 2b). Memang, analisis kuantitatif mengkonfirmasi bahwa wilayah nekrotik (batas yang ditandai oleh cleaved-caspase 3) lebih jelas pada tumor yang diturunkan sel shHif1α (Gambar 2c, peningkatan 33, 8 kali lipat, P <0, 0001). Sejalan, sel shHif1α lebih rentan terhadap kematian sel yang diinduksi hipoksia in vitro (Gambar 2d, peningkatan 7, 8 kali lipat, P = 0, 0297). Karena tumor yang diturunkan sel shHif1α lebih besar bahkan setelah mengecualikan area nekrotik (Gambar 2c, shCon vs shHif1α: 0, 3 ± 0, 16 vs 0, 7 ± 0, 08 cm 2, P = 0, 0081), kami berhipotesis bahwa pertumbuhan tumor shHif1α disebabkan oleh peningkatan proliferasi . Memang, analisis kuantitatif mengungkapkan bahwa indeks proliferasi di daerah tumor yang layak secara signifikan lebih tinggi pada tumor shHif1α dibandingkan dengan tumor kontrol (perubahan 1, 6 kali lipat, P = 0, 0006) (Gambar 2e).

Image

Penipisan Hif1α mendorong pertumbuhan tumor primer dengan nekrosis jaringan in vivo . ( a ) Eksperimen transplantasi ortotopik menunjukkan volume tumor yang berasal dari shControl dan shHif1α hewan yang disuntikkan sel: (kiri) patologi kotor; dan (kanan) pengukuran kuantitatif. ( b ) Gambar pewarnaan H&E yang representatif menunjukkan daerah nekrotik yang lebih besar pada tumor shHif1α dibandingkan dengan tumor shControl. ( c ) Pewarnaan Immunohistochemistry (IHC) dari cleaved-caspase 3 (kiri) menunjukkan lebih banyak sel apoptosis (tengah) dan area non-nekrosis yang lebih besar (kanan) pada tumor shHif1α dibandingkan dengan tumor shControl. ( d ) Western blot (kiri) dan hasil kuantifikasi (kanan) menunjukkan peningkatan ekspresi clep-caspase 3 dalam sel shHif1α dalam kondisi hipoksia. ( e ) Pewarnaan IHC fosf-histon H3 (pH-H3) dan analisis kuantitatif menunjukkan peningkatan proliferasi pada tumor shHif1α; skala bar, 100 μm. Lihat Bahan dan Metode Tambahan.

Gambar ukuran penuh

Karena peradangan terkait tumor telah terbukti mempengaruhi proliferasi tumor dalam kondisi tertentu, kami berhipotesis bahwa pertumbuhan tumor shHif1α menghasilkan nekrosis yang memicu peningkatan respons peradangan, yang selanjutnya mendukung pertumbuhan tumor yang cepat. Untuk menguji ini, kami mengukur tingkat serum sejumlah penanda inflamasi termasuk serum amiloid A (SAA), Il6 (interleukin 6) dan TNFα (faktor nekrosis tumor α). Kadar SAA dalam serum hewan yang ditransplantasikan sel shHif1α secara signifikan lebih tinggi daripada kontrol (262, 0 ± 12, 01 vs 199, 8 ± 1, 92 μg / ml, P = 0, 0083) (Gambar 3a). Hasil serupa diperoleh ketika kadar serum Il6 (Gambar 3b, 19.0 ± 4.89 vs 5.1 ± 0.94 pg / ml, P = 0.0408) dan TNFα (Gambar 3c, 19.0 ± 2.84 vs 8.7 ± 1.20 pg / ml, P = 0.0191) diukur. Selanjutnya, kami membuat profil infiltrasi sel imun pada shHif1α dan mengontrol tumor yang diturunkan sel dengan pewarnaan sejumlah penanda sel imun termasuk CD45 (sel imun), MPO (myeloperoxidase, neutrofil), CD3 (sel T), B220 (sel B) dan F4 / 80 (makrofag). Analisis ini mengungkapkan bahwa tumor shHif1α lebih padat diinfiltrasi oleh sel imun (terutama di daerah nekrotik) daripada tumor kontrol (perubahan 2, 4 kali lipat, P = 0, 001, Gambar 3d). Analisis selanjutnya mengungkapkan bahwa sel-sel kekebalan ini terutama adalah neutrofil (Gambar 3e, perubahan 7, 6 kali lipat, P = 0, 0009). Namun, infiltrasi sel T berkurang pada tumor shHif1α (Gambar 3f). Tidak ada perbedaan dalam jumlah sel B infiltrasi (Gambar 3g) dan makrofag (Gambar 3h) diamati. Secara bersamaan, hilangnya Hif1α mendorong pertumbuhan tumor primer yang cepat, menghasilkan nekrosis dan memicu inflamasi terkait nekrosis jaringan, yang berpotensi memfasilitasi pertumbuhan tumor lebih lanjut.

Image

Peningkatan respon inflamasi dipicu oleh penipisan Hif1α. ( a – c ) Peningkatan kadar SAA ( a ), Il6 ( b ) dan TNFα ( c ) terdeteksi dalam serum hewan yang ditransplantasikan sel shHif1α dibandingkan dengan kontrol. ( d ) Gambar IHC representatif dari CD45 dan analisis kuantitatif menunjukkan peningkatan infiltrasi sel imun (terutama di area nekrotik) pada tumor shHif1α. ( e ) Representatif gambar IHC MPO dan analisis kuantitatif mengungkapkan bahwa neutrofil adalah sel imun yang paling terinfiltrasi pada tumor shHif1α. ( f ) Pewarnaan IHC dari CD3 dan analisis kuantitatif menunjukkan berkurangnya infiltrasi sel T pada tumor shHif1α, yang dikonfirmasi oleh analisis kuantitatif. Bilah skala, 200 μm. ( g – h ) Gambar IHC representatif dan analisis kuantitatif B220 ( g ) dan F4 / 80 ( h ) tidak menunjukkan perbedaan dalam sel B dan infiltrasi makrofag antara tumor shControl dan shHif1α. Bilah skala, 200 μm. Semua data disajikan sebagai rata-rata ± sem, dan perbedaan statistik ditentukan oleh uji- t tidak berpasangan. * P <0, 05. Lihat Bahan dan Metode Tambahan.

Gambar ukuran penuh

Untuk menguji fungsi Hif1α dalam kolonisasi / metastasis tumor, kami menginokulasi sel shControl dan shHif1α ke dalam vena portal. Di sini, sel shHif1α mengembangkan metastasis hati secara signifikan lebih sedikit daripada sel kontrol (Gambar 4a). Persentase area metastasis di hati (termasuk median, kiri, kanan dan lobus kaudatus) dari hewan yang disuntikkan sel shHif1α adalah 13, 3 kali lipat lebih rendah ( P <0, 0001) dibandingkan dengan sel kontrol (Gambar 4b). Data ini menunjukkan bahwa kemampuan kolonisasi tumor menurun secara dramatis setelah Hif1α knock-down. Karena mampu bertahan di bawah kondisi tanpa penjangkaran adalah langkah awal kolonisasi tumor, kami melakukan uji anoikis untuk menguji hal ini. Sejalan, viabilitas sel shHif1α di bawah kondisi anchorage-independent berkurang secara signifikan dibandingkan dengan sel kontrol (Gambar 4c, pengurangan viabilitas 43%, P <0, 0001). Sesuai dengan data yang dijelaskan di atas, sel-sel PDAC menjadi lebih rentan terhadap kematian sel yang diinduksi-anchorage-independen setelah Hif1α knock-down (Gambar 4d, perubahan 14, 0 kali lipat, P = 0, 0093).

Image

Hilangnya Hif1α merusak metastasis hati dan resistensi terhadap keadaan anoikis. ( a – b ) Representasi gambar pewarnaan H&E ( a ) dan perhitungan area metastasis ( b ) mengungkapkan penurunan fokus metastasis setelah injeksi vena portal sel shHif1α dibandingkan dengan sel shControl. ( c ) Uji Anoikis menunjukkan penurunan kelangsungan hidup sel dalam sel shHif1α di bawah kondisi yang tidak bergantung pada penjangkaran. ( D ) Western blot dan pengukuran kuantitatif menunjukkan ekspresi clepas-caspase 3 dalam sel shControl atau shHif1α di bawah kondisi yang tergantung pada penjangkaran dan tidak tergantung. Data adalah hasil dari tiga percobaan independen. Uji t tidak berpasangan digunakan untuk menentukan signifikansi statistik. * P <0, 05. Lihat Bahan dan Metode Tambahan.

Gambar ukuran penuh

Singkatnya, kami menguji fungsi in vivo Hif1α dalam dua skenario biologis terkait tumor utama: pertumbuhan tumor primer dan kolonisasi jarak jauh. Khususnya, meskipun penipisan Hif1α umumnya membuat sel-sel PDAC lebih rentan terhadap stres (yaitu, hipoksia atau kehilangan kontak sel / ECM) kematian sel, yang sejalan dengan fungsi umum Hif1α, itu mengarah pada konsekuensi onkogenik yang berbeda. Secara khusus, hasil penelitian kami secara parsial mendukung data sebelumnya yang menunjukkan bahwa ablasi genetik Hif1α secara signifikan mempercepat tumorigenesis pankreas yang digerakkan oleh Kras yang berpotensi onkogenik dengan mengaktifkan peradangan yang dimediasi sel-B. Namun, tidak ada perbedaan yang diamati dalam infiltrasi sel-B dalam penelitian ini. Perbedaan ini dapat dikaitkan dengan model tikus yang berbeda (xenograft vs model genetik). Model xenograft yang digunakan tidak memiliki ko-evolusi sel-sel PDAC dan sistem kekebalan tubuh. Dalam model genetik, Hif1α secara bersamaan tidak aktif dalam sel endokrin (misalnya, sel β), yang diketahui menyebabkan resistensi insulin, 12 yang dapat mempengaruhi respon imun selanjutnya. Terlepas dari keterbatasan ini, dua penelitian mengarah pada kesimpulan yang sama bahwa Hif1α sangat penting untuk pertumbuhan tumor dan dalam memodulasi reaksi imunogenik terhadap PDAC.

Mempertimbangkan peran Hif1α yang bergantung pada konteks ini dalam tumorigenesis pankreas, uji klinis inhibitor Hif1α (misalnya, PX-478) dalam PDAC perlu dilakukan dengan hati-hati. 13, 14 Berdasarkan pada crosstalk yang jelas antara Hif1α dan sistem kekebalan, inhibitor Hif1α dapat diuji dalam kombinasi dengan berbagai terapi kekebalan di PDAC (misalnya, inhibitor PD-1 15 ). Di sisi lain, karena Hif1α secara dramatis mempengaruhi kapasitas PDAC dalam kolonisasi / metastasis tumor, Hif1α inhibitor mungkin efektif dalam menargetkan sel kanker yang bersirkulasi. Dalam hal ini, model genetik dan xenograft berguna dalam menguji efektivitas terapi tersebut.

Informasi tambahan

Dokumen Word

  1. 1.

    Metode Tambahan

    Informasi Tambahan menyertai makalah ini di situs Oncogenesis (//www.nature.com/oncsis)